專利名稱：半夏組織培養(yǎng)一步成種法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及半夏組培一步成種法，該技術(shù)屬于生物技術(shù)工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
半夏Pinellia ternata(Thunb. )Breit.屬天南星科多年生草本植物，又叫旱半夏，主要含有生物堿、谷留醇、多糖、氨基酸、揮發(fā)油、半夏蛋白及無機(jī)元素等多種成分， 臨床應(yīng)用非常廣泛，距今已有2000多年的藥用歷史，是一味應(yīng)用十分普及、療效比較確切的常用中藥。半夏野生資源分布較廣，但由于耕作制度的改變和人們的過度采挖導(dǎo)致適宜半夏生長(zhǎng)的生態(tài)環(huán)境逐年縮小，隨著市場(chǎng)需求量的增加和人們對(duì)半夏的應(yīng)用研究不斷深入，其應(yīng)用范圍正在日益擴(kuò)大，市場(chǎng)供應(yīng)一直緊張。為了緩解半夏的供需矛盾，自上世紀(jì)80年代初，我國就開始對(duì)半夏進(jìn)行野生變家種的試驗(yàn)研究，但由于半夏自然繁殖系數(shù)低，人工種植種源嚴(yán)重不足，為此如何解決半夏種源成為亟待解決的問題。植物組織培養(yǎng)再生途徑主要為外植體完全脫分化形成愈傷組織，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化出芽，再將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，但該途徑較繁瑣，種質(zhì)易產(chǎn)生變異，外植體分化塊莖數(shù)也不高，近年來，也有研究人員在某些植物的組織培養(yǎng)上創(chuàng)造出了一步成苗法。而一步成苗法就是外植體在脫分化后，不需要轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上， 而是直接在原培養(yǎng)基上再分化，分化的順序通常是先根后芽，直至形成健壯的全苗。其具有的特征是再生周期短，外植體分化塊莖數(shù)高，易操作，培養(yǎng)程序簡(jiǎn)單，不影響增殖率，能保持原種特性，便于大規(guī)模生產(chǎn)。半夏植株為肉質(zhì)莖的草本植物，研究中發(fā)現(xiàn)半夏一步成苗后在組培苗出瓶、洗脫培養(yǎng)基、移栽的過程中，由于人為操作造成半夏植株很容易被折斷和受創(chuàng)傷，導(dǎo)致部分半夏組培苗的移栽后直接死亡，成活率僅在30% 50%左右，雖然也有部分可在苗基上再次生長(zhǎng)，但是半夏生長(zhǎng)中隨著自然溫度的升高有正常的倒苗現(xiàn)象，生長(zhǎng)周期較短，導(dǎo)致半夏的一代組培種產(chǎn)量極低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。現(xiàn)有專利文獻(xiàn)旱半夏組織培養(yǎng)快速快繁方法(申請(qǐng)?zhí)?00910218386)，包括以下步驟1)配制培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基和其它組培階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含量為基本培養(yǎng)基用MS培養(yǎng)基，附加蔗糖15-45g/L，瓊脂10g/L，調(diào)節(jié)pH5. 8 ；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基=MS 中添加 KTl. 0-3. Omg/L 和 2，4-D1. 0-3. Omg/L ；分化培養(yǎng)基:MS 中添加 KTl. 0-3. Omg/ L和 2，4-Dl. 0-3. Omg/L ；增殖培養(yǎng)基:MS 中添加 ΚΤ0. 2-2. Omg/L和 2，4-D0. 2-2. 0mg/L ；生根培養(yǎng)基MS中添加KTl. 0-2. 0mg/L和NAA0-1. 0mg/L ；2)培養(yǎng)無菌苗將旱半夏塊莖進(jìn)行滅菌處理后，切成5mm左右的小塊，將其移至MS+KT2. Omg/L+2,4-D2. 0mg/L的培養(yǎng)基上產(chǎn)生愈傷，其后轉(zhuǎn)入MS+KT3. Omg/L+2，4-D1. 0mg/L的培養(yǎng)基上使其分化，將產(chǎn)生的叢芽塊，再將其切成單芽塊移至MS基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得到無菌苗；幻誘導(dǎo)愈傷組織在無菌條件下，將步驟2)培養(yǎng)出的無菌苗的葉片、葉柄及愈傷組織塊切成5mm大小的組織，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成愈傷組織；4)分化培養(yǎng)將步驟幻誘導(dǎo)形成的愈傷組織移至分化培養(yǎng)基上使其分化出芽力)增殖培養(yǎng)將步驟4)生成的叢芽切成單芽(包含基部的愈傷組織塊)，接種至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，使其再分化出芽；6)生根培養(yǎng)將步驟幻形成的叢芽塊切成單芽(包含基部的愈傷組織塊)，接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；7)移栽 當(dāng)步驟6)的生根組培苗生長(zhǎng)至3-5cm，根數(shù)在5根以上時(shí)，移栽入基質(zhì)中，在溫室中培養(yǎng)至成苗。一種半夏雜交及F丨[1]擴(kuò)繁方法(申請(qǐng)?zhí)?01019(^6001)，它包括以下步驟 步驟一，半夏品種收集及種質(zhì)資源圃建立首先收集不同類型的半夏種莖，選擇健康、大小一致的種莖，分小區(qū)定植于半夏種質(zhì)資源圃中，插牌標(biāo)記并進(jìn)行水肥管理；步驟二，雜交親本篩選從半夏種質(zhì)資源圃的不同類型半夏居群中，挑選性狀優(yōu)良，具有代表性的居群作為雜交親本；步驟三，雜交技術(shù)將半夏花的器官苞片微張，柱頭發(fā)白具粘液，雄蕊表面光滑、 未散粉時(shí)對(duì)半夏花人工去雄授粉，人工去雄授粉完成后套袋隔離，掛牌標(biāo)記，待種子成熟后收雜交F丨[1]代成熟種子；步驟四，擴(kuò)繁技術(shù)一，實(shí)生苗獲得將收集到的雜交F丨[1] 代成熟種子進(jìn)行消毒滅菌，將滅菌后的雜交F丨[1]代成熟種子接種于1/2MS培養(yǎng)基中，在一定培養(yǎng)條件下培育半夏Fl實(shí)生苗；二，實(shí)生苗擴(kuò)繁選取經(jīng)種子培養(yǎng)獲得的健康的半夏 Fl實(shí)生苗，分別切取半夏Fl實(shí)生苗的葉柄基部、葉柄上部、葉片、塊莖，將切取后的葉柄切段、葉片小塊和塊莖小塊接種到MS+2，4-D0. 5mg/L+6-BAl. Omg/L固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織；三，球狀體增殖選取質(zhì)地，色澤一致的分化出球狀體的愈傷組織接種到改良的MS液體培養(yǎng)基中增值產(chǎn)生半夏球狀體；四，F(xiàn)丨[1]代植株再生將增值產(chǎn)生半夏球狀體接種到 MS+NAA0. lmg/L+6-BAl.Omg/L分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其生根分化形成完整的F丨[1]代植株， 即可進(jìn)行煉苗移栽；步驟五，半夏F丨[1]代品比試驗(yàn)分別對(duì)半夏不同親本與F丨[1]代植株的莖葉形態(tài)進(jìn)行比較，采用分光光度計(jì)法測(cè)定各Fl代葉片中的色素含量，并對(duì)其光響應(yīng)曲線、CO丨[2]響應(yīng)曲線、葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測(cè)定比較，綜合比較各F丨[1]代光合特性，檢測(cè)F丨[1]代半夏中鳥苷及總游離有機(jī)酸的含量，確定光合特性及活性成分均優(yōu)的雜交F丨[1]代。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)半夏在一步成苗過程中移栽成活率較低的問題，我們對(duì)半夏組培的方法進(jìn)行了進(jìn)一步的改進(jìn)，提出半夏組培一步成種法。半夏組培一步成種法的技術(shù)方案是先將半夏組培一步成苗，培養(yǎng)基為MS+NAA 0. lmg/L+6-BA 0. 5mg/L+ 蔗糖 10 50g/L+ 瓊脂 5 10g/L,在 PH 值 5 6，溫度為 25 士 2°C， 光照周期為12h/d，光照強(qiáng)度為1500 2500Lx的條件下培養(yǎng)，得到的可以煉苗移栽的組培
田ο在此環(huán)節(jié)不進(jìn)行煉苗移栽，繼續(xù)讓其生長(zhǎng)，如果營(yíng)養(yǎng)不足可在培養(yǎng)基上加注 MS+NAA 0. lmg/L+6-BA 0. 5mg/L+蔗糖10 50g/L液體培養(yǎng)基，使半夏在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)完成一個(gè)生長(zhǎng)周期，待之生長(zhǎng)成為半夏小塊莖，最后出瓶、洗脫培養(yǎng)基進(jìn)行移栽。本發(fā)明的效果該方法減少了煉苗的步驟和回避了移栽成活率的問題，同時(shí)減少了半夏在一代種的生產(chǎn)過程中再次遭到病毒侵染的可能性。該方法同時(shí)兼顧了一步成苗法的所有優(yōu)點(diǎn)，半夏植株誘導(dǎo)率、分化率、每個(gè)外植體上分化的塊莖數(shù)都表現(xiàn)較好。


圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，半夏組培一步成種法的工藝流程
結(jié)合圖1，在該工藝中，改進(jìn)了半夏組培繼代增值培養(yǎng)的途徑，從成苗的葉片葉柄和塊莖進(jìn)行再培養(yǎng)，原因是在傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)繼代增殖中，多次轉(zhuǎn)接造成材料的變異，使之不能正常形成完整的植株。通過這一改進(jìn)，無論在植株分化率、每個(gè)外植體上分化的塊莖數(shù)還是成苗時(shí)間的早晚上都優(yōu)于前者，同時(shí)沒有變異產(chǎn)生，可以完全地保留半夏的一切遺傳特性。
權(quán)利要求
1. 一種半夏組織培養(yǎng)一步成種法，其特征在于，先將半夏組培一步成苗，培養(yǎng)基為 MS+NAA 0. lmg/L+6-BA 0. 5mg/L+ 蔗糖 10 50g/L+ 瓊脂 5 10g/L,在 PH 值 5 6，溫度為 25士2°C，光照周期為12h/d，光照強(qiáng)度為1500 2500Lx的條件下培養(yǎng)，得到的可以煉苗移栽的組培苗，在此環(huán)節(jié)不進(jìn)行煉苗移栽，繼續(xù)讓其生長(zhǎng)，如果營(yíng)養(yǎng)不足可在培養(yǎng)基上加注MS+NAA 0. lmg/L+6-BA 0. 5mg/L+蔗糖10 50g/L液體培養(yǎng)基，使半夏在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)完成一個(gè)生長(zhǎng)周期，待之生長(zhǎng)成為半夏小塊莖，最后出瓶、洗脫培養(yǎng)基進(jìn)行移栽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種半夏組織培養(yǎng)一步成種法，它是將半夏一步成苗法得到的可以煉苗移栽的組培苗，在不進(jìn)行轉(zhuǎn)接的基礎(chǔ)上加注液體培養(yǎng)基，在溫度為25±2℃；光照周期為12h/d；光照強(qiáng)度為1000～1500Lx的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，使半夏在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)完成一個(gè)生長(zhǎng)周期，洗脫培養(yǎng)基進(jìn)行移栽。本發(fā)明的特點(diǎn)該方法減少了煉苗的步驟，回避了移栽成活率問題，降低了半夏在一代種的生產(chǎn)過程中再次感染病毒的可能性。該方法同時(shí)兼顧了一步成種法的所有優(yōu)點(diǎn)，半夏植株誘導(dǎo)率、分化率、每個(gè)外植體上分化的塊莖數(shù)都表現(xiàn)較好。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102228005SQ20111014657
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月24日
發(fā)明者何忠軍, 劉萬里 申請(qǐng)人:漢中植物研究所