本發(fā)明涉及的是一種農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的組織培養(yǎng)方法，具體是一種北五味子誘導(dǎo)不定芽的方法。
背景技術(shù)：
組織培養(yǎng)是加速植物繁殖、創(chuàng)造優(yōu)良品種的一種行之有效的方法，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供許多優(yōu)良的新品種，也為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)工廠化提供了廣闊的前景。MS培養(yǎng)基，6-BA，NAA，ZT的選用在誘導(dǎo)不定芽萌發(fā)和不定芽增殖中已經(jīng)得到肯定。
北五味子這一中國(guó)傳統(tǒng)著名的藥材近年來在國(guó)外受到相當(dāng)?shù)年P(guān)注，其含有大量的精油、酸等液體物質(zhì)，具有增強(qiáng)視力和聽力能力，消除眼部疲勞，加強(qiáng)視力集中，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，提高抵抗力等功能。因此北五味子可以成為一些特殊職業(yè)的必備良藥，諸如長(zhǎng)途駕駛司機(jī)、飛行員、航海員和運(yùn)動(dòng)員等都可以用它來緩解工作過程中的巨大壓力。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，陳雅君等在《植物研究》(1999，7，19(3)：318-322)上發(fā)表的《藥用植物北五味子的組織培養(yǎng)》該文中提出以帶腋芽的北五味子嫩莖為外植體，在附加6-BA2.0+ZT0.1mg/L的MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)芽的效果最好。其具體方法為：把北五味子嫩莖剪去葉片及葉柄，用自來水沖洗，并加少量市售洗衣粉加以洗滌，用自來水沖洗4～5小時(shí)，然后切成約5cm長(zhǎng)的莖段移到超凈工作臺(tái)上，先用70％酒精浸泡30秒，再用0.2％溶液消毒8分鐘，取出后用無菌水沖洗5次，切成長(zhǎng)度約0.5cm左右的小段，每段至少有一個(gè)葉腋，按無菌操作要求，接種于培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)瓶置于20～26℃，光照強(qiáng)度為2000Lx的培養(yǎng)室，光照時(shí)間每天為12小時(shí)。其不足在于：升汞溶液有劇毒，對(duì)植物材料損傷大，對(duì)人體有危害性，處理不當(dāng)對(duì)環(huán)境有污染，不適宜實(shí)際應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種北五味子誘導(dǎo)不定芽的方法，使其提供北五味子組培快繁的不定芽誘導(dǎo)所需要的最佳培養(yǎng)基和外植體消毒方法，為優(yōu)良北五味子的快速繁殖提供了技術(shù)保證，將對(duì)北五味子資源的開發(fā)和利用起到積極的推動(dòng)作用。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下具體步驟：
①取北五味子的嫩枝頂部和中部帶腋芽莖段作為組織培養(yǎng)地外植體材料；
②采用間二滅菌法對(duì)外植體材料消毒；
③在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得無菌叢生芽；
④叢生芽經(jīng)過分株后再接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得大量不定芽。
所述采用間二滅菌法對(duì)外植體材料消毒，是指：用飽和的次氯酸鈉浸泡消毒后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，隔一天后再用次氯酸鈉消毒一次。
進(jìn)一步的，所述采用間二滅菌法對(duì)外植體材料消毒，是指：剪取2cm長(zhǎng)的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時(shí)后用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發(fā)白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分，通過無菌操作接種于誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基上，隔一天將外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次，以獲得高質(zhì)量的無菌北五味子外植體材料。
所述在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得無菌叢生芽，其培養(yǎng)室溫度20℃-25℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度800-12001x。經(jīng)過20天-30天的培養(yǎng)，北五味子莖段會(huì)生長(zhǎng)出腋芽。
所述叢生芽經(jīng)過分株后再接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，是指：長(zhǎng)出腋芽后繼續(xù)培養(yǎng)20天左右，待腋芽長(zhǎng)到2cm后，將不定芽從外植體上切下，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在剪取不定芽時(shí)，盡量選擇腋芽莖段，因?yàn)樵摬课辉诶^代培養(yǎng)中是最容易誘導(dǎo)出更多的不定芽。等待不定芽長(zhǎng)成芽叢后，再將不定芽切下分株繼續(xù)擴(kuò)大繁殖，直至到達(dá)所需數(shù)量。
所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其成分為：每升液體MS基本培養(yǎng)基中加6-芐氨基嘌呤2.0mg、α-萘乙酸0.05mg、玉米素0.06mg、蔗糖30g、瓊脂8g。
本發(fā)明對(duì)于外植體的消毒采用了間二滅菌法，原因在于培養(yǎng)的植物材料大都采集于田間栽培植株，材料上常附有各種微生物，一旦被帶入培養(yǎng)基，即會(huì)迅速繁殖滋長(zhǎng)，造成污染，而接種到培養(yǎng)基上之后兩天是孢子體生命力最弱的階段，此時(shí)將外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次，接種到培養(yǎng)基上后，污染率小于5％，且外植體腋芽萌發(fā)率高，相對(duì)于傳統(tǒng)的一次滅菌方法，能取得更好的滅菌效果，而且次氯酸鈉相對(duì)于其他消毒劑更易于去除，不易殘留在外植體上對(duì)其造成損傷。
本發(fā)明中培養(yǎng)基附加了低濃度的NAA，其作為一種生長(zhǎng)素，主要作用是重新啟動(dòng)有絲分裂，使已停止分裂的植物細(xì)胞恢復(fù)分裂能力。在北五味子不定芽誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，低濃度的NAA與6-BA組合，效果比不加NAA要好。不定芽平均增殖系數(shù)達(dá)到3.4，最高4.1，比前人所作有大幅提高。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明：本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
本實(shí)施例所使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，通過以下方法制成：每升液體MS基本培養(yǎng)基中加6-BA(6-芐氨基嘌呤)2.0mg、NAA(α-萘乙酸)0.05mg、ZT(玉米素)0.06mg、蔗糖30g，pH值調(diào)為5.8后每升加入8g瓊脂121℃滅菌30min制成固體培養(yǎng)基。
實(shí)施例1
剪取2cm長(zhǎng)的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時(shí)后用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發(fā)白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分，通過無菌操作接種于誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基上(每升液體MS基本培養(yǎng)基中附加6-BA(6-芐氨基嘌呤)2.0mg、NAA(α-萘乙酸)0.05mg、ZT(玉米素)0.06mg、蔗糖30g，pH值調(diào)為5.8后每升加入8g瓊脂121℃滅菌30min制成固體培養(yǎng)基)100個(gè)，隔一天將外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次后重新接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度20℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度12001x條件下培養(yǎng)。經(jīng)過20天的培養(yǎng)，北五味子莖段會(huì)生長(zhǎng)出腋芽。待腋芽長(zhǎng)到2cm后，選取60個(gè)腋芽從外植體上切下，接種到上述培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，30天后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)量為211個(gè)，增殖系數(shù)為3.52。
實(shí)施例2
剪取2cm長(zhǎng)的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時(shí)后用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發(fā)白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分，通過無菌操作接種于誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基上(每升液體MS基本培養(yǎng)基中附加6-BA(6-芐氨基嘌呤)1.5mg、NAA(α-萘乙酸)0.03mg、ZT(玉米素)0.04mg、蔗糖30g，pH值調(diào)為5.8后每升加入8g瓊脂121℃滅菌30min制成固體培養(yǎng)基)100個(gè)，隔一天將外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次后重新接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度25℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度8001x條件下培養(yǎng)。經(jīng)過25天的培養(yǎng)，北五味子莖段會(huì)生長(zhǎng)出腋芽。待腋芽長(zhǎng)到2cm后，選取60個(gè)腋芽從外植體上切下，接種到上述培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，30天后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)量為166個(gè)，增殖系數(shù)為2.76。
實(shí)施例3
剪取2cm長(zhǎng)的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時(shí)后用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發(fā)白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分，通過無菌操作接種于誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基上(每升液體MS基本培養(yǎng)基中附加6-BA(6-芐氨基嘌呤)2.5mg、NAA(α-萘乙酸)0.07mg、ZT(玉米素)0.08mg、蔗糖30g，pH值調(diào)為5.8后每升加入8g瓊脂121℃滅菌30min制成固體培養(yǎng)基)100個(gè)，隔一天將外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次后重新接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度22℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度10001x條件下培養(yǎng)。經(jīng)過26天的培養(yǎng)，北五味子莖段會(huì)生長(zhǎng)出腋芽。待腋芽長(zhǎng)到2cm后，選取60個(gè)腋芽從外植體上切下，接種到上述培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，30天后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)量為175個(gè)，增殖系數(shù)為2.92。