專利名稱：捕光色素葉綠素a/b結合蛋白LHCB4在植物育種中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種捕光色素葉綠素a/b結合蛋白LHCB4在植物育種中的應用。
背景技術：
捕光葉綠素a/b結合蛋白(LHCB)是光合系統(tǒng)II (PSII)復合體的載脂蛋白。LHCB 蛋白通常與葉綠素、葉黃素組成復合體成為光合系統(tǒng)的捕光天線復合體。這些捕光天線復合體吸收光能并且向PSII光反應中心傳遞激發(fā)能以驅動光合電子傳遞系統(tǒng)。PSII復合體的外部天線蛋白LHCBs是捕光復合體重要的組成部分，它是自然界中含量最豐富的膜蛋白。LHCBs蛋白由較小的天線復合體LHCB4(CP^)，LHCB5(CP26)和LHCB6 (CP24)以及較大的天線復合體同源和異源的三聚體LHCB1，LHCB2和LHCB3。這些葉綠體/類囊體蛋白由核基因編碼，其表達主要受到環(huán)境和發(fā)育等因素調節(jié)，包括主要受到光(Silverthorne and Tobin, 1984 ；Sun and Tobin, 1990 ；Peer et al, 1996 ；Millar and Kay,1996 ；Weatherwax et al,1996 ；Yang et al, 1998 ；Humbeck and Krupinska,2003 ；Nott et al,2006 ；Staneloni et al,2008 ；De Montaigu et al,2010 ； Pruneda-Paz and Kay,2010 ；Thines and Harmon,2010)；活性氧(Nott et al，2006; Staneloni et al，2008)，葉綠體逆向信號(Nott et al，2006)，晝夜節(jié)律(Paulsen and Bogorad,1988 ；Strayer et al,2000 ；Alabadi et al,2001 ；Thain et al,2002 ；Andronis et al,2008 ；Pruneda-Paz et al,2009 ；De Montaigu et al, 2010 ；Pruneda-Paz and Kay, 2010 ；Thines and Harmon, 2010)和生物激素脫落酸(ABA)的調控(Bartholomew et al, 1991 ；Chang and Walling, 1991 ；Weatherwax et al, 1996 ；Staneloni et al，2008)。植物對LHCB蛋白表達的調節(jié)被認為是植物調節(jié)葉綠體功能以應對逆境的重要機制之一(Nott et al,2006 ；De Montaigu et al, 2010 ；Pruneda-Paz and Kay,2010 ；Thines and Harmon, 2010)。ABA是調節(jié)植物生長與發(fā)育的重要生物激素，尤其在植物響應逆境方面起到重要作用(Finkelstein et al,2002 ；Adie et al，2007)。以前人們認為 ABA 負調控 LHCB 基因的表達，并且與光協(xié)同作用調節(jié)LHCB的表達以響應強光逆境(Bartholomew et al,1991 ； Chang andffalling, 1991 ；Weatherwax et al, 1996 ；Staneloni et al，2008)。強光調低 LHCB的表達可能是通過植物體內ABA濃度的改變而實現(xiàn)的(Weatherwax et al，1996)。然而ABA對于LHCB基因表達的生理意義并沒有被完全理解。ABA信號轉導過程得到了廣泛的研究，人們鑒定得到了許多參與其中的組成成分， 這其中包括位于細胞膜和細胞內的ABA受體。質膜蛋白GCR2和GTG1/GTG2被認為是在細胞表面起作用的ABA受體。一類START蛋白PYR/PYL/RCAR被認為是作用于細胞內的ABA 受體，直接作用于PP2C信號通路的上游以調節(jié)下游基因的表達。已經報道過擬南芥中鎂卟啉IX(Mg-ProtoIX)螯合酶的H亞基(CHLH/ABAR)作為ABA受體可以結合ABA，作用于ABA 信號轉導過程。最近，又報道了 ABAR可以結合一組WRKY轉錄因子抑制一些ABA響應基因
5的表達，如ABI5。事實上，ABA被認為是植物將晝夜節(jié)律和受ABA調控從而響應干旱環(huán)境之間的一個關鍵環(huán)節(jié)。ABAR/CHLH在植物細胞中還起到許多作用在葉綠素合成過程中催化鎂離子與卟啉IX的結合，作為基因組解偶聯(lián)蛋白(GUN5)介導質體-核逆向信號轉導過程。ABAR/CHLH不僅是ABA受體，也在葉綠體逆向信號中具有GUN表型參與調節(jié)LHCB 基因的表達。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種控制植物性狀的方法。本發(fā)明提供控制植物性狀的方法，是提高出發(fā)植物中LHCB4蛋白編碼基因的表達，得到具有下述1)或幻特征的目的植物1)耐逆性高于所述出發(fā)植物；2)生長延緩于所述出發(fā)植物。所述目的植物生長延緩于所述出發(fā)植物為如下A或B :A、所述目的植物種子的萌發(fā)遲于所述出發(fā)植物；B、所述目的植物根的生長遲于所述出發(fā)植物；所述目的植物種子的萌發(fā)遲于所述出發(fā)植物體現(xiàn)為所述目的植物種子的萌發(fā)率低于所述出發(fā)植物；所述目的植物種子的根的生長遲于所述出發(fā)植物體現(xiàn)為所述目的植物根長小于所述出發(fā)植物；所述提高出發(fā)植物中LHCB4編碼基因的表達是在激素脅迫下進行；所述激素具體為ABA;所述LHCB4蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。所述耐逆性為耐干旱性；所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥。所述提高出發(fā)植物中LHCB4編碼基因的表達是通過向出發(fā)植物中導入所述LHCB4 編碼基因實現(xiàn)的。所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ΑΒΑ脅迫的濃度低于200μΜ但不為ΟμΜ，具體為20 μ Μ、 50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Μ。所述耐干旱性通過氣孔開度和/或失水率體現(xiàn)；所述根生長通過主根長度體現(xiàn)。所述提高LHCB4編碼基因的表達是通過外源ABA激活ABAR-WRKY40信號通路實現(xiàn)。所述激活ABAR-WRKY40信號通路為外源的ABA激活植物的ABA受體，使ABA受體與結合有轉錄因子WRKY40的LHCB4啟動子競爭結合轉錄因子WRKY40，釋放LHCB4的啟動子，使LHCB4編碼基因表達；所述ABA受體的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；
所述ABA受體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述轉錄因子WRKY40的氨基酸序列為序列表中的序列4 ；所述轉錄因子WRKY40的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述LHCB4啟動子的核苷酸序列為序列表中的序列6。本發(fā)明的另一個目的是提供一種控制植物性狀的方法。本發(fā)明提供的方法，是降低目的植物中LHCB4蛋白編碼基因的表達，得到具有下述1)或幻特征的植物1)耐逆性低于所述目的植物；2)生長加快于所述目的植物。所述植物的生長加快于所述出發(fā)植物為如下A或B :A)所述植物的種子的萌發(fā)早于所述目的植物；B)所述植物的根的生長早于所述目的植物；所述植物的種子的萌發(fā)早于所述目的植物體現(xiàn)為所述植物的種子的萌發(fā)率大于所述目的植物；所述植物的根的生長早于所述目的植物體現(xiàn)為所述植物的根長大于所述目的植物；所述降低目的植物中LHCB4蛋白編碼基因的表達是在激素脅迫下進行；所述激素具體為ABA ；所述LHCB4蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述耐逆性為耐干旱性；所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥；所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ΑΒΑ脅迫的濃度低于200μΜ但不為ΟμΜ，具體為20 μ Μ、 50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、300 μ M ; 所述耐干旱性具體通過氣孔開度和/或失水率體現(xiàn)；所述根生長具體通過主根長度體現(xiàn)；所述降低LHCB4編碼基因的表達是通過外源ABA激活ABAR-WRKY40信號通路實現(xiàn)；所述激活ABAR-WRKY40信號通路具體為外源的ABA激活植物的ABA受體，使ABA 受體與結合有轉錄因子WRKY40的LHCB4啟動子競爭結合轉錄因子WRKY40，釋放LHCB4的啟動子，使LHCB4編碼基因表達；所述ABA受體的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；所述ABA受體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述轉錄因子WRKY40的氨基酸序列為序列表中的序列4 ；所述轉錄因子WRKY40的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述LHCB4啟動子的核苷酸序列為序列表中的序列6。本發(fā)明的第三個目的是提供提高一種植物耐逆性或延緩植物生長的方法。
本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用ABA對植物進行脅迫，得到具有如下性狀的植物1)目的植物耐逆性高于出發(fā)植物；2)目的植物的生長延緩于出發(fā)植物；將處理前的植物記作出發(fā)植物，將處理后的植物記作目的植物。所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ΑΒΑ脅迫的濃度低于200 μ Μ，具體為20 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、 150μΜ、200μΜ、300μΜ ；所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥。所述特征還體現(xiàn)在如下1)- 中任一一種1)在ABA脅迫下，野生型植物耐逆性高于LHCB4蛋白表達失活的突變體LHCB4 ；2)在ABA脅迫下，野生型植物的種子的萌發(fā)率低于LHCB4蛋白表達失活的突變體 LHCB4 ；3)在ABA脅迫下，野生型植物的根長低于LHCB4蛋白表達失活的突變體LHCB4。本發(fā)明的實驗證明，ABA調節(jié)LHCB4的表達是通過ABAR/CHLH參與的信號通路，各個LHCB家族成員的正常表達需要ABA的參與，并且生理水平內高濃度的ABA促進LHCB的表達，WRKY40作為負調節(jié)子直接作用于LHCB基因，LHCB通過ABAR-WRKY40介導的信號通路參與ABA信號轉導過程，是ABA信號轉導過程中的一個正調節(jié)子，響應ABA調節(jié)的種子萌發(fā)、幼苗生長和氣孔運動等表型。


圖1為ABA刺激LHCBs的mRNA和蛋白的表達圖2為ABA刺激LHCB4在種子萌發(fā)和幼苗生長方面表型圖3為ABA刺激LHCB4對氣孔運動和干旱脅迫的影響圖4為ABA刺激LHCB4對萌發(fā)率、氣孔運動和干旱脅迫的影響圖5為35S驅動LHCBs基因在Ihcbs突變體中表達，恢復植株的表型圖6為ABA刺激下LHCB基因完全表達圖7為轉錄抑制子WRKY40與LHCB家族成員的啟動子結合
圖8為WRKY40抑制LHCB基因的表達圖9為abar-3突變體中LHCB基因的表達圖10為Ihcb雙突變體及Ihcbcch雙突變體的分子和生化檢測圖11為Ihcb突變體中ROS穩(wěn)態(tài)及一系列ABA響應基因的表達圖12為LHCB4基因表達量降低使wrky40突變體對ABA的敏感性部分恢復到野生型狀態(tài)圖13為突變體lhcbl-6的分子和生化鑒定圖14為不同Ihcb突變體中內源ABA含量及干物質含量測定圖15為wrky40及wrky40wrkyl8突變體沒有gun表型
圖16為LHCBs蛋白響應生理水平濃度ABA而增加的一個模式17為LHCB4在不同組織中的表達
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中所用的材料如下1、T-DNA 插入突變體包括 LHCB1. 1 基因(Atlg29920)的 lhcbl. 1 (SALK-134810) (以下簡稱lhcbl，將野生型擬南芥中的LHCBl基因通過T-DNA插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)，LHCB2. 2基因(At2g05070)的lhcb2. 2 (SALK-005614)(以下簡稱lhcb2，將野生型擬南芥中的LHCB2基因通過T-DNA插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)，LHCB3基因(At5g54270，將野生型擬南芥中的LHCB3基因通過T-DNA 插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)的lhcb3 (SALK-036200)，LHCB4. 3基因 (At2g40100)的lhcb4. 3 (SALK-032779)(以下簡稱lhcb4，將野生型擬南芥中的LHCB4基因通過T-DNA插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)，LHCB5基因(At4gl0340)的 lhcb5 (SALK-139667，將野生型擬南芥中的LHCB5基因通過T-DNA插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)，LHCB6基因(Atlgl5820)的lhcb6 (SALK-074622，將野生型擬南芥中的LHCB6基因通過T-DNA插入進行敲除突變得到的，其余基因沒有變化)，這些突變體的種子均購自ABRC。。2、wrky40_l (ET5883,Ler生態(tài)型背景，以下簡稱wrky40突變體)購自冷泉港實驗室，該突變體在WRKY40(Atlg80840)基因的第二個外顯子有一個Ds轉座子插入。wrky40_l 突變體是通過回交從Ler背景轉變成Col背景。wrkyl8-l (SALK-093916)購自 ABRC，是 WRKY18 (At4g31800)基因第一個外顯子上的T-DNA插入敲除突變體，這兩個突變體之前已經鑒定過是兩個無效等位基因。3、雙突變所有雙突變體都經過雜交和PCR鑒定得到雙突變體構建方法將一種突變體未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下另一種突變體中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F(xiàn)2代生長，經PCR鑒定可得到純合體。4、cch突變體(Col背景，ABA受體的突變體)(Shen Y-Y, Wang X-F,ffu F-Q,Du S-Y, Cao Z,Shang Y，Wang X-L,Peng C-C,Yu X-C,Zhu S-Y,Fan R-C,Xu Y-H,Zhang D-P (2006). The Mg-chelatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature 443 :823-826,公眾可從清華大學獲得。)由J. Chory博士饋贈。5、ABA 合成突變體 aba2 (CS156 :aba2_l，Col 背景，ABA 受體)購自 ABRC。植物生長條件MS培養(yǎng)基在光照培養(yǎng)箱中19-20°C，光強為SOymolm-2^,土中生長時光照強度為120 μ Hiolm-2S-1,16h光照。6、Ihcbs突變體的互補擬南芥的獲得提取哥倫比亞(Col-O)生態(tài)型為背景的擬南芥植株(ABRC :CS60000,以下簡稱野生型擬南芥，記作col)的基因組DNA，以下列引物進行PCR擴增
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forward primer :5，-GCTCTAGAATGGCTACCACCACTGCAG-3，(XbaI)reverse primer :5，-ACGCGTCGACCTAATTGTTAAAGGTGGCAAGG-3，(Sail)得到831bp的PCR產物，經過測序，該產物的核苷酸序列為NM_129568 (具有序列 1所示的核苷酸)。將PCR產物經SmaI和Mil酶切，得到酶切后產物，將該酶切后產物與經過同樣酶切的 PCAMBIA1300-221 載體(Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P(2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22:1909-1935, 公眾可從清華大學獲得。)連接，得到轉化子，提取轉化子的質粒，經過測序，該質粒為將 LHCB4基因插入pCAMBIA1300-221載體的SmaI和Mil酶切位點間得到的載體，命名為 PCAMBIA1300-221-LHCB4。將pCAMBIA1300-221-LHCB4轉入根癌農桿菌GV3101菌株，得到重組菌3，提取質粒送去測序，結果為重組菌3的質粒為pCAMBIA1300-221-LHCB4，將重組菌3命名為GV3101/ PCAMBIA1300-221-LHCB4。將GV3101/pCAMBIA1300-221-LHCB4通過花苞滲透法侵染突變體LHCB4，得到TO代 LHCB4互補擬南芥。將TO代LHCB4互補擬南芥收種、播種，繼續(xù)傳代，直到得到T3代LHCB4互補擬南芥，即為Ihcbs突變體的互補擬南芥，記作lhcb4*。7, Chl-I為葉綠素合成突變體，擬南芥生物資源中心ABRC，CS3119。下述實施例中的實驗均為三次重復，涉及定量試驗的均為三次實驗取平均值。實施例1、在ABA的脅迫下LHCB4表達影響植物種子萌發(fā)、幼苗生長及耐旱一、外源施加低濃度ABA (相當于生理條件高濃度ABA)對LHCB4 mRNA和蛋白水平表達的影響分別在植物發(fā)育的兩個階段進行ABA處理幼苗期和成齡期。幼苗期普通MS培養(yǎng)基生長三天的野生型擬南芥(col) (ABRC, CS60000)幼苗移至含0、0. 5、1、3、5或IOuM的ABA的培養(yǎng)基(ABA+MS培養(yǎng)基)中再生長兩周；成齡期移至土壤中的野生型擬南芥幼苗生長三周后噴施不同濃度的ABA溶液 (不同濃度的ABA水溶液10ml)生長5小時，收取材料。mRNA 表達的具體檢測方法參照 Biofcid Real-Time System CFX96TM ClOOO Thermal Cycler (Singapore)儀器說明書對LHCB4的mRNA水平的表達進行RT-PCR 檢測，模板為植株的 cDNA,引物為 LHCB4 forward primer :5，-CAGCCGTACACTGAAGTC TTTGG-3' reverse primer :5，-TTCTATCCATATCAACGTCGTCAAC-3，，內參為 β-Actin、 內參的引物為 forward primer 5' -GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer 5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。LHCB4蛋白表達的具體檢測方法將整個植株在液氮中速凍，用預冷好的研磨鈸與研磨棒將材料在液氮中磨成粉末，裝入1.5mL離心管中。提取緩沖液成分為50mM Tris-HCl, pH 7. 5,150mMNaCl, ImM EDTA，0. 1% (v/v) Triton Χ-100,10% (ν/ν) glycerol, 并加入蛋白酶抑制劑。按照提取緩沖液與樣品4 1的比例加入離心管，并迅速放入液氮中速凍。利用細胞破碎超聲儀將混合物超聲處理至完全解凍，然后再次放入液氮內速凍。上述步驟重復三次。將混合物IOOOOg離心3分鐘，除去不溶物和未破碎的細胞。將上清液轉移至新離心管待用，即為LHCB4蛋白。將LHCB4蛋白進行SDS-PAGE和免疫印記，具體的實驗步驟參照已發(fā)表的論文 (ffu F-Q, XinQ, Cao Z, Liu Z-Q, Du S-Y, Mei C, Zhao C-X, Wang X-F, Shang Y, Jiang T, Zhang X-F, Yan L, Zhao R, Cui Z-N, Liu R, Sun H-L, Yang X-L, Su Z, Zhang D-P(2009). The Mg-chelatase H subunit binds abscisic acid and functions in abscisic acid signaling:New evidence in Arabidopsis. Plant Physiol 150 :1940-1954), LHCB4 的特異抗體購自 Agrisera(Stockholm, Sweden ；website :www. agrisera. com ；product No. AS01045)。結果如圖1所示，圖IA 幼苗中0 IlJ 5 μ M ABA處理后LHCB4的mRNA表達水平升高，但10 μ M ABA 處理后LHCB4的mRNA表達水平降低。將三天的野生型幼苗，移到含不同濃度ABA的培養(yǎng)基上，繼續(xù)生長兩周取樣檢測(具體的檢測方法見上述mRNA表達檢測)。每組數(shù)據(jù)都是三次獨立生物學重復的平均值。0 μ M ABA處理，LHCB4的mRNA相對表達量為0. 80 ；0. 5 μ M ABA 處理，LHCB4 的 mRNA 相對表達量為 1.02;1 μ M ABA處理，LHCB4的mRNA相對表達量為0. 98 ；5 μ M ABA處理，LHCB4的mRNA相對表達量為1. 04 ；3 μ M ABA處理，LHCB4的mRNA相對表達量為1. 10 ；5 μ M ABA處理，LHCB4的mRNA相對表達量為0. 70 ；10 μ M ABA 處理，LHCB4 的 mRNA 相對表達量為 0. 16 ；圖IB 成齡苗中低于200 μ M ABA處理使LHCB4的mRNA表達水平升高，但高于 200 μ M ABA處理使LHCB4的mRNA表達水平降低。ABA溶液噴施三周齡的植株5小時后取樣檢測(具體的檢測方法見上述mRNA表達檢測)。每組數(shù)據(jù)都是三次獨立生物學重復的平均值。0 μ M ABA處理，LHCB4的mRNA相對表達量為0. 56 ；20 μ M ABA 處理，LHCB4 的 mRNA 相對表達量為 0. 80 ；50 μ M ABA 處理，LHCB4 的 mRNA 相對表達量為 1. 48 ；100 μ M ABA 處理，LHCB4 的 mRNA 相對表達量為 1. 20 ；150 μ M ABA 處理，LHCB4 的 mRNA 相對表達量為 1. 20 ；200 μ M ABA 處理，LHCB4 的 mRNA 相對表達量為 1.25;300 μ M ABA 處理，LHCB4 的 mRNA 相對表達量為 0. 50。圖IC 幼苗中0到5μΜ ABA處理后LHCB4的蛋白表達水平升高，但10 μ M ABA處理后LHCB4的蛋白表達水平降低。材料處理同(A)。Actin為上樣對照，實驗三次重復得到相似的結果。檢測方法具體見LHCB蛋白表達檢測。圖ID 成齡苗中低于200 μ M ABA處理使LHCBs (LHCB1 6)的蛋白表達水平升高，但高于200 μ M ABA處理使LHCBs(LHCBl 6)的蛋白表達水平降低。材料處理同(B)。Actin為上樣對照，實驗三次重復得到相似的結果。檢測方法具體見LHCB蛋白表達檢測。從上述可以看出在幼苗期，0. 5至5μΜ的ABA濃度促進LHCB4的mRNA表達， 10 μ M時表達量下降(圖1Α)。在成齡期，低于200 μ M的ABA濃度處理擬南芥促進LHCB4 的mRNA表達，高于200 μ M時，LHCB4的mRNA表達量下降，50 μ M的ABA是促進LHCB4表達的最適濃度(圖1Β)。進一步研究ABA對LHCB蛋白表達的影響。在幼苗期，LHCB蛋白表達對于ABA處理的響應與mRNA水平完全一致，表達量在1至3 μ M處理時達到最大(圖1C)。在成齡期， 從20至300μΜ均促進LHCB蛋白的表達，隨著ABA濃度的增力Π，表達量增加(圖1D)，這與 mRNA的表達不同(圖1B)。實驗結果表明，LHCB的表達在轉錄與翻譯水平受到不同的調節(jié)?？傊?，以上數(shù)據(jù)基本說明，外源施加的低濃度，相當于生理條件下高濃度ABA，促進而不是抑制LHCB的表達。二、提高出發(fā)植物中LHCB4編碼基因的表達檢測種子的萌發(fā)率和根長變化1、種子萌發(fā)實驗將待測植物的約100粒種子消毒分三份播在MS培養(yǎng)基(Sigma，St. Louis,MO,USA ； full-strength MS)。培養(yǎng)基含有3%蔗糖和0. 8%瓊脂粉(pH 5.9)并含有0、0. 5、IuM的 ABA。種子在4°C條件下春化3天，然后放在20°C光照條件下生長，在標示的時間記錄萌發(fā) (根的出現(xiàn))的數(shù)據(jù)。上述待測植物為lhcb4突變體、野生型擬南芥col、雙突變體lhcb41h(A6(雙突變體構建方法將Ihcb4未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下Ihcbe中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在lhcb4雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記， 莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F(xiàn)2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)、cch突變體、chl-1 (ABRC, CS3119)、雙突變體IhcMcch (雙突變體構建方法將lhcb4 未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下cch中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在 lhcb4雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F(xiàn)2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)。每一個數(shù)值都是三次獨立生物學重復的平均值。結果如圖2A-2C和圖4A-4C所示，從圖2A可以看出，lhcb4在0 μ M的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72的萌發(fā)率分別為 25%、90%、100%、100%、100%;在0.5“] 的六8六的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、7211 的萌發(fā)率分別為 15%,66%,90%,100%,100% ；在 1 μ M 的 ABA 的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72h 的萌發(fā)率分別為10%,62%,80%,90%,100% ；chl-1在ΟμΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72的萌發(fā)率分別為10%,80%, 98% ,100% ,100% ；在0. 5μΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72的萌發(fā)率分別為1%> 30%、72%、90%、100%在ΙμΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72的萌發(fā)率分別為0%, 20%,43%,75%,84% ；col在ΟμΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、7濁的萌發(fā)率分別為10%、78%、 98%,100%,100% ；在0. 5μΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72h的萌發(fā)率分別為0%,22%、70%、86%、100%在ΙμΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72h的萌發(fā)率分別為0%、 17%,35%,70%,83% ；從圖2B可以看出，雙突變體lhcb4 IhcM在ΟμΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、7濁的萌發(fā)率分別為 10%、90%、100%、100%、100%;在 0. 5μ M 的 ABA 的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72h 的萌發(fā)率分別為8 %、50 %、78 %、92 %、100 %在1 μ M的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、7 的萌發(fā)率分別為 5%,38%,56%,82%,90% ；col在ΟμΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、7濁的萌發(fā)率分別為8 %、80 %、 96%,100%,100% ；在0. 5μΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72h的萌發(fā)率分別為2%, 22%、65%、82%、100%在ΙμΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72h的萌發(fā)率分別為0%、 10%、30%、62%、80%。從圖2C可以看出，lhcb4 cch 在 24、36、48、60、72h 的萌發(fā)率分別為 14% ,92% ,97% ,100% ,100%,野生型col在ΙμΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、72的萌發(fā)率分別為10%, 78%,88%,100%,100%,cch在ΙμΜ的ABA的培養(yǎng)基中，24、36、48、60、7濁的萌發(fā)率分別為19%、90%、 98%,100%,100% ；以上實驗說明在ABA的刺激下，調低LHCB4基因表達量(lhcb4)，萌發(fā)率反而提高，提高LHCB4基因表達量(col)，萌發(fā)率降低，可以看出，調低LHCB4基因表達量降低了種子萌發(fā)對ABA的響應能力。從圖4A-4C也可以看出，突變體LHCB2的萌發(fā)率高于野生型col。從圖4D可以看出，突變體在幼苗生長方面對于ABA脫敏，LHCB家族的雙突變體在幼苗生長方面對于ABA脫敏，突變體與cch的雙突變體在幼苗生長方面對于ABA脫敏。以上實驗說明1. lhcb4突變體在種子萌發(fā)方面對ABA表現(xiàn)脫敏；2. Ihcb4 cch雙突變體在種子萌發(fā)方面對ABA表現(xiàn)脫敏，脫敏的程度低于Ihcb或者cch單突變體，說明 LHCB4在ABAR參與的ABA信號轉導過程的下游。2、根長實驗待測植物種子直接播在含有IuM的ABA的MS培養(yǎng)基中播種，春化后生長12 (E，F(xiàn)) 拍照觀察統(tǒng)計根長，以主根長度統(tǒng)計。待測植物為單突變體lhcb4、野生型擬南芥col、cch單突變體、雙突變體lhcb4 CCh0每一個數(shù)值都是三次獨立生物學重復的平均。結果如圖2E-2F所示，從2E中可以看出，lhcb4的根長為5. 8mm ；Col 的根長為 2. Omm ；從圖2F可以看出，Lhcb4 cch雙突變體在含1 μ M的ABA培養(yǎng)基上的幼苗根長為5. 9mm ；cch單突變體在含1 μ M的ABA培養(yǎng)基上的幼苗根長為6. 3mm ；野生型col在含1 μ M的ABA培養(yǎng)基上的幼苗根長為2. Omm ；上上述實驗可以看出，所有的lh(A2突變體在種子萌發(fā)和幼苗生長方面表現(xiàn)出對ABA脫敏的表型ABA抑制種子萌發(fā)，ABA抑制幼苗生長。三、提高出發(fā)植物中LHCB4編碼基因的表達對耐逆性的影響1、氣孔運動實驗ABA誘導的氣孔關閉體系將土壤中生長3周的待測植物葉片浸泡在含有50mM KCl和IOmMMes-Tris (pH 6. 15)的緩沖液中，以200 μ moIm-2S^1強度在冷光源下放置2. 5h， 然后加入不同濃度的(士)_ABA。在ABA處理2. 后，撕取表皮條，記錄氣孔開度。ABA抑制氣孔開放體系將土壤中生長3周的待測植物葉片浸泡在相同的緩沖液中，黑暗處理2. 5h,然后在緩沖液中加入ABA移至冷光源下照射2h，記錄氣孔開度。待測植物為col、chl-1 (ABRC, CS3119)，cch, lhcb4 突變體。結果如圖3A所示，其中誘導氣孔關閉為上圖，抑制氣孔開放為下圖。每一個數(shù)值都是五次獨立生物學重復的平均。每次重復記錄60個氣孔的開度。從圖3A中可以看出，Col 在 OuMABA 處理 0h、0uMABA 處理 2. 5h、20uMABA 處理 2. 5h、30uMABA 處理 2. 5h 的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為5. 0 μ M、5. 1 μ M、2. 8 μ M、0. 3 μ M ；Col 在 OuMABA 處理 0h、0uMABA 處理 2. 5h、20uMABA 處理 2. 5h、30uMABA 處理 2. 5h 的抑制氣孔開放時氣孔的開度為1. 4 μ Μ、4. 4 μ Μ、2. 2 μ Μ、0. 2 μ M ;chl-1 在 OuMABA 處理 0h、0uMABA 處理 2. 5h、20uMABA 處理 2. 5h、30uMABA 處理 2. 5h 的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為5. 3 μ M、5. 0 μ M、2. 6 μ M、0. 7 μ M ；chl-1 在 OuMABA 處理 0h、0uMABA 處理 2. 5h、20uMABA 處理 2. 5h、30uMABA 處理 2. 5h 的抑制氣孔開放時氣孔的開度為1. 1 μ M、5. 4 μ M、2. 6 μ M、0. 9 μ M ；cch 在 OuMABA 處理 0h、0uMABA 處理 2. 5h、20uMABA 處理 2. 5h、30uMABA 處理 2. 5h 的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為6. 2 μ Μ、6. 3 μ Μ、5. 8 μ Μ、2. 6 μ M ；cch 在 OuMABA 處理 0h、0uMABA 處理 2. 5h、20uMABA 處理 2. 5h、30uMABA 處理 2. 5h 的抑制氣孔開放時氣孔的開度為1. 5 μ Μ、6. 7 μ Μ、5. 5 μ Μ、2. 3 μ M ；lhcb4 突變體在 OuMABA 處理 Oh、OuMABA 處理 2. 5h、20uMABA 處理 2. 5h、30uMABA 處理2. 5h的誘導氣孔關閉時氣孔的開度為5. 5 μ M、5. 4 μ M、5. 0 μ Μ、3· 8uM ；lhcb4 突變體在 OuMABA 處理 Oh、OuMABA 處理 2. 5h、20uMABA 處理 2. 5h、30uMABA 處理2. 5h的抑制氣孔開放時氣孔的開度為1. 8 μ M、5. 2 μ Μ、4· 5 μ Μ、4· OuM ；可以看出，在ΑΒΑ誘導的氣孔關閉和抑制氣孔開放方面，lhcb4突變體表現(xiàn)出對 ABA的脫敏表型即ABA誘導下，過表達lhcb4(col)與抑制Ihcb4(lhcb4)相比，氣孔開度變大。2、干旱實驗和失水率實驗將待測植物從培養(yǎng)基移入土壤中生長后，不澆水進行干旱脅迫(干旱21天后復水，2天后統(tǒng)計失水率)，拍照。以正常澆水為對照。將野生型和不同的Ihcb突變體，每次每個樣取5株葉片進行實驗(選取四周齡未抽薹植株上的發(fā)育成熟的葉片，放在稱量紙上， 每隔Ih稱重一次，計算出葉片失水率。公式應為(Oh重量-Ih重量)/Oh重量))離體葉片的失水速率。待測植物為野生型擬南芥Col、突變體lhcb6。結果如圖3C-3D，正常生長野生型擬南芥Col和突變體lh(A2無顯著差異(3C)，干旱脅迫后野生型擬南芥Col生長較好、突變體lh(A2基本枯萎(3D)。失水率的結果如圖4G所示，可以看出，Lhcb4 在 ABA 處理 l、2、3、4、5、6h 的失水率分別為 18%,30%,46%,55%,70% ；col 在 ABA 處理 l、2、3、4、5、6h 的失水率分別為 12% ,24% ,34% ,44% ,54% 研究發(fā)現(xiàn)Ihcb突變體的離體葉片在干燥的條件下同等時間失水更多。這可能是由于這些突變體在氣孔運動方面對ABA脫敏引起的。同時，發(fā)現(xiàn)Ihcb突變體在正常澆水條件下生長狀態(tài)與野生型一致，而在干旱條件下，突變體的保水能力低于野生型。4、Ihcbs突變體的互補擬南芥在種子萌發(fā)、幼苗生長及耐旱的研究1)種子萌發(fā)、根長Lhcb4*代表LHCB4基因的互補株系(獲得方法如上所示)。將lbcb4*和col在1 μ M的ABA培養(yǎng)基上春化后48小時后，統(tǒng)計種子萌發(fā)率。將lbcb4*和col在1 μ M的ABA培養(yǎng)基上春化后12天后，統(tǒng)計根長。結果如圖5Α所示，col、lbcb4*在1 μ M的ABA培養(yǎng)基上春化后48小時的萌發(fā)率分別為32 %、M %，可以看出lhcb4突變體在種子萌發(fā)方面對ABA脫敏的表型是由于LHCB4 基因表達量降低引起的。col、lbcb4*在ΙμΜ的ABA培養(yǎng)基上春化后12天的根長(主根長度)分別為 2. 5mm、1. 8mm，可以看出lhcb4突變體在幼苗生長方面對ABA脫敏的表型是由于LHCB4基因表達量降低引起的。2)耐旱(氣孔開度)將lbcb4*和col按照上述方法進行誘導氣孔關閉及抑制氣孔開放實驗，在0 μ M ABA 0小時記錄初始氣孔開度，ΟμΜ或20μΜ ABA處理2. 5小時后再記錄氣孔開度。每一個數(shù)值都是五次獨立生物學重復的平均。每次重復記錄60個氣孔的開度。字母相同表示 (在P < 0. 05差異水平)沒有顯著差異，字母不同表示有顯著差異。結果如5Β所示，ABA誘導氣孔關閉為上圖，抑制氣孔開放為下圖，col和lbcb4*在0 μ M的ABA培養(yǎng)基上處理后0小時的誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為6. 0 μ m、5. 6 μ m，可以看出本實驗中野生型與轉基因株系初始狀態(tài)相同。col和lbcb4*在O μ M的ABA培養(yǎng)基上處理后O小時的抑制氣孔開放的氣孔開度分別為1. O μ m、0. 9 μ m，可以看出本實驗中野生型與轉基因株系初始狀態(tài)相同。col和lbcb4*在O μ M的ABA培養(yǎng)基上處理后2. 5小時的誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為5. 1 μ m、5. 1 μ m，可以看出實驗中，以水作為負對照處理野生型與轉基因株系，其表型一致。。col和lbcb4*在O μ M的ABA培養(yǎng)基上處理后2. 5小時的抑制氣孔開放的氣孔開度分別為5. 5 μ m、6. O μ m，可以看出本實驗中，以水作為負對照處理野生型與轉基因株系，
其表型一致。col和lbcb4*在20 μ M的ABA培養(yǎng)基上處理后2. 5小時的誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為3. 2 μ m、2. 8 μ m，可以看出在ABA處理后，轉基因株系基本恢復lhcb4突變體在氣孔運動方面對ABA脫敏的表型，說明lhcb4突變體對ABA脫敏的表型是由于LHCB4基因表達量降低引起的。col和lbcb4*在20 μ M的ABA培養(yǎng)基上處理后2. 5小時的抑制氣孔開放的氣孔開
15度分別為2. 4 μ m、2. 2 μ m，可以看出在ABA處理后，轉基因株系基本恢復lhcb4突變體在氣孔運動方面對ABA脫敏的表型，說明lhcb4突變體對ABA脫敏的表型是由于LHCB4基因表達量降低引起的。實施例2、LHCB4基因的表達由ABAR-WRKY40信號通路調節(jié)一、LHCB4基因的正常表達需要ABA的參與為了檢測ABA對LHCB4的表達是否是必須的，利用ABA缺陷突變體aba2進行實驗。LHCB4的mRNA的表達檢測方法三天的aba2幼苗移到不含或含有(1_60 μ Μ) ABA 的培養(yǎng)基上，繼續(xù)生長兩周后取樣，進行熒光定量PCR ；LHCB4 forward primer 5' -CAGCCGTACACTGAAGTCTTTGG-3‘ reverse primer 5，-TTCTATCCATATCAACGTCGTCAAC-3，，內參為 β-Actin、內參的引物為 forward primer 5’ -GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3‘ reverse primer 5’ -AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’ ；檢測LHCB4的表達水平，以野生型擬南芥(col)為對照。每組數(shù)據(jù)都是三次獨立的生物學重復的平均值。結果如圖6A所示，可以看出，ABA合成突變體aba2中，LHCB4的表達是被調低的(aba2-ABA)，ABA處理后能夠使ABA合成突變體aba2中的LHCB4的表達得到恢復 (aba2+ABA)，但是當ABA濃度高于40 μ M時出現(xiàn)抑制作用。LHCB4蛋白表達的檢測方法三天的aba2幼苗移到含有(0，1，3，5，10，20，40， and60 μ M) ABA的培養(yǎng)基上，繼續(xù)生長兩周后取樣，提取總蛋白，進行Wfestern blot檢測(抗體為特異抗體購自 Agrisera(Stockholm, Sweden ；website :www. agrisera. com ；product No. AS01045)，結果如圖6B所示，Western blot條帶濃度表示蛋白相對表達量。條帶下面的數(shù)值代表蛋白表達的相對水平。設定Col中LHCB蛋白量為100，突變體中LHCB蛋白量與之相比進行量化。Actin為上樣對照，實驗三次重復得到相似的結果。從上述可以看出，LHCB4的mRNA和蛋白表達量在aba2突變體中均低于野生型。 ABA的處理可以恢復各個LHCB成員在aba2突變體中的表達水平，但是較高濃度的ABA處理(> 20or > 40 μ M 處理 LHCBmRNAs ； > 20 μ M 處理除 LHCB5 蛋白的 LHCB 蛋白> 40 μ Μ) mRNA和蛋白水平在突變體中的表達均開始下降(圖6A，6B)。這些實驗結果表明LHCB4在轉錄和翻譯水平的正常表達需要ABA的參與。值得注意的是，在aba2突變體中，LHCB4對于ABA的響應在蛋白水平與mRNA水平完全一致(圖6A，6B)。然而，在aba2突變體中，刺激LHCB表達的最高濃度是野生型實驗體系中的三倍。三、WRKY40轉錄因子與LHCB家族成員的啟動子結合并抑制其表達嘗試研究直接作用于ABAR下游的一個關鍵轉錄抑制子——WRKY40轉錄因子是否能直接與LHCB的啟動子區(qū)域結合而調節(jié)LHCB的表達。1、通過染色質免疫共沉淀實驗的PCR和實時熒光定量PCR具體實驗見下述的圖7A-7D所示，圖7A為LHCB2基因啟動子的結構:ffn(ffl, W2,…)代表從左到右ff-box的順序及它們相對于起始密碼子(ATG)的位置。紅線代表CHIP分析(圖7B)中檢測的序列片段。 箭頭代表凝膠阻滯分析中所用的序列片段，同一片段用相同顏色的兩個箭頭表示，Pl, P2… 代表所選片段的數(shù)目。
圖7B為WRKY40與LHCB2基因的啟動子互作具體方法用WRKY40的N端特異抗體(WRKY40的N端的為genbank號CP0(^684的第21-131位核苷酸，WRKY40的核苷酸序列為序列表的序列5，氨基酸序列為序列表中的序列 4)進行 CHIP 分析的 PCR 電泳檢測結果(Saleh A, Alvarez-Venegas R,Avramova Z (2008) An efficient chromatin immunoprecipitation(ChIP)protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc 3 1081-1025 ；Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Ζ, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, ZhangD-P(2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935)。實驗材料為野生型擬南芥的兩周齡苗。為了檢測WRKY40與LHCB啟動子的結合活性，參照(Mukhopadhyay A,Deplancke B,Walhout AJM,Tissenbaum HA(2008). Chromatin immunoprecipitation(ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc 3 :698-709 ；Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Ζ, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, JiangT, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010) The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935)方法，以 Actin2的3’非翻譯區(qū)序列為內參對照進行實時定量PCR檢測。內參引物Actin2:forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer :5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，啟動子片段的序列在(圖7A)中標示。結果如圖7B所示，iInput'泳道野生型擬南芥兩周齡苗的基因組DNA為模板，擴增的PCR產物；‘control’泳道免疫前血清(來源于抗體制作公司)得到的DNA為模板，擴增的PCR產物；‘LHCB-p’泳道:WRKY40N端特異抗體沉淀得到的DNA為模板，擴增的PCR產物(測序為序列表中的序列6的自5’末端第 5-201位核苷酸)。pLHCB4 forward primer :5，-CTTTCGGCGTTGACCCATC-3，reverse primer :5，-CATTATATTAGTTAGGGCGATTT-3，可以看出，WRKY40與LHCBl基因的啟動子結合。圖7C為WRKY40與LHCB2基因的啟動子互作用WRKY40的N端特異抗體進行CHIP 分析的熒光定量PCR，結果如7C所示，Actin啟動子(Actin-p)(以Actin2的3，非翻譯區(qū)序列為內參對照進行實時定量PCR的產物)為負對照。可以看出，LHCB4基因的啟動子(LHCB4_p)與WRKY40結合的結合率為12. O。每組數(shù)據(jù)都是三次獨立的生物學重復的平均值。顯示，WRKY40與LHCB基因的啟動子結合。圖8C為檢測野生型擬南芥(Col)、突變體wrky40、雙突變體wrky40/18的LHCB4 的mRNA表達和蛋白表達實時定量PCR檢測野生型擬南芥(Col)、突變體wrky40、雙突變體wrky40/18 的 LHCB4 的 mRNA 水平表達，LHCB4 forward primer :5，-CAGCCGTACACTGAAGTCT TTGG-3，reverseprimer :5，-TTCTATCCATATCAACGTCGTCAAC-3，，內參為 β -Actin、內參的引物為 forwardprimer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer5' -AACGACCTTAAT CTTCATGCTGC-3’。免疫印跡檢測蛋白水平的表達，Actin為上樣對照擬南芥總蛋白提取方法參照 LHCB抗體供應商Agrisera建議的方案進行，SDS-PAGE和免疫印跡檢測參照Siang Y，Yan L, LiuZQ, CaoZ, Mei C, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKYtranscription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell22 :1909_1935。上述結果如圖8C所示，方框中的數(shù)值代表蛋白的相對表達水平。設定Col (野生型擬南芥)中LHCB蛋白量為標準，突變體中LHCB蛋白量與之相比進行量化。免疫印跡分析進行三次獨立生物學重復，得到類似的結果。RT-PCR的每組數(shù)據(jù)是三次獨立生物學重復的平均值。可以看出，在wrky40單突變體和wrky40wrkyl8雙突變體中，LHCB4的表達量顯著提高，LHCB4蛋白表達量在wrky40單突變體中顯著提高。然而，在wrky40wrkyl8雙突變體中，LHCB4表達量沒有顯著變化。綜上所述，以上實驗結果表明，WRKY40和WRKY18共同抑制LHCB基因表達。為了研究ABA對LHCB表達的刺激作用在一定程度上依賴于ABAR和WRKY40的功能，進行如下實驗將cch、wrky40、col生長三天的幼苗分別移至含0、1、3、5 μ M ABA的培養(yǎng)基上繼續(xù)生長兩周后取樣檢測 LHCB4 forward primer :5，-CAGCCGTACACTGAAGTCTT TGG-3' reverse primer :5， -TTCTATCCATATCAACGTCGTCAAC-3，，內參為 β -Actin、內參的弓丨物為 forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，reverse primer 5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，，Actin為上樣對照。實驗重復三次，結果一致。結果圖8D和8E所示，其中，8D左側圖所示，cch和野生型擬南芥相比，cch的LHCB4( ‘*’標出)在蛋白水平的只有輕微升高。圖8D右側圖所示，cch和wrky40相比，LHCB4的蛋白表達不受影響。根據(jù)免疫印跡條帶的濃度對蛋白表達量進行估計，以不進行ABA處理的野生型中的表達量為標準參照(柱形圖中紅色箭頭所示)。結果如圖8E所示，在1，3，5μΜ的ABA對 LHCB4表達的刺激作用，在cch和wrky40突變體中顯著低于野生型中。數(shù)據(jù)為三次獨立生物學重復的平均值。Cch 在 O、1、3、5 μ M 的 ABA 處理下 LHCB4 相對表達量為 30,40,40,55,wrky40突變體在0、1、3、5 μ M的ABA處理下LHCB4相對表達量為340、310、310、 310，col 在 0、1、3、5μΜ 的 ABA 處理下 LHCB4 相對表達量為 100、400、300、150。
三、ABAR和WRKY40的突變體影響ABA對LHCB表達的調控 將abar-3突變體(ABAR等位基因的單點突變體，Shang Y，Yan L，LiuZQ, CaoZ, MeiC, Xin Q, Wu FQ, Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL, Liu R, Yu YT, Zhang D-P (2010)The Mg-chelatase H subunit antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ΑΒΑ-responsive genes of inhibition. Plant Cell 22 :1909-1935, ABAR的突變體，公眾可從清華大學獲得。)在濃度為0 μ M的ABA培養(yǎng)基中處理2周時間，取樣通過熒光定量PCR和免疫印跡檢測(檢測方法同上)LHCB基因mRNA 和蛋白水平的表達，免疫印跡以Actin為上樣對照。蛋白條帶下方框內的數(shù)值代表LHCB蛋白的相對表達量。以Actin條帶為標準。免疫印跡三次生物學重復，結果一致。每一個數(shù)值都是三次獨立生物學重復的平均值。結果如圖9所示，col的LHCB4基因mRNA相對表達量為1. O ；abar-3突變體的LHCB4基因mRNA相對表達量為0. 5 ；結合上述LHCB家族成員的蛋白水平在低濃度ABA(1，3或5μΜ)處理下表達量提高，但是在cch和wrky40突變體中LHCB3，LHCB4和LHCB4響應ABA的能力顯著地下降的結果，表明ABA通過ABAR-WRKY40介導的信號通路促進LHCB的表達。四、ABAR和LHCB基因的雙突變體具有對ABA脫敏的表型，cch突變體中過表達 LHCB6基因可以部分恢復其對ABA的脫敏表型Mf 雙突變體 lhcbl lhcb3，lhcbl lhcb6、lhcbl cch、lhcb3 cch、lhcb4 cch、lhcb6 cch(雙突變體構建方法將lhcbl未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下IhcM 中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F(xiàn)2代生長，經PCR 鑒定可得到純合體；雙突變體構建方法將lhcbl未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下lhcb6中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F(xiàn)2代生長，經PCR鑒定可得到純合體；雙突變體構建方法將lhcbl未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下cch中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在lhcbl雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種， F2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)和野生型Col提取RNA和蛋白質，通過熒光定量PCR 和免疫印跡檢測(檢測方法同上)LHCB基因mRNA和蛋白水平的表達，免疫印跡以Actin為上樣對照。蛋白條帶下方框內的數(shù)值代表LHCB蛋白的相對表達量。取樣處理，結果如圖10 所示圖IOA為雙突變體lhcbl lhcb3，lhcbl lhcb6中不同LHCB基因的表達，圖IOB為雙突變體 lhcbl cch、lhcb3 cch、lhcb4 cch、lhcb6 cch 中不同 LHCB 基因的表達。mRNA水平的表達通過熒光定量PCR檢測(圖10A，IOB中的柱形圖)，蛋白水平表達通過免疫印跡檢測，Actin為上樣對照。圖10A中蛋白條帶下面的數(shù)值表示LHCB蛋白的相對表達量，以野生型為標準進行比較量化。六個LHCB (LHCB1-LHCB6) 的表達在cch突變體(圖10B)及所有雙突變體(10A，10B)中都做了檢測。免疫印跡分析三次獨立生物學重復，結果相似。熒光定量PCR的每一個數(shù)值都是三次獨立生物學重復的平均值。為了研究ABAR與LHCBs基因在遺傳學的上下游關系，以cch-lhcbs雙突變體 lhcblcch, lhcb3 cch, lhcb4 cch，和lhcb6 cch為對象研究其響應ABA的表型。cch突變體中，LHCB基因表達量顯著下降(圖10B)。然而，單個LHCB下調的突變體(lhcbl，lhcb4，
19或lhcb6)與cch雜交后得到的雙突變體與cch單突變體相較，LHCB家族基因含量并沒有顯著下調，反而促進了其他LHCB家族成員的表達。LHCB3敲除突變體與cch突變體雜交后得到的雙突變體中，LHCB3基因被敲除，但是LHCB2，LHCB4, LHCB6基因的mRNA被調高，LHCB4 蛋白水平表達被調高(圖10B)。這些數(shù)據(jù)說明在雙突變體中有一套復雜的反饋調節(jié)機制來維持LHCB基因家族整體的穩(wěn)定性。五、調低或敲除LHCB基因影響活性氧的穩(wěn)態(tài)和一系列參與ABA信號通路的基因和響應ABA的基因的表達1、影響活性氧的穩(wěn)態(tài)眾所周知，活性氧(ROS)參與ABA信號轉導過程(Pei et al,2000 ；Murata et al,2001 ；Mustilli et al,2002 ；Kwak et al,2006 ；Miao et al,2006 ；Zhang et al, 2009)，并且在植物細胞中ROS主要產生于葉綠體中(Kwak et al，2006 ；Nott et al,2006 ； Galvez-Valdivieso和Mullineaux，2010)。葉綠體內，ROS的產生主要與光吸收和電子傳遞有關,而LHCB也在這兩個過程中起到重要作用(Jansson，1994，1999 ；Galvez-Valdivieso 和 Mullineaux，2010)。因此，檢測lhcb4突變體中ROS的含量。葉片取自土壤中生長三周的野生型擬南芥植株，在50mMKCl，IOmMMes-Tris (pH 6.15)并含有不同濃度的ABA的緩沖液中，置于200umol n^sec—1光照下預處理lh。然后將緩沖液中加入0. lmg/mL NBT(溶于IOOmM磷酸鉀溶液)并抽真空滲透使葉子染色 (Amresco, Solon, OH, USA)。樣品在室溫黑暗放置2h.然后移入80 %乙醇，沸水浴處理 IOmin,以去除葉綠素的干擾。保衛(wèi)細胞中ROS含量的檢測利用H2DCF-DA(SIGMA，D6883)浸染剝落的葉片表皮條，方法參照Miao Y,Lv D,ffang P,Wang XC,Chen J,Miao C,Song CP(2006)An Arabidopsis glutathione peroxidase functions as both a redox transducer and a scavenger in abscisic acid and drought stress responses. Plant Cell 18 :2749_2766。在含有O (相同體積乙醇作為對照)或者5μΜ(士)-ABAMES-Tris緩沖液(同上文)中預處理表皮條，促進氣孔張開。然后將表皮條浸入50mMTris-KCl (pH 7. 2)包含50mM H2DCF-DA的緩沖液中黑暗處理20分鐘。利用MES-Tris緩沖液漂洗樣品，去除多余的染料。利用fluorescence microscopy (Olympus, BX51, Japan)檢測表皮條中的熒光。ROS浸染熒光按一下參數(shù)觀察 激發(fā)光，488nm ；透射光，525nm。實驗結果如圖11所示，圖IlA為NBT染色檢測不同濃度ABA(野生型col 0-50 μ Μ, lhcb6突變體中0-10 μ Μ)處理野生型和Ihcbs突變體葉片后ROS的產生。實驗重復三次得到相似的結果。圖IlB為圖IlA中ROS產生的量化。通過掃描染色亮度進行估計，將野生型中ROS 的染色濃度定為100%，其他與之相比進行量化。結果為lhcb4 在 O、5、10、50 μ MABA 處理下的 ROS 量為 200%,60%,50% ；col 在 0、5、10、50μΜΑΒΑ 處理下的 ROS 量為 100%, 150%, 100%, 50% ；圖IlC為5μ M ABA處理野生型和不同Ihcb突變體的表皮條，通過H2DCF-DA染色觀察保衛(wèi)細胞中的ROS產生情況。實驗三次重復得到類似的結果。圖IlD為實時定量PCR檢測Ihcbs突變體中一系列ABA響應基因的表達。每組數(shù)據(jù)都是三次獨立生物學重復的平均值。從上述可以看出，Ihcb突變體中ROS的含量高于野生型植株，這在葉片和保衛(wèi)細胞中都有體現(xiàn)(圖IlA至C)。發(fā)現(xiàn)用較低濃度(1至5 μ M)的ABA處理葉片會促進ROS的產生。這與以前的研究結果一致(Pei et al,2000 ；Murata et al，2001 ；Mustilli et al, 2002 ；Kwak et al，2006 ；Miao et al，2006 ；Zhang et al，2009)；而用較高濃度(10 μ M)的 ABA處理就不再有促進效應甚至會降低ROS的含量(50 μ Μ)(圖11Α)。然而在Ihcb突變體中，用較低濃度ABA處理植株，不論是完整的葉片(1至10 μ M ΑΒΑ，圖IlA和圖11Β)還是保衛(wèi)細胞內(5 μ M ABA處理，圖11C)的ROS含量都下降。這些實驗結果表明調低或敲除LHCB 基因都將影響植物細胞內ROS的穩(wěn)態(tài)和ROS對ABA的響應。2、調低或敲除LHCB基因影響一系列參與ABA信號通路的基因和響應ABA的基因的表達采用熒光定量檢測了 Ihcb突變體1-6中下列參與ABA信號通路基因及ABA響應基因的表達ABF1，ABF2/AREB1, ABF3, ABF4/AREB2 (Choi et al，2000 ；Uno et al，2000)， ABIl(Leunget al,1994 ；Meyer et al,1994 ；Gosti et al,1999), ABI2 (Leung et al, 1997), ABI3(Giraudat et al，1992)，ABI4(Finkelstein et al，1998)，ABI5 (Finkelstein and Lynch, 2000), ERDlO (Kiyosue et al，1994)，KINl 禾口 KIN2 (Kurkela and Borg-Franck, 1992)，MYB2 和 MYC2 (Abe et al，2003)，OSTl (Mustilli et al，2002)，RAB18 (Lang and Palva, 1992), RD29A (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，1994)。引物如下
ABFl(Atlg49720)
forward primer :5，-TCAACAACTTAGGCGGCGATAC-3’
reverse primer :5，-GCAACCGAAGATGTAGTAGTCA-3’
ABF2 (Atlg45249)
forward primer :5，-TTGGGGAATGAGCCACCAGGAG-3’
reverse primer :5，-GACCCAAAATCTTTCCCTACAC-3’
ABF3(At4g34000)
forward primer :5，-CTTTGTTGATGGTGTGAGTGAG-3’
reverse primer :5，-GTGTTTCCACTATTACCATTGC-3’
ABF4(At3gl9290)
forward primer :5，-AACAACTTAGGAGGTGGTGGTC-3’
reverse primer :5，-CTTCAGGAGTTCATCCATGTTC-3’
ABIl(At4g26080)
forward primer :5，-AGAGTGTGCCTTTGTATGGTTTTA-3’
reverse primer :5，-CATCCTCTCTCTACAATAGTTCGCT-3
ABI2(At5g57050)
forward primer :5，-GATGGAAGATTCTGTCTCAACGATT-3
reverse primer :5，-GTTTCTCCTTCACTATCTCCTCCG-3’
ABI3(At3g24650)
forward primer :5，-TCCATTAGACAGCAGTCAAGGTTT-3'
reverse primer5，-GGTGTCAAAGAACTCGTTGCTATC-3，
ABI4(At2g40220)
forward primer5，-GGGCAGGAACAAGGAGGAAGTG-3，
reverse primer5，-ACGGCGGTGGATGAGTTATTGAT-3，
ABI5(At2g36270)
forward primer5，-CAATAAGAGAGGGATAGCGAACGAG-3，
reverse primer5，-CGTCCATTGCTGTCTCCTCCA-3’
ERDlO(Atlg20450)
forward primer5，-TCTCTGAACCAGAGTCGTTT-3 ’
reverse primer5，-CTTCTTCTCACCGTCTTCAC-3，
KINl(At5gl5960)
forward primer5，-ACCAACAAGAATGCCTTCCA-3’
reverse primer5，-CCGCATCCGATACACTCTTT-3 ’
KIN2(At5gl5970)
forward primer5，-ACCAACAAGAATGCCTTCCA-3’
reverse primer5，-ACTGCCGCATCCGATATACT-3 ’
MYB2(At2g47190)
forward primer5，-TGCTCGTTGGAACCACATCG-3’
reverse primer5，-ACCACCTATTGCCCCAAAGAGA-3，
MYC2(Atlg32640)
forward primer5，-TCATACGACGGTTGCCAGAA-3 ’
reverse primer5，-AGCAACGTTTACAAGCTTTGATTG-3，
OSTl (At4g33950)
forward primer5，-TGGAGTTGCGAGATTGATGAGAG-3，
reverse primer5，-CCTGTGGTTGATTATCTCCCTTTTT-3，
RAB18(At5g66400)
forward primer5，-CAGCAGCAGTATGACGAGTA-3 ’
reverse primer5，-CAGTTCCAAAGCCTTCAGTC-3’
RD29A(At5g52310)
forward primer5，-ATCACTTGGCTCCACTGTTGTTC-3，
reverse primer5，-ACAAAACACACATAAACATCCAAAGT-3，
結果如圖IlD所示，其中十個重要的基因:ABI4, ABI5, ERD10, KIN1, KIN2, MYB2,
MYC2，OST1, RAB18和RD29A在Ihcb突變體中的表達被顯著抑制。所有這些被抑制的基因都是正響應ABA的基因或編碼ABA信號通路的正調節(jié)子。三個編碼重要轉錄因子——ABA 信號通路的正調節(jié)子的基因，ABFl, ABF4和ABI3，在lhcb2，lhcb4，lhcb5突變體中也被顯著抑制。ABFl和ABF4在lhcb6突變體中的表達并沒有明顯變化，ABI3的表達在Ihcbl和 lhcb3突變體中也沒有顯著變化(圖11D)。然而，ABIl和ABI2這兩個直接作用于ABA受體PYR/PYL/RCAR(Fujii et al，2009)下游的，編碼ABA信號通路負調節(jié)子的基因，在Ihcb 突變體中的表達量并沒有顯著變化(圖11D)。相反地，ABF2和ABF3這兩個編碼ABA信號通路正調節(jié)子的基因在除lh(A5和lhcb6以外的Ihcb突變體中表達量上調，在lh(A5和 lhcb6突變體中，ABF2和ABF3基因表達量沒有明顯變化(圖11D)。這些ABA信號轉導過程相關基因的表達量變化從根本上說明LHCB基因ABA信號的正調節(jié)子，但是這其中有一個潛在的復雜機制。六、調低或者敲除LHCB基因部分抑制wrky40突變體對ABA敏感的表型1、蛋白表達盒萌發(fā)速率將 wrky401hcbl> wrky401hcb3> wrky401hcb6 突變體(wrky40Ihcbl 雙突變體構建方法將Ihcbl未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下wrky40中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F(xiàn)2代生長，經PCR鑒定可得到純合體； wrky401hcb3雙突變體構建方法將lhcb3未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下 wrky40中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F(xiàn)2代生長， 經PCR鑒定可得到純合體；wrky401hcb6雙突變體構建方法將lhcb6未開花的花苞用鑷子去除其雄蕊僅剩雌蕊，取下wrky40中開花或未開花的花苞中的雄蕊，在剝離剩余的雌蕊柱頭上摩擦，使花粉充分接觸柱頭，將此雌蕊做標記，莢果成熟后得到雜交Fl代種子，將Fl代種子再次播種，F(xiàn)2代生長，經PCR鑒定可得到純合體)、wrky40和野生型Col提取RNA和蛋白質，通過熒光定量PCR和免疫印跡檢測(檢測方法同上)LHCB6基因mRNA和蛋白水平的表達，免疫印跡以Actin為上樣對照。蛋白條帶下方框內的數(shù)值代表LHCB蛋白的相對表達量，檢測(檢測方法同前)春化后72小時后LHCB6的mRNA的表達和LHCB6的蛋白表達，并統(tǒng)計春化后72小時的萌發(fā)速率。以col為對照。結果如圖12A所示，wrky401hcbl在0、0. 5、1、3μΜΑΒΑ培養(yǎng)基上的萌發(fā)速率為 100%,80%,72%,45% ；wrky401hcb3 在 0、0. 5、1、3μΜΑΒΑ 培養(yǎng)基上的萌發(fā)速率為 100 %、85 %、65 %、 50% ；wrky401hcb6突變體在0、0. 5、1、3 μ MABA培養(yǎng)基上的萌發(fā)速率為100%、80%、 62%,47% ；wrky40 在 0、0. 5、1、3μΜΑΒΑ 培養(yǎng)基上的萌發(fā)速率為 100%、75%、50%、25% ；col 的在 0、0. 5、1、3μΜΑΒΑ 培養(yǎng)基上的萌發(fā)速率為 100%、100%、90%、59% ；可以看出，雙突變體可以顯著抑制wrky40突變體在ABA抑制種子萌發(fā)。2、LHCBl，LHCB3, LHCB6表達量降低使wrky40突變體在萌發(fā)后生長方面對ABA的敏感性減弱將 wrky401hcbl、wrky401hcb3、wrky401hcb6 突變體、wrky40 種子直接播種在不含或含(0.6 μ M) ABA的培養(yǎng)基上生長9天后的結果。結果如圖12Β所示，下面的柱形圖顯示了在含有0.6μΜ ABA的培養(yǎng)基上生長9天后，野生型和突變體主根伸長長度；wrky40Ihcbl的主根伸長長度為0. 58cm ；wrky401hcb3的主根伸長長度為0. 58cm ；wrky401hcb6突變體的主根伸長長度為0. 58cm ；
wrky40的主根伸長長度為0. 34cm ；col的主根伸長長度為1. 00cm。3、在ABA誘導氣孔關閉(上)及ABA抑制氣孔開放方面，LHCB1, LHCB3, LHCB6表達量降低不影響wrky40突變體對ABA的響應將 wrky401hcbl> wrky401hcb3、wrky401hcb6 突變體、wrky40 種子直接播種在含 (0. 6 μ Μ) ABA的培養(yǎng)基上生長9天后的結果。結果如圖12C所示，wrky40Ihcbl 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ΑΒΑ 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為6. 0 μ m、5. 9 μ m、2. 5 μ m、0. 9 μ m ；wrky401hcb3 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為5. 7 μ m、5. 9 μ m、2. 0 μ m、1. 0 μ m ；wrky401hcb6 在 ΟμΜ ABA 處理 ΟΚΟμΜ ΑΒΑ 處理 2. 5h、20 μ M ΑΒΑ 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為6. O μ m、5. 9 μ m、2. 5 μ m、1. O μ m ；wrky40 在 O μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理2. 5h誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為5. 9 μ m、5. 9 μ m、2. 7 μ m、0. 8 μ m ；col 在 O μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理2. 5h誘導氣孔關閉的氣孔開度分別為6. O μ m、6. O μ m、2. 3 μ m、1. O μ m ；wrky40Ihcbl 在 O μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h抑制氣孔開放的氣孔開度分別為0. 8 μ m、6. O μ m、3. O μ m、l. O μ m ；wrky401hcb3 在 O μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的抑制氣孔開放，氣孔開度分別為0. 8 μ m、5. 8 μ m、3. 0 μ m、1. 2 μ m ；wrky401hcb6 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、 30 μ MABA處理2. 5h的抑制氣孔開放氣孔開度分別為0. 8 μ m、5. 6 μ m、3. 0 μ m、l. 0 μ m ；wrky40 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理2. 5h的抑制氣孔開放氣孔開度分別為0. 6 μ m、5. 8 μ m、2. 8 μ m、l. 2 μ m ；col 在 0 μ M ABA 處理 0h、0 μ M ABA 處理 2. 5h、20 μ M ABA 處理 2. 5h、30 μ MABA 處理2. 5h的抑制氣孔開放氣孔開度分別為0. 8 μ m、5. 7 μ m、2. 9 μ m、l. 0 μ m ；1-3每組數(shù)據(jù)為三次獨立生物學重復的平均值。以前的實驗結果證明wrky40突變體在ABA抑制種子萌發(fā)、抑制幼苗生長方面表現(xiàn)出對ABA敏感的表型，但是在ABA誘導的氣孔關閉與ABA抑制氣孔開放方面未表現(xiàn)出響應 ABA的表型。將lhcbl、lhcb3、lhcb6突變體分別與wrky40突變體雜交發(fā)現(xiàn)，雙突變體可以顯著抑制wrky40突變體在ABA抑制種子萌發(fā)和幼苗生長方面對于ABA敏感的表型(圖 12A，12B)；但是對于wrky40突變體在響應ABA誘導的氣孔關閉和ABA抑制氣孔開放方面的表型并沒有改變(圖12C)。這可能是因為WRKY40參與的ABA信號通路在調節(jié)氣孔運動方面有一套復雜的機制引起的，在這個過程中WRKY40功能的缺失可能會導致ABA信號通路復雜的效應。然而，這些數(shù)據(jù)提供了足夠的遺傳學證據(jù)表明LHCB作用于WRKY40轉錄因子的下游，與LHCB基因是WRKY40轉錄抑制子的直接靶基因結果一致。七、突變體lhcbl-6的分子和生化鑒定圖 13 (A-F) LHCB1-6 的 T-DNA 插入示意圖.A，lhcbl-1 (salk-134810)；B, lhcb2(salk-005614) ；C, lhcb3(salk-036200) ；D, lhcb4(salk-032779) ；Ε, lhcb5(salk-139667) ；F, lhcb6 (salk-074622). LP 和 RP 分別是鑒定 Ihcbs 用的基因組上左端引物和右端引物；LBal, T-DNA序列左端引物；RBal, T-DNA序列右端引物；T-DNAl和 T-DNAn分別代表插入的同一位點插入的第一個拷貝和最后一個拷貝(一個以上拷貝反向串聯(lián)插入)。圖13 (A)在LHCBl中，單拷貝的T-DNA序列插入到LHCBl基因的promoter區(qū)，具體的插入位置在啟始密碼子ATG上游-592nt和_523nt之間，插入導致70bp缺失；圖13(B)在LHCB2中，T-DNA序列插入到LHCB2基因的啟動子區(qū)，具體的插入位置在啟始密碼子ATG上游-102nt和之間，插入導致Mbp的缺失；圖13(C)LHCB3中，T-DNA序列插入到LHCB3基因的第一個外顯子區(qū)，具體的插入位置在啟始密碼子ATG下游120nt和125nt之間，插入導致6bp的缺失；圖13(D)LHCB4中，T-DNA序列以反向串聯(lián)的方式插入到LHCB4基因的promoter 區(qū)，具體的插入位置在啟始密碼子ATG上游-1263nt和-1247nt之間，插入導致17bp的缺失；圖13(E)LHCB5中，T-DNA序列插入到LHCB5基因的promoter區(qū)，具體插入位置在啟始密碼子ATG上游-483nt和_477nt之間，插入導致7bp的缺失；圖13(F)LHCB6中，T-DNA序列插入到LHCB6基因的promoter區(qū)，具體插入位置在啟始密碼子ATG上游-391nt和_346nt之間，插入導致46bp的缺失。圖13 (G) RT-PCR和western blot檢測突變體Ihcbl 6中LHCB的轉錄和翻譯水平。免疫印跡檢測以Actin為上樣對照。實時定量PCR的柱形圖，以野生型中相應基因的表達設為標準，突變體中的表達量為相對值，其中Ihcbl-I，lhcb2, hcb4, lhcb5, lhcb6 是被不同程度調低的，lhcb3是基因敲除突變體。Western blot檢測，方框中的數(shù)值代表蛋白表達的相對水平。設定Col中LHCB蛋白量為100，突變體中LHCB蛋白量與之相比進行量
化。該實驗重復三次，結果一致。圖13(H)突變體(lhcbl lhcb6)中葉綠素a/b含量沒有顯著受到影響。左圖 不同突變體中葉綠素a、葉綠素b及總的葉綠素含量。每一個數(shù)值都是三次獨立生物學重復的平均值。右圖不同突變體的幼苗生長狀態(tài)沒有葉綠素缺失的表型。八、不同Ihcb突變體中內源ABA含量及干物質含量測定分析材料為生長兩周的幼苗(野生型擬南芥col和突變體lhcb2)(A) ABA水平。試劑盒通過ELISA測定蓮座葉片中的ABA含量(Sigma試劑盒，Plant GrowthRegulator Immmunoassay DETECTION Kit)。(B)通過干重/鮮重估計干物質含量。結果如圖14所示，顯示突變體與野生型中的ABA及干物質含量沒有顯著差異。九、wrky40 及 wrky40wrkyl8 突變體沒有 gun 表型A、將野生型Col、cch, wrky40單突變體、wrky40wrkyl8雙突變體種子直接播在不含或含5yMNF(NF Aorflurazon，是一種除草劑，將它添加進培養(yǎng)基后，幼苗的質體發(fā)育被嚴重破壞，質體向細胞核發(fā)出質體-核逆向信號；而這個過程產生的突變體，即不受NF影響，細胞核能繼續(xù)編碼質體基因的表型為與核解偶聯(lián)的表型——GUN表型)的培養(yǎng)基上，春化三天后，放到100 μ Hi0InT2s-1光照下，進行M小時連續(xù)光照，6天后取樣熒光定量PCR檢
測。實驗重復三次得到同樣的結果。弓I 物 % LHCB4 forward primer 5' -CAGCCGTACACTGAAGTCTTTGG-3‘ re verse primer :5，-TTCTATCCATATCAACGTCGTCAAC-3，，內參為 β-Actin、內參的弓I ^ 為 forward primer 5' -GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3‘ reverse primer 5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，，結果如圖 15A 所示，在 wrky40 單突變體及 wrkywrkyl8 雙突變體中均檢測不到LHCBsmRNA的表達。B、將野生型Col、cch, wrky40單突變體種子直接播在不含或含5 μ MNF的培養(yǎng)基上，春化三天后，放到100 μ Hi0InT2s-1光照下，進行M小時連續(xù)光照，6天后取樣免疫印跡檢測。實驗重復三次得到同樣的結果。結果如圖15Β所示，與在野生型、wrky40及wrkywrkyl8突變體一樣，NF處理cch 后，LHCBs六個基因的表達均檢測不到，顯示了 GUN-type葉綠體反向信號的復雜性。所有這些結果表明wrky40和wrky40wrkyl8突變體是非gun突變體。從上述可以看出，LHCBs蛋白響應生理水平濃度ABA而增加的一個模式圖如圖16 所示，WRKY40轉錄因子抑制LHCB的表達，ABA促進WRKY40從細胞核進入細胞質，促進ABAR 與WRKY40互作，通過下調WRKY40的表達解除對LHCBs (LHCB1/2/3/4/5/6)基因的抑制作用。細胞質內合成的LHCB蛋白轉運到葉綠體以維持LHCB蛋白的穩(wěn)態(tài)，使植物適應環(huán)境的挑戰(zhàn)，LHCB蛋白的穩(wěn)態(tài)對ROS穩(wěn)態(tài)的建立是必需的。十、LHCB4在不同組織中的表達分別提取野生型擬南芥的不同組織的RNA，反轉錄得到cDNA，以forward primer 5‘-CAGCCGTACACTGAAGTCTTTGG-3 ‘ reverse primer 5，-TTCTATCCATATCAACGTCGTCAAC-3，為引物，內參β -Actin、內參的引物為 forward primer :5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，r everse primer5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，，熒光定量PCR檢測，結果如圖 17，LHCB4在野生型擬南芥的根、莖、葉、花、角果和種子中的mRNA相對表達量分別為0. 04,0. 40,0. 40、 0. 75,1. 75,0. 00。
權利要求
1.一種控制植物性狀的方法，是提高出發(fā)植物中LHCB4蛋白編碼基因的表達，得到具有下述1)或幻特征的目的植物1)耐逆性高于所述出發(fā)植物；2)生長延緩于所述出發(fā)植物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述目的植物生長延緩于所述出發(fā)植物為如下A或B A、所述目的植物種子的萌發(fā)遲于所述出發(fā)植物；B、所述目的植物根的生長遲于所述出發(fā)植物；所述提高出發(fā)植物中LHCB4蛋白編碼基因的表達是在激素脅迫下進行； 所述激素具體為ABA ；所述LHCB4蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于 所述耐逆性為耐干旱性；所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述提高出發(fā)植物中LHCB4蛋白編碼基因的表達是通過向出發(fā)植物中導入所述LHCB4 編碼基因實現(xiàn)的。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于 所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度低于200 μ Μ,所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度具體為 20 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Mo
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于 所述耐干旱性通過氣孔開度和/或失水率體現(xiàn)； 所述根生長通過主根長度體現(xiàn)。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述提高LHCB4蛋白編碼基因的表達是通過外源ABA激活ABAR-WRKY40信號通路實現(xiàn)。
8.根據(jù)權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述激活ABAR-WRKY40信號通路為外源的ABA激活植物的ABA受體，使ABA受體與結合有轉錄因子WRKY40的LHCB4啟動子競爭結合轉錄因子WRKY40，釋放LHCB4的啟動子，使 LHCB4蛋白編碼基因表達；所述ABA受體的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；所述ABA受體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述轉錄因子WRKY40的氨基酸序列為序列表中的序列4 ；所述轉錄因子WRKY40的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述LHCB4啟動子的核苷酸序列為序列表中的序列6。
9.一種控制植物性狀的方法，是降低目的植物中LHCB4蛋白編碼基因的表達，得到具有下述1)或幻特征的植物1)耐逆性低于所述目的植物；2)生長快于所述目的植物。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于 所述植物的生長快于所述出發(fā)植物為如下A或B A)所述植物的種子的萌發(fā)早于所述目的植物；B)所述植物的根的生長早于所述目的植物；所述降低目的植物中LHCB4蛋白編碼基因的表達是在激素脅迫下進行； 所述激素具體為ABA ；所述LHCB4蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1 ； 所述耐逆性為耐干旱性；所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥； 所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度低于200 μ Μ,所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度具體為 20μΜ、50μΜ、100μΜ、150μΜ、200μΜ、300μΜ ；所述耐干旱性具體通過氣孔開度和/或失水率體現(xiàn)； 所述根生長具體通過主根長度體現(xiàn)；所述降低LHCB4蛋白編碼基因的表達是通過外源ABA激活ABAR-WRKY40信號通路實現(xiàn)；所述激活ABAR-WRKY40信號通路具體為外源的ABA激活植物的ABA受體，使ABA受體與結合有轉錄因子WRKY40的LHCB4啟動子競爭結合轉錄因子WRKY40，釋放LHCB4的啟動子，使LHCB4蛋白編碼基因表達；所述ABA受體的氨基酸序列為序列表中的序列2 ；所述ABA受體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述轉錄因子WRKY40的氨基酸序列為序列表中的序列4 ；所述轉錄因子WRKY40的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述LHCB4啟動子的核苷酸序列為序列表中的序列6。
11.一種提高植物耐逆性或延緩植物生長的方法，包括如下步驟用ABA對植物進行脅迫，得到具有如下性狀的植物1)目的植物耐逆性高于出發(fā)植物；2)目的植物的生長延緩于出發(fā)植物；將處理前的植物記作出發(fā)植物，將處理后的植物記作目的植物。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其特征在于 所述ABA脅迫為在植物幼苗期或者植物成齡期進行；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度為0. 5-5 μ M ；所述在植物幼苗期ABA脅迫的濃度具體為 0. 5 μ Μ、1 μ Μ、2 μ Μ、3 μ Μ、或 5 μ M ；所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度低于200 μ Μ,所述在植物成齡期ABA脅迫的濃度具體為 20μΜ、50μΜ、100μΜ、150μΜ、200μΜ、300μΜ ；所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開捕光色素葉綠素a/b結合蛋白LHCB4在植物育種中的應用。本發(fā)明提供了LHCB4蛋白提高植物耐逆性中的應用。LHCB4蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1。所述提高植物耐逆性受激素脅迫。所述激素為ABA；所述LHCB4蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。所述提高植物耐逆性為如下1)或2)1)向LHCB4表達失活的突變體植物中導入LHCB4蛋白的編碼基因，得到LHCB4蛋白表達恢復的植物，所述LHCB4蛋白表達恢復的植物的耐逆性高于所述LHCB4蛋白表達失活的突變體；2)LHCB4蛋白表達失活的突變體的耐逆性高于LHCB4表達的植物。本發(fā)明的實驗證明，ABA調節(jié)LHCB4的表達是通過ABAR/CHLH參與的信號通路。
文檔編號A01H5/00GK102229953SQ20111014881
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月3日 優(yōu)先權日2011年6月3日
發(fā)明者嚴璐, 劉志強, 劉蕊, 張大鵬, 徐艷紅, 王小芳 申請人:清華大學