專利名稱：一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)免疫親魚(yú)母本提高卵子中免疫抗體的方法，尤其涉及一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法。
背景技術(shù)：
大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬硬骨魚(yú)類鰈形目(Pleuronectiformes)JlM 目(Pleuronectoidei)、鲆科(Bothidae)、菱鲆屬 Gcophthalmus)，英文名字為 turbot，俗稱歐洲比目魚(yú)，音譯名“多寶魚(yú)”。原產(chǎn)于大西洋東側(cè)沿岸，是歐洲名貴的冷水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。最適生長(zhǎng)溫度為14-17°C。大菱鲆在自然環(huán)境攝食習(xí)性為肉食性，幼魚(yú)期攝食甲殼類；成魚(yú)則捕食小魚(yú)、蝦等。大菱鲆雄性一年達(dá)到性成熟，雌魚(yú)二年達(dá)到性成熟，自然成熟期在每年5-8 月份。人工培養(yǎng)的親魚(yú)，在控溫、控光的條件下，全年都可獲得成熟的卵子，目前人工繁殖均采用人工授精方法。大菱鲆生長(zhǎng)迅速，從產(chǎn)卵孵化到養(yǎng)成商品魚(yú)出售(500克)僅需10-12月時(shí)間，當(dāng)年投資，當(dāng)年獲利受益，而且其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、餌料轉(zhuǎn)換率高、抗病力強(qiáng)、耗氧量低、適合高密度養(yǎng)殖。1992年，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所雷霽霖院士將大菱鲆引入我國(guó)，經(jīng)歷近10多年的產(chǎn)業(yè)化建設(shè)與發(fā)展之路，創(chuàng)造了“溫室大棚+深井海水”的工廠化養(yǎng)殖模式，使大菱鲆工廠化養(yǎng)殖迅速發(fā)展，成為我國(guó)海水養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。目前，鲆鰈類養(yǎng)殖不僅在我國(guó)北方沿海占據(jù)著顯要的產(chǎn)業(yè)地位，而且隨著工廠化養(yǎng)殖、網(wǎng)箱養(yǎng)殖、北南輪養(yǎng)等養(yǎng)殖模式的建立和養(yǎng)殖選育良種的增多，大菱鲆養(yǎng)殖已經(jīng)輻射到東南沿海，為我國(guó)的海水魚(yú)類養(yǎng)殖走向規(guī)?；凸I(yè)化奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。養(yǎng)殖過(guò)程中，大菱鲆早期發(fā)育階段受到水環(huán)境中多種病原菌的威脅，尤其是隨著現(xiàn)代集約化高密度養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，大菱鲆的病害問(wèn)題日益突出。在現(xiàn)有報(bào)道的海水魚(yú)類細(xì)菌病中，鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是其中危害最大的病原菌，而且大菱鲆對(duì)鰻弧菌尤其敏感。其病癥為快速的爆發(fā)性敗血癥及組織損傷，病魚(yú)常在2-3天內(nèi)死亡，弧菌病可能危害各發(fā)育期的大菱鲆，尤其是危害仔魚(yú)和稚魚(yú)，一旦幼魚(yú)發(fā)病，死亡接踵而至，死亡率可能高達(dá)50%以上。所以開(kāi)展針對(duì)大菱鲆鰻弧菌的防治工作非常迫切。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治主要有藥物防治、生態(tài)預(yù)防(微生態(tài)制劑)和免疫防控等方法，其中免疫防控優(yōu)勢(shì)最為顯著，在提高動(dòng)物體特異性免疫水平的同時(shí)亦能增強(qiáng)機(jī)體抗應(yīng)激的能力，并且符合環(huán)境友好、無(wú)藥物殘留的綠色環(huán)保要求。因此，采用免疫方式預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物疾病，越來(lái)越受到各界關(guān)注。關(guān)于大菱鲆鰻弧菌疫苗得研究和開(kāi)發(fā)都很廣泛，但都是針對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育完善的稚魚(yú)、成魚(yú)開(kāi)展，對(duì)早期苗種的直接免疫無(wú)法實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樵缙诿绶N存在免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的缺陷，實(shí)施免疫將無(wú)法引發(fā)免疫應(yīng)答，不能達(dá)到免疫效果，因此需要另辟新徑。動(dòng)物在早期發(fā)育階段具有從母體獲得免疫物質(zhì)，為其生長(zhǎng)發(fā)育提供免疫保護(hù)的生理現(xiàn)象，即母源免疫。學(xué)者們研究并嘗試應(yīng)用動(dòng)物母源免疫的這一途徑，通過(guò)對(duì)母體動(dòng)物免疫，提高母體內(nèi)的抗體水平，通過(guò)血液循環(huán)和滲透?jìng)鬟f，增強(qiáng)卵巢中抗體蛋白在卵子發(fā)育成熟階段的積累，進(jìn)而提高產(chǎn)出卵子中的抗體水平。這種具有高抗體水平的卵子在受精發(fā)育后，對(duì)環(huán)境病害的抵抗力將顯著提高，進(jìn)而可以有效降低早期發(fā)育階段病害發(fā)生機(jī)率，減少養(yǎng)殖損失。該途徑不但可以避免藥物治療可能導(dǎo)致的用藥過(guò)度、藥物殘留等食品安全和環(huán)境危害問(wèn)題，而且可以克服仔稚魚(yú)自身免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完善的缺陷，具有防御在先、以點(diǎn)帶面等優(yōu)勢(shì)，可從根本上提高子代質(zhì)量。母源免疫研究已廣泛應(yīng)用于畜禽類養(yǎng)殖業(yè)，對(duì)其產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展起到了有效促進(jìn)作用。在魚(yú)類的一些種類中也開(kāi)展了相關(guān)研究，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在草魚(yú)、鯉魚(yú)、羅非魚(yú)、鮭魚(yú)、紅笛鯛等種類上開(kāi)展了母源免疫傳遞驗(yàn)證和對(duì)子代保護(hù)效率的初步研究，證實(shí)了母源抗體的可傳遞性，因此，從親魚(yú)母源免疫角度出發(fā)，提高卵子中的免疫抗體水平，無(wú)疑是一條極具潛力的仔稚魚(yú)保護(hù)途徑。然而，目前大菱鲆母源免疫的研究還未見(jiàn)報(bào)道，鑒于此產(chǎn)業(yè)背景和研究背景，我們研究并開(kāi)發(fā)了一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法。引發(fā)高效的親魚(yú)免疫應(yīng)答，提高母體內(nèi)特異性抗體水平，才能有效增強(qiáng)卵子中的抗體富集。另一方面，親魚(yú)是非常珍貴的養(yǎng)殖生產(chǎn)材料，在免疫的過(guò)程中要避免對(duì)魚(yú)生殖發(fā)育和健康生長(zhǎng)的影響。因此，建立安全、有效的抗原水平、接種方式，接種時(shí)機(jī)是提高大菱鲆卵子中抗體水平的首要核心技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法，該方法創(chuàng)新性的開(kāi)發(fā)了針對(duì)鰻弧菌的大菱鲆雌性親魚(yú)的免疫方法，包括疫苗抗原劑量、接種時(shí)機(jī)、接種方式等要素的確定，以實(shí)現(xiàn)雌性親魚(yú)高效的免疫應(yīng)答，增加抗體在卵子中的富集，進(jìn)而提高產(chǎn)出卵子的抗體水平。本發(fā)明針對(duì)大菱鲆親魚(yú)個(gè)體大，處于繁殖期的特殊生理階段的特點(diǎn)，設(shè)定抗原劑量和免疫注射方式，并針對(duì)大菱鲆親魚(yú)培育發(fā)育時(shí)期設(shè)定免疫時(shí)機(jī)，實(shí)用性強(qiáng)，面向生產(chǎn)，可顯著提高免疫親魚(yú)所產(chǎn)卵子中的特異性抗體水平，達(dá)到有效的卵子免疫強(qiáng)化的目的，對(duì)于養(yǎng)殖效益提高具有重要價(jià)值。通過(guò)該方法，可以充分利用魚(yú)類自身的母源免疫保護(hù)的生理機(jī)制，提高苗種抗病能力。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)一魚(yú)免疫、群魚(yú)受益的效果，是生產(chǎn)中規(guī)?；⑴炕岣呙绶N抗病能力的安全、環(huán)保、有效途徑，是實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖病害防控在先的可行手段。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，研制了一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法，其特征在于(1)、滅活菌體免疫疫苗制備；(2)、將上述制備的免疫疫苗對(duì)雌性大菱鲆親魚(yú)進(jìn)行注射免疫；(3)、選取雌性大菱鲆親魚(yú)在產(chǎn)卵前期進(jìn)行免疫；0)、對(duì)培育水溫范圍進(jìn)行調(diào)控，采用弱光照、投喂、微量充氣、及時(shí)換水的管理操作；(5)、親魚(yú)將抗體富集到發(fā)育中的卵子中，產(chǎn)出含有高水平鰻弧菌抗體的成熟卵子。所述的疫苗制備中免疫疫苗的鰻弧菌菌液濃度范圍為108-101(lCFU/ml。將制備好的疫苗以肌肉注射的方式，進(jìn)行親魚(yú)免疫，注射部位在魚(yú)體背部，并選擇 3-5個(gè)位置點(diǎn)注射，注射劑量為0. 2ml/kg-—0. 4ml/kg的親魚(yú)體重。
所述的免疫條件是在親魚(yú)產(chǎn)卵前60-90天進(jìn)行免疫，在第一次免疫后間隔14-15 天后，分別再進(jìn)行兩次免疫。所采用的親魚(yú)培育溫度范圍為11 15°C，每天投喂兩次，日投喂量為魚(yú)體重的 1-3%，光照200-600勒，光照時(shí)間由8小時(shí)逐步增至18小時(shí)，流水培育，日交換量為2_6個(gè)全量。本發(fā)明具有以下有益效果可以提高大菱鲆受精卵的免疫抵抗力，起到對(duì)早期苗種的疾病防控作用的效果，減少因病害導(dǎo)致的養(yǎng)殖損失；避免藥物防控水產(chǎn)疾病可能存在的藥物殘留、環(huán)境污染等潛在危害；是通過(guò)母體免疫實(shí)現(xiàn)子代受益的有效途徑；操作簡(jiǎn)便， 實(shí)用性強(qiáng)，貼近生產(chǎn)實(shí)際，適宜廣泛推廣。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明研制了一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法，具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案(1)、菌體濃度的免疫疫苗制備；(2)、將上述制備的免疫疫苗對(duì)雌性大菱鲆親魚(yú)進(jìn)行注射免疫；(3)、選取雌性大菱鲆親魚(yú)在產(chǎn)卵前期進(jìn)行免疫；0)、對(duì)培育水溫范圍進(jìn)行調(diào)控，采用弱光照、投喂、微量充氣、及時(shí)換水的管理操作；(5)、親魚(yú)將抗體富集到發(fā)育中的卵子中，產(chǎn)出含有高水平鰻弧菌抗體的成熟卵子。實(shí)施例1 采用上述技術(shù)方案，取用疫苗制備中免疫疫苗的鰻弧菌菌液濃度范圍為IO8CFU/ ml ο將制備好的疫苗以肌肉注射的方式，進(jìn)行親魚(yú)免疫，注射部位在魚(yú)體背部，并選擇 3-5個(gè)位置點(diǎn)注射，注射劑量為0. 2ml/kg的親魚(yú)體重。所述的免疫條件是在親魚(yú)產(chǎn)卵前60天進(jìn)行免疫，在第一次免疫后間隔14天后，分別再進(jìn)行兩次免疫。所采用的親魚(yú)培育溫度范圍為IPC，每天投喂兩次，日投喂量為魚(yú)體重的1%，光照200勒，光照時(shí)間由8小時(shí)逐步增至18小時(shí)，流水培育，日交換量為2個(gè)全量。免疫雌魚(yú)產(chǎn)出卵子含有顯著高水平的鰻弧菌特異性抗體，免疫親魚(yú)健康狀態(tài)良好，繁殖產(chǎn)卵正常。實(shí)施例2 采用上述技術(shù)方案，取用疫苗制備中免疫疫苗的鰻弧菌菌液濃度范圍為IO9CFU/ ml ο將制備好的疫苗以肌肉注射的方式，進(jìn)行親魚(yú)免疫，注射部位在魚(yú)體背部，并選擇 3-5個(gè)位置點(diǎn)注射，注射劑量為0. 3ml/kg的親魚(yú)體重。所述的免疫條件是在親魚(yú)產(chǎn)卵前80天進(jìn)行免疫，在第一次免疫后間隔14天后，分別再進(jìn)行兩次免疫。所采用的親魚(yú)培育溫度范圍為13°C，每天投喂兩次，日投喂量為魚(yú)體重的2%，光照250勒，光照時(shí)間由8小時(shí)逐步增至18小時(shí)，流水培育，日交換量為4個(gè)全量。免疫雌魚(yú)產(chǎn)出卵子含有顯著高水平的鰻弧菌特異性抗體，免疫親魚(yú)健康狀態(tài)良好，繁殖產(chǎn)卵正常。實(shí)施例3 采用上述技術(shù)方案，取用疫苗制備中免疫疫苗的鰻弧菌菌液濃度范圍為IOltlCFU/ ml ο將制備好的疫苗以肌肉注射的方式，進(jìn)行親魚(yú)免疫，注射部位在魚(yú)體背部，并選擇 3-5個(gè)位置點(diǎn)注射，注射劑量為0. 4ml/kg的親魚(yú)體重。所述的免疫條件是在親魚(yú)產(chǎn)卵前90天進(jìn)行免疫，在第一次免疫后間隔15天后，分別再進(jìn)行兩次免疫。所采用的親魚(yú)培育溫度范圍為15°C，每天投喂兩次，日投喂量為魚(yú)體重的3%，光照300勒，光照時(shí)間由8小時(shí)逐步增至18小時(shí)，流水培育，日交換量為6個(gè)全量。免疫雌魚(yú)產(chǎn)出卵子含有顯著高水平的鰻弧菌特異性抗體，免疫親魚(yú)健康狀態(tài)良好，繁殖產(chǎn)卵正常。另外，本發(fā)明并不意味著實(shí)施例及說(shuō)明書所局限，在沒(méi)有脫離設(shè)計(jì)宗旨及其原理的前提下可以有所變化。
權(quán)利要求
1.一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法，其特征在于(1)、滅活菌體免疫疫苗制備；(2)、采用上述制備的疫苗對(duì)雌性大菱鲆親魚(yú)進(jìn)行注射免疫；(3)、選取雌性大菱鲆親魚(yú)產(chǎn)卵前時(shí)期進(jìn)行免疫；(4)、對(duì)培育水溫、光照、投喂等培養(yǎng)條件進(jìn)行調(diào)控，采用充氣、及時(shí)換水的管理操作；(5)、親魚(yú)將抗體富集到發(fā)育中的卵子中，產(chǎn)出含有高水平鰻弧菌抗體的成熟卵子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法，其特征在于所述的疫苗制備中采用的滅活鰻弧菌菌液濃度范圍為108-101(lCFU/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法，其特征在于將制備好的疫苗以肌肉注射的方式，進(jìn)行親魚(yú)免疫，注射部位在魚(yú)體背部，并選擇 3-5個(gè)位置點(diǎn)注射，注射劑量為0. 2ml/kg-0. 4ml/kg的親魚(yú)體重。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法，其特征在于所述的免疫條件是在親魚(yú)產(chǎn)卵前60-90天進(jìn)行免疫，在第一次免疫后間隔14-15天，分別再進(jìn)行兩次免疫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高大菱鲆卵子中鰻弧菌抗體水平的新方法，其特征在于所采用的親魚(yú)培育溫度范圍為11 15°c，每天投喂兩次，日投喂量為魚(yú)體重的1_3%， 光照200-600勒，光照時(shí)間由8小時(shí)逐步增至18小時(shí)，充氣流水培育，日交換量為2-6個(gè)全量。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于液氮罐冷凍保存精子的簡(jiǎn)易輔助裝置，由網(wǎng)狀提箱，提桿，網(wǎng)狀箱蓋，熱電偶探頭、滑動(dòng)卡扣組成，其特征在于所述的提桿連接在網(wǎng)狀提箱的一側(cè)，滑動(dòng)卡扣設(shè)置在提桿上，網(wǎng)狀提箱上端設(shè)置網(wǎng)狀箱蓋通過(guò)扣環(huán)與網(wǎng)狀提箱咬合，網(wǎng)狀箱蓋上設(shè)置小孔，熱電偶探頭穿過(guò)小孔和冷凍管設(shè)置在網(wǎng)狀提箱內(nèi)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確控制樣品放入液氮罐中的高度位置，有利于提高液氮罐冷凍保存效果的可重復(fù)性；提高了凍存效果的均一性、穩(wěn)定性；實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)冷凍過(guò)程中樣品環(huán)境的溫度變化；網(wǎng)箱蓋扣環(huán)方便了樣品存取，提高了液氮罐冷凍保存方法的安全性、方便性；提手的隔熱塑料便于操作，同時(shí)減少手握時(shí)可能產(chǎn)生的溫度影響。
文檔編號(hào)A01K61/00GK102283143SQ20111015127
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者丁福紅, 劉新富, 洪磊, 王蔚芳, 雷霽霖, 馬愛(ài)軍 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所