專(zhuān)利名稱(chēng)：基于二氧化硅納米粒子作為基因載體的植物轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二氧化硅納米粒子作為基因載體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化植物材料并獲得穩(wěn)定表達(dá)的方法，屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
納米技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展給生命科學(xué)的發(fā)展注入了新的活力，隨著納米生物技術(shù)在動(dòng)物和人體醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，納米粒子作為一種新型的基因載體也受到越來(lái)越多的關(guān)注， 但是納米粒子作為基因載體在植物轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用還鮮有報(bào)道。目前納米基因載體主要分為三類(lèi)無(wú)機(jī)納米粒子，高分子聚合物以及殼聚糖。二氧化硅納米粒子是一種重要的無(wú)機(jī)納米粒子，已經(jīng)被應(yīng)用于藥物緩釋、基因載體、生物傳感器等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究。它能夠很容易以實(shí)體球和多孔硅形式被獲得(3-lOOOnm)。硅納米粒子具有很好的生物相容性，表面容易功能化，常以多聚賴(lài)氨酸(poly-l-lysine，PLL)或聚乙烯亞胺等陽(yáng)離子聚合物等修飾，而且能夠控制攜帶外源基因的數(shù)量，被認(rèn)為是最有前景的基因載體。與高分子聚合物和殼聚糖等納米基因載體相比，作為植物基因載體具有其獨(dú)特優(yōu)越性，通過(guò)基因槍與超聲波等方法介導(dǎo)，其轉(zhuǎn)化材料可以為懸浮細(xì)胞、愈傷組織、葉片等器官，特別是當(dāng)被轉(zhuǎn)化受體材料為愈傷組織、葉片材料時(shí)，很容易分化成苗，獲得轉(zhuǎn)基因植株。而高分子聚合物以及殼聚糖納米基因載體只能以原生質(zhì)體和懸浮細(xì)胞為材料，轉(zhuǎn)化后的材料很難再生成植株。因此二氧化硅納米基因載體在植物轉(zhuǎn)基因中顯示了巨大的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的以金顆粒為載體的基因槍轉(zhuǎn)化法，不僅昂貴且容易引起轉(zhuǎn)基因沉默，而二氧化硅納米粒子不僅價(jià)格低廉而且可以通過(guò)控制結(jié)合的外源基因的數(shù)量從而有效地克服基因槍法引起的基因多拷貝效應(yīng)以及轉(zhuǎn)基因沉默等缺點(diǎn)；超聲波通過(guò)與媒介相互作用產(chǎn)生空化現(xiàn)象，對(duì)周?chē)镔|(zhì)產(chǎn)生剪切作用，從而能夠在細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以至細(xì)胞核膜產(chǎn)生瞬時(shí)通道，外源DNA可通過(guò)此通道進(jìn)入植物細(xì)胞，超聲波轉(zhuǎn)化法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，但超聲波處理對(duì)DNA造成很大的破壞，而二氧化硅納米粒子能夠有效地保護(hù)目的基因免受超聲破壞，從而保證了超聲波法轉(zhuǎn)化的可行性。納米粒子作為基因載體用于植物的轉(zhuǎn)基因方法的研究已經(jīng)有報(bào)道(Biotechnol. J.，2008，3，1078-1082 ；生物技術(shù)通報(bào)，2009， 6 :75-80)，但納米粒子介導(dǎo)外源目的基因轉(zhuǎn)入植物中獲得穩(wěn)定表達(dá)至今還未見(jiàn)報(bào)道。實(shí)際上，納米粒子的種類(lèi)選擇以及納米粒子與DNA的結(jié)合的比例對(duì)于有效提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并在植物細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)是該技術(shù)領(lǐng)域要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種價(jià)格低廉且能有效地控制結(jié)合DNA的數(shù)量，從而相對(duì)控制進(jìn)入植物材料的目的基因的量，進(jìn)而克服基因槍法缺點(diǎn)的硅納米基因載體，并首次建立了通過(guò)基因槍法獲得納米粒子作為基因載體在植物轉(zhuǎn)基因中的穩(wěn)定表達(dá)方法。本發(fā)明的另一目的是提供二氧化硅納米粒子作為基因載體通過(guò)超聲波轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并首次獲得穩(wěn)定表達(dá)植株的轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明的二氧化硅納米粒子作為基因載體具有生物相容性、容易功能化、攜帶外源基因數(shù)量可控等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)基因槍法和超聲波法能夠有效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，可廣泛應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域。本發(fā)明的納米粒子作為基因載體進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化并獲得穩(wěn)定表達(dá)植物的遺傳轉(zhuǎn)化方法國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本發(fā)明的目的之一是通過(guò)下述方式實(shí)現(xiàn)的將不同尺寸(500-1000nm)的二氧化硅納米粒子以多聚賴(lài)氨酸(PLL)進(jìn)行生物學(xué)修飾，將修飾后的二氧化硅納米粒子與目的基因進(jìn)行結(jié)合，構(gòu)建二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物，并通過(guò)基因槍法轉(zhuǎn)入植物受體材料。(1) 二氧化硅納米粒子的生物學(xué)修飾取lmg/mL的二氧化硅納米粒子懸浮液與 lmg/mL的PLL按質(zhì)量比為20 1,10 1,5 1的比例進(jìn)行混合，以使二氧化硅納米粒子功能化，即使二氧化硅納米粒子表面帶上正電荷。通過(guò)Z電位儀分析確定合適的修飾比例。(2) 二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物的制備取lmg/m L的PLL修飾的二氧化硅納米粒子按30 1,20 1,10 1,5 1的質(zhì)量比加入目的基因。電泳檢測(cè)分析PLL修飾的二氧化硅納米粒子與不同比例目的基因的結(jié)合狀況，確定二氧化硅納米粒子與目的基因的結(jié)合比例。(3)通過(guò)基因槍法將二氧化硅納米粒子與目的基因的復(fù)合物轉(zhuǎn)入植物受體材料， 實(shí)現(xiàn)目的基因的導(dǎo)入。即將二氧化硅納米粒子與含有表達(dá)葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的復(fù)合物分別轉(zhuǎn)入雙子葉植物煙草的愈傷組織和葉片中以及單子葉植物玉米的愈傷組織中。(4)將轉(zhuǎn)化的材料進(jìn)行過(guò)渡培養(yǎng)，過(guò)渡培養(yǎng)后取四分之一轉(zhuǎn)化的煙草和玉米受體材料進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)兩種受體材料中均有藍(lán)色斑點(diǎn)出現(xiàn)，說(shuō)明二氧化硅納米基因載體成功地將目的基因轉(zhuǎn)入植物材料，并獲得了瞬時(shí)表達(dá)。余下的受體材料進(jìn)行分化篩選得到轉(zhuǎn)基因抗性植株，通過(guò)PCR檢測(cè)、Southern雜交、GUS組織化學(xué)染色等進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明基于基因槍法的二氧化硅納米粒子作為基因載體實(shí)現(xiàn)了外源基因在植物材料的穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明的另一目的是通過(guò)下述方式實(shí)現(xiàn)的將不同尺寸(3-lOOnm)的二氧化硅納米粒子以PLL進(jìn)行生物學(xué)修飾，將修飾后的二氧化硅納米粒子與目的基因進(jìn)行結(jié)合，構(gòu)建二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物，并通過(guò)超聲波法轉(zhuǎn)入植物受體材料。(1) 二氧化硅納米的生物學(xué)修飾取lmg/mL的二氧化硅納米粒子懸浮液與lmg/mL 的PLL按質(zhì)量比為20 1,10 1,5 1的比例進(jìn)行混合，以使二氧化硅納米粒子功能化， 即使二氧化硅納米粒子表面帶上正電荷。通過(guò)Z電位儀分析確定合適的修飾比例。(2) 二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物的制備，取lmg/mL的PLL修飾的二氧化硅納米粒子按30 1,20 1,10 1,5 1的質(zhì)量比加入目的基因。電泳檢測(cè)分析PLL修飾的納米粒子與不同比例目的基因復(fù)合物的結(jié)合狀況，確定二氧化硅納米粒子與目的基因的結(jié)合比例。(3)硅納米粒子對(duì)基因的保護(hù)分析將二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物進(jìn)行超聲波處理，電泳檢測(cè)二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物的變化，結(jié)果表明二氧化硅納米粒子能夠保護(hù)與其結(jié)合的基因免受超聲波的破壞作用。(4)具有紅色熒光量子點(diǎn)(CdTe)的二氧化硅納米粒子與含有綠色熒光蛋白(GFP) 基因的復(fù)合物分別轉(zhuǎn)入煙草和玉米的懸浮細(xì)胞后，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)M小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)綠色熒光蛋白的表達(dá)狀況，結(jié)果表明綠色熒光蛋白在煙草和玉米的懸浮細(xì)胞都能夠有效表達(dá)。(5)通過(guò)超聲波法將二氧化硅納米粒子與目的基因的復(fù)合物轉(zhuǎn)入植物受體材料， 實(shí)現(xiàn)目的基因的導(dǎo)入。將二氧化硅納米粒子與含有GUS基因的復(fù)合物分別轉(zhuǎn)入煙草的愈傷組織和葉片中，以及玉米的愈傷組織中。將通過(guò)超聲波法轉(zhuǎn)化的葉片材料和愈傷組織材料進(jìn)行過(guò)渡培養(yǎng)，過(guò)渡培養(yǎng)后取四分之一轉(zhuǎn)化的受體材料進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的受體材料有藍(lán)色斑點(diǎn)出現(xiàn)，說(shuō)明納米基因載體成功地將目的基因轉(zhuǎn)入植物材料，并獲得了瞬時(shí)表達(dá)。余下的受體材料進(jìn)行分化篩選得到抗性植株，通過(guò)PCR檢測(cè)、Southern雜交、 GUS組織化學(xué)染色等進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明基于超聲波法的二氧化硅納米粒子作為基因載體實(shí)現(xiàn)了外源基因在植物材料中的穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為1.本發(fā)明所用的二氧化硅納米粒子具有良好的生物相容性，不會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，可以廣泛的應(yīng)用于植物的轉(zhuǎn)基因研究。2.本發(fā)明所用的二氧化硅納米粒子具有很強(qiáng)的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等特點(diǎn)，通過(guò)功能化能夠有效地控制與其結(jié)合的外源基因的數(shù)量，能夠提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率。3.本發(fā)明所用的二氧化硅納米粒子具有易制備、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，從而有可能取代傳統(tǒng)的金顆粒作為基因載體，廣泛應(yīng)用于基因槍轉(zhuǎn)化方法中。4.本發(fā)明通過(guò)調(diào)節(jié)二氧化硅納米粒子與目的基因的結(jié)合量，從而有效地克服基因槍法引起的基因沉默。5.本發(fā)明基于超聲波法的二氧化硅納米粒子作為基因載體的遺傳轉(zhuǎn)化能夠提高基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和表達(dá)效率。6.本發(fā)明基于二氧化硅納米粒子轉(zhuǎn)基因植物方法，既沒(méi)有受體材料組織器官的特異性，也沒(méi)有植物受體材料的種屬特異性，可以廣泛應(yīng)用于各種植物材料的基因轉(zhuǎn)化。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1不同尺寸二氧化硅納米粒子的生物學(xué)修飾(1)分別準(zhǔn)確稱(chēng)取3nm，50nm, IOOnm, 500nm, IOOOnm 二氧化硅納米粒子5mg于離心管中，加入5mL的pH = 7. 2的磷酸鈉緩沖液，置于300W，40KHz超聲波儀中進(jìn)行超聲分散 30-60min，超聲處理過(guò)程中控制溫度低于37°C。超聲結(jié)束后，溶液呈均一的乳濁狀。(2)取超聲分散好的 3nm，50nm, IOOnm, 500nm, IOOOnm lmg/mL 二氧化硅納米粒子溶液，分別與lmg/mL的PLL按質(zhì)量比為20 1,10 1,5 1的比例進(jìn)行混合，上下顛倒充分混勻，室溫放置1小時(shí)。Z電位儀分析PLL修飾后的二氧化硅納米粒子的表面電荷。結(jié)果表明以上各種二氧化硅納米粒子與PLL的質(zhì)量是10 1時(shí)，Z電位值最高。實(shí)施例2不同尺寸二氧化硅納米粒子與基因復(fù)合物的制備分別取按實(shí)施例1方法制備的二氧化硅納米粒子與PLL的質(zhì)量比為10 IWPLL 修飾的3nm，50nm，100nm，500nm，IOOOnm 二氧化硅納米粒子，與目的基因按30 1,20 1， 10 1,5 1的質(zhì)量比進(jìn)行混勻，室溫放置0.5-1小時(shí)，制備二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物。瓊脂糖凝膠檢測(cè)不同尺寸二氧化硅納米與基因的結(jié)合狀況。結(jié)果表明二氧化硅納米粒子能有效與DNA分子結(jié)合。實(shí)施例3二氧化硅納米粒子對(duì)基因的保護(hù)分析取按實(shí)施例2制備的PLL修飾的3nm，50nm, IOOnm 二氧化硅納米粒子與目的基因按30 1,20 1,10 1,5 1的質(zhì)量比制備的二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物進(jìn)行超聲處理，未與二氧化硅納米粒子結(jié)合的目的基因做空白對(duì)照，在參數(shù)為60W，40KHz的超聲儀中，分別超聲處理20min，30min，40min。瓊脂糖凝膠檢測(cè)。結(jié)果表明各種尺寸的二氧化硅納米粒子均能有效保護(hù)基因不被超聲破壞，而未與二氧化硅納米粒子結(jié)合的基因在以上三個(gè)不同條件處理下均被破壞。實(shí)施例4基因槍法介導(dǎo)500nm 二氧化硅納米粒子作為基因載體轉(zhuǎn)化煙草愈傷組織與葉片(1) 二氧化硅納米粒子懸浮顆粒的獲得。準(zhǔn)確稱(chēng)取500nm 二氧化硅納米粒子5mg 于離心管中，加入5ml的pH = 7. 2的磷酸鈉緩沖液，置于300W，40KHz超聲波儀中進(jìn)行超聲分散45min，超聲處理過(guò)程中控制溫度低于37°C。超聲結(jié)束后，溶液呈均一的乳濁狀。(2) 二氧化硅納米粒子的生物學(xué)修飾。分別取Iml lmg/mL的超聲分散好的二氧化硅納米粒子溶液，加入100 μ L lmg/mL的多聚賴(lài)氨酸，充分混勻，室溫放置1小時(shí)。(3)將PLL修飾的二氧化硅納米粒子開(kāi)蓋放置在紫外下處理0. 5小時(shí)。(4) 二氧化硅納米粒子與DNA結(jié)合。將修飾好的二氧化硅納米粒子與基因(含有 ⑶S基因的質(zhì)粒DNA)按20 1和10 1的質(zhì)量比進(jìn)行混勻，室溫放置0. 5小時(shí)。(5) 5000rpm,室溫離心5min，小心去除上清。(6)加入200 μ L無(wú)水乙醇，渦旋沉淀，盡量使沉淀重新達(dá)到懸浮狀態(tài)。(7) 5000rpm,室溫離心5min，小心去除上清。(8)加入60 μ L的無(wú)水乙醇重新懸浮二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物。(9)取進(jìn)行暗培養(yǎng)處理M小時(shí)的煙草葉片和進(jìn)行高滲處理6小時(shí)的愈傷組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(10)進(jìn)行基因槍的裝彈、轟擊。煙草葉片材料采用的是可裂膜為llOOpsi，轟擊距離為6cm進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化。煙草愈傷組織材料采用的是可裂膜為llOOpsi，轟擊距離為9cm 進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化。(11)基因槍法介導(dǎo)二氧化硅納米-基因復(fù)合物轉(zhuǎn)入煙草受體材料后，將受體材料進(jìn)行過(guò)渡培養(yǎng)2-3天。取四分之一過(guò)渡培養(yǎng)后的受體材料進(jìn)行GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)。 結(jié)果表明基于基因槍法介導(dǎo)的二氧化硅納米粒子作為基因載體能夠有效地將外源基因GUS 轉(zhuǎn)入植物組織，并獲得瞬時(shí)表達(dá)。(12)檢測(cè)后余下的煙草受體材料進(jìn)行分化篩選得到抗性煙草植株。(13)將得到的抗性煙草植株通過(guò)PCR檢測(cè)、Southern雜交、⑶S組織化學(xué)染色等方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明二氧化硅納米基因載體能夠有效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并能夠整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)在植物材料中的穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)施例5基因槍法介導(dǎo)IOOOnm 二氧化硅納米粒子作為基因載體轉(zhuǎn)化煙草愈傷組織與葉片
(1) 二氧化硅納米粒子懸浮顆粒的獲得。準(zhǔn)確稱(chēng)取IOOOnm 二氧化硅納米粒子5mg 于離心管中，加入5ml的pH = 7. 2的磷酸鈉緩沖液，置于300W，40KHz超聲波儀中進(jìn)行超聲分散45min，超聲處理過(guò)程中控制溫度低于37°C。超聲結(jié)束后，溶液呈均一的乳濁狀。(2) 二氧化硅納米粒子的生物學(xué)修飾。分別取Iml lmg/mL的超聲分散好的二氧化硅納米粒子溶液，加入100 μ L lmg/mL的PLL，充分混勻，室溫放置1小時(shí)。(3)將PLL修飾的二氧化硅納米粒子開(kāi)蓋放置在紫外下處理0. 5小時(shí)。(4) 二氧化硅納米粒子與DNA結(jié)合。將修飾好的二氧化硅納米粒子與基因(含有 ⑶S基因的質(zhì)粒DNA)按20 1和10 1的質(zhì)量比進(jìn)行混勻，室溫放置0. 5小時(shí)。(5) 4000rpm,室溫離心4min，小心去除上清。(6)加入300 μ L無(wú)水乙醇，渦旋沉淀，盡量使沉淀重新達(dá)到懸浮狀態(tài)。(7) 4000rpm,室溫離心4min，小心去除上清。(8)加入60 μ L的無(wú)水乙醇重新懸浮二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物。(9)取進(jìn)行暗培養(yǎng)處理M小時(shí)的煙草葉片和進(jìn)行高滲處理6小時(shí)的愈傷組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(10)進(jìn)行基因槍的裝彈、轟擊。煙草葉片材料采用的是可裂膜為llOOpsi，轟擊距離為6cm進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化。煙草愈傷組織材料采用的是可裂膜為llOOpsi，轟擊距離為9cm 進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化。(11)基因槍法介導(dǎo)二氧化硅納米-基因復(fù)合物轉(zhuǎn)入煙草受體材料后，將受體材料進(jìn)行過(guò)渡培養(yǎng)2-3天。取四分之一過(guò)渡培養(yǎng)后的受體材料進(jìn)行GUS目的基因的瞬時(shí)表達(dá)的檢測(cè)。結(jié)果表明基于基因槍法介導(dǎo)的二氧化硅納米粒子作為基因載體能夠有效地將外源基因⑶S轉(zhuǎn)入植物組織，并獲得瞬時(shí)表達(dá)。(12)檢測(cè)后余下的煙草受體材料進(jìn)行分化篩選得到抗性煙草植株。(13)將得到的抗性煙草植株通過(guò)PCR檢測(cè)、Southern雜交、⑶S組織化學(xué)染色等方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明二氧化硅納米基因載體能夠有效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并能夠整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)在植物材料中的穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)施例6基因槍法介導(dǎo)500nm 二氧化硅納米粒子作為基因載體轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織(1) 二氧化硅納米粒子懸浮顆粒的獲得。準(zhǔn)確稱(chēng)取500nm 二氧化硅納米粒子5mg 于離心管中，加入5ml的pH = 7. 2的磷酸鈉緩沖液，置于300W，40KHz超聲波儀中進(jìn)行超聲分散45min，超聲處理過(guò)程中控制溫度低于37°C。超聲結(jié)束后，溶液呈均一的乳濁狀。(2) 二氧化硅納米粒子的生物學(xué)修飾。分別取Iml lmg/mL的超聲分散好的二氧化硅納米粒子溶液，加入100 μ L lmg/mL的PLL，充分混勻，室溫放置1小時(shí)。(3)將PLL修飾的二氧化硅納米粒子開(kāi)蓋放置在紫外下處理0. 5小時(shí)。(4) 二氧化硅納米粒子與基因結(jié)合。將修飾好的二氧化硅納米粒子與基因(含有 ⑶S基因的質(zhì)粒DNA)按20 1和10 1的質(zhì)量比進(jìn)行混勻，室溫放置0. 5小時(shí)。(5) 5000rpm,室溫離心5min，小心去除上清。(6)加入200ul無(wú)水乙醇，渦旋沉淀，盡量使沉淀重新達(dá)到懸浮狀態(tài)。(7) 5000rpm,室溫離心5min，小心去除上清。(8)加入60 μ L的無(wú)水乙醇重新懸浮二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物。
(9)取高滲處理6小時(shí)的玉米愈傷組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(10)進(jìn)行基因槍的裝彈、轟擊。采用的實(shí)驗(yàn)條件是可裂膜為llOOpsi，轟擊距離為 9cm進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化。(11)轉(zhuǎn)化后的愈傷組織進(jìn)行過(guò)渡培養(yǎng)2-3天。取四分之一受體材料進(jìn)行⑶S目的基因的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)。結(jié)果表明基于基因槍法介導(dǎo)的二氧化硅納米粒子作為基因載體能夠有效地將外源基因GUS轉(zhuǎn)入玉米愈傷組織，并獲得瞬時(shí)表達(dá)。(12)檢測(cè)后余下的受體材料進(jìn)行分化篩選得到抗性植株。(13)將得到的抗性植株通過(guò)PCR檢測(cè)、Southern雜交、⑶S組織化學(xué)染色等方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明二氧化硅納米基因載體能夠有效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并能夠整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)在植物材料中的穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)施例7超聲波法介導(dǎo)的50nm引入紅色熒光量子點(diǎn)(CdTe)的二氧化硅納米粒子作為基因載體轉(zhuǎn)化煙草和玉米懸浮細(xì)胞(l)50nm引入紅色熒光量子點(diǎn)(CdTe)的二氧化硅納米粒子懸浮顆粒的獲得。準(zhǔn)確稱(chēng)取50nm引入紅色熒光量子點(diǎn)(CdTe)的二氧化硅納米粒子5mg于離心管中，加入5ml的 PH = 7. 2的磷酸鈉緩沖液，置于300W，40KHz超聲波儀中進(jìn)行超聲分散45min，超聲處理過(guò)程中控制溫度低于37°C。超聲結(jié)束后，溶液呈均一的乳濁狀。(2) 50nm引入紅色熒光量子點(diǎn)(CdTe)的二氧化硅納米粒子的生物學(xué)修飾。分別取 Iml lmg/mL的上述超聲分散好的二氧化硅納米粒子溶液，加入IOOyL lmg/mL的多聚賴(lài)氨酸，充分混勻，室溫放置1小時(shí)。(3)將上述PLL修飾的二氧化硅納米粒子開(kāi)蓋放置在紫外下處理0. 5小時(shí)。(4) 二氧化硅納米粒子與基因結(jié)合。將上述PLL修飾的二氧化硅納米粒子與基因 (含有GFP基因的質(zhì)粒DNA)按20 1，10 1的質(zhì)量比進(jìn)行混勻，室溫放置0. 5小時(shí)。(5)取感受態(tài)煙草懸浮細(xì)胞和玉米懸浮細(xì)胞，分別放在裝有5ml超聲波緩沖液的 50ml三角瓶中。分別加入100 μ L上述兩個(gè)不同比例的二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物，輕輕搖晃混勻。35W，40KHz，5min進(jìn)行超聲波處理，將二氧化硅納米粒子與基因的復(fù)合物導(dǎo)入煙草懸浮細(xì)胞和玉米懸浮細(xì)胞。(6)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)M小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)綠色熒光蛋白的表達(dá)狀況， 結(jié)果表明綠色熒光蛋白在煙草和玉米的懸浮細(xì)胞都能夠有效表達(dá)。在兩種懸浮細(xì)胞中表達(dá)效率達(dá)40-50%。實(shí)施例8超聲波法介導(dǎo)IOOnm 二氧化硅納米粒子作為基因載體轉(zhuǎn)化煙草和玉米愈傷組織(1) 二氧化硅納米粒子懸浮顆粒的獲得。準(zhǔn)確稱(chēng)取IOOnm 二氧化硅納米粒子5mg 于離心管中，加入5ml的PH = 7. 2的磷酸鈉緩沖液，置于300W，40KHz超聲波儀中進(jìn)行超聲分散45min，超聲處理過(guò)程中控制溫度低于37°C。超聲結(jié)束后，溶液呈均一的乳濁狀。(2) 二氧化硅納米粒子的生物學(xué)修飾。分別取Iml lmg/mL的超聲分散好的二氧化硅納米粒子溶液，加入100 μ L lmg/mL的多聚賴(lài)氨酸，充分混勻，室溫放置1小時(shí)。(3)將PLL修飾的二氧化硅納米粒子開(kāi)蓋放置在紫外下處理0. 5小時(shí)。(4) 二氧化硅納米粒子與基因結(jié)合。將PLL修飾二氧化硅納米粒子與基因(含有⑶S基因的質(zhì)粒DNA)按20 1,10 1的質(zhì)量比進(jìn)行混勻，室溫放置0. 5小時(shí)。(5)取高滲處理6小時(shí)的煙草和玉米愈傷組織分別放在裝有5ml超聲波緩沖液的 50ml三角瓶中。(6)分別加入IOOyL上述兩個(gè)不同比例的二氧化硅納米粒子與基因的復(fù)合物，輕輕搖晃混勻。(7) 35W，40KHz, IOmin進(jìn)行超聲波處理，將二氧化硅納米粒子_基因復(fù)合物分別導(dǎo)入煙草和玉米愈傷組織。(8)轉(zhuǎn)化后愈傷組織的培養(yǎng)、分化、再生以及生物學(xué)檢測(cè)同實(shí)施例4和實(shí)例6中所敘述的方法。檢測(cè)結(jié)果表明二氧化硅納米基因載體能夠有效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞， 并能夠整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)在植物材料中的穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)施例9超聲波法介導(dǎo)50nm 二氧化硅納米粒子作為基因載體轉(zhuǎn)化煙草葉片(1) 二氧化硅納米粒子懸浮顆粒的獲得。準(zhǔn)確稱(chēng)取50nm 二氧化硅納米粒子5mg于離心管中，加入5ml的PH = 7. 2的磷酸鈉緩沖液，置于300W，40KHz超聲波儀中進(jìn)行超聲分散45min，超聲處理過(guò)程中控制溫度低于37°C。超聲結(jié)束后，溶液呈均一的乳濁狀。(2) 二氧化硅納米粒子的生物學(xué)修飾。分別取Iml lmg/mL的超聲分散好的二氧化硅納米粒子溶液，加入100 μ L lmg/mL的多聚賴(lài)氨酸，充分混勻，室溫放置1小時(shí)。(3)將PLL修飾的二氧化硅納米粒子開(kāi)蓋放置在紫外下處理0. 5小時(shí)。(4) 二氧化硅納米粒子與DNA結(jié)合。將PLL修飾二氧化硅納米粒子與基因(含有 ⑶S基因的質(zhì)粒DNA)按20 1,10 1的質(zhì)量比進(jìn)行混勻，室溫放置0. 5小時(shí)。(5)取煙草葉片分別放在裝有5ml超聲波緩沖液的50ml三角瓶中。(6)分別加入IOOyL上述兩個(gè)不同比例的二氧化硅納米粒子-基因的復(fù)合物，輕輕搖晃混勻。(7)60ff,40KHz,20min進(jìn)行超聲波處理，將二氧化硅納米粒子與基因的復(fù)合物導(dǎo)入煙草葉片中。(8)轉(zhuǎn)化后受體材料的培養(yǎng)、分化、再生以及生物學(xué)檢測(cè)同實(shí)施例4中所敘述的方法。檢測(cè)結(jié)果表明二氧化硅納米基因載體能夠有效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并能夠整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)在植物材料中的穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)施例10超聲波法介導(dǎo)3nm 二氧化硅納米粒子作為基因載體轉(zhuǎn)化煙草葉片(1) 二氧化硅納米粒子懸浮顆粒的獲得。準(zhǔn)確稱(chēng)取3nm 二氧化硅納米粒子^(guān)iig于離心管中，加入2ml的PH = 7. 2的磷酸鈉緩沖液，置于300W，40KHz超聲波儀中進(jìn)行超聲分散45min，超聲處理過(guò)程中控制溫度低于37°C。超聲結(jié)束后，溶液呈均一的乳濁狀。(2) 二氧化硅納米粒子的生物學(xué)修飾。分別取Iml lmg/mL的超聲分散好的二氧化硅納米粒子溶液，加入100 μ L lmg/mL的多聚賴(lài)氨酸，充分混勻，室溫放置1小時(shí)。(3)將PLL修飾的二氧化硅納米粒子開(kāi)蓋放置在紫外下處理0. 5小時(shí)。(4) 二氧化硅納米粒子與DNA結(jié)合。將PLL修飾二氧化硅納米粒子與基因(含有 ⑶S基因的質(zhì)粒DNA)按20 1,10 1的質(zhì)量比進(jìn)行混勻，室溫放置0. 5小時(shí)。(5)取煙草葉片分別放在裝有5ml超聲波緩沖液的50ml三角瓶中。
(6)分別加入IOOyL上述兩個(gè)不同比例的二氧化硅納米粒子與基因的復(fù)合物，輕輕搖晃混勻。(7) 60W, 40KHz,20min進(jìn)行超聲波處理，將二氧化硅納米粒子與基因的復(fù)合物導(dǎo)入煙草葉片組織。(8)轉(zhuǎn)化后受體材料的培養(yǎng)、分化、再生以及生物學(xué)檢測(cè)同實(shí)施例4中所敘述的方法。檢測(cè)結(jié)果表明二氧化硅納米基因載體能夠有效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并能夠整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)在植物材料中的穩(wěn)定表達(dá)。
權(quán)利要求
1.基于二氧化硅納米粒子作為基因載體的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于將修飾的二氧化硅納米粒子與目的基因結(jié)合，構(gòu)建二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物，分別通過(guò)基因槍法和超聲波法兩種轉(zhuǎn)化方法將二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物導(dǎo)入植物細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)目的基因在植物中的遺傳轉(zhuǎn)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于基因槍法介導(dǎo)的二氧化硅納米粒子作為載體的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述的二氧化硅納米粒子尺寸在500-1000nm之間；根據(jù)權(quán)利要求 1所述的基于超聲波法介導(dǎo)的二氧化硅納米粒子作為載體的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于 所述的二氧化硅納米粒子其尺寸在3-lOOnm之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于二氧化硅納米粒子作為基因載體的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于二氧化硅納米粒子的生物學(xué)修飾主要為多聚賴(lài)氨酸修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于二氧化硅納米粒子作為載體的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述的目的基因可以是DNA，也可以是RNA，其結(jié)合的基因可以為一種基因或同時(shí)為多種基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于二氧化硅納米粒子作為載體的植物轉(zhuǎn)基因方法，其轉(zhuǎn)化的受體材料可以是植物的組織、器官或懸浮細(xì)胞；轉(zhuǎn)化的植物既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于基因槍法介導(dǎo)的二氧化硅納米粒子作為載體的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于可裂膜為llOOpsi，轟擊距離為6cm，將目的基因轉(zhuǎn)入葉片；在可裂膜為llOOpsi，轟擊距離為9cm，將目的基因轉(zhuǎn)入愈傷組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于超聲波法介導(dǎo)的二氧化硅納米粒子作為載體的植物轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于將二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物與植物材料和超聲波緩沖液混合后，用超聲波進(jìn)行處理。轉(zhuǎn)化材料為葉片時(shí)，在60W，40KHz超聲波強(qiáng)度下處理混合物 20min ；轉(zhuǎn)化材料為愈傷組織時(shí)，在35W，40KHz超聲波強(qiáng)度下處理混合物lOmin。轉(zhuǎn)化材料為懸浮細(xì)胞時(shí)，在35W，40KHz超聲波強(qiáng)度下處理混合物5min。
全文摘要
基于二氧化硅納米粒子作為基因載體的植物轉(zhuǎn)基因方法，包括基因槍和超聲波兩種轉(zhuǎn)化方法。將不同尺寸的硅納米粒子以多聚賴(lài)氨酸(PLL)進(jìn)行表面修飾，構(gòu)建納米基因載體，修飾后的納米粒子能夠通過(guò)靜電作用有效地與基因結(jié)合，形成二氧化硅納米粒子-基因復(fù)合物，分別通過(guò)基因槍法和超聲波法轉(zhuǎn)化植物受體材料，成功地實(shí)現(xiàn)了外源基因在植物細(xì)胞中的高效穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明方法具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化材料不受植物種屬類(lèi)型、組織器官類(lèi)型限制。本發(fā)明方法為二氧化硅納米基因載體在植物轉(zhuǎn)基因中的廣泛應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102260704SQ20111015114
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者付玉芹, 呂長(zhǎng)利, 李魯華, 王丕武 申請(qǐng)人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)