專利名稱：一種利用外源大豆異黃酮緩解大豆幼苗鹽害的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)作物耐逆調(diào)控新技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種緩解大豆幼苗鹽害的方法，具體涉及一種利用外源大豆異黃酮緩解大豆幼苗鹽害的方法。
背景技術(shù)：
大豆異黃酮(soybean isoflavones)是從大豆籽料中提取分離出的具有典型異黃酮類化合物結(jié)構(gòu)的一類活性物質(zhì)，是大豆中最引人注目的功能成分之一。大量的研究表明， 大豆異黃酮具有預(yù)防癌癥、心血管疾病和骨質(zhì)疏松癥、抗氧化和減輕婦女更年期綜合癥等重要生理功能，因而引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，成為世界各國科學(xué)家研究的熱點之一(宋冰等，2008)。大豆異黃酮代謝是大豆等豆科植物中的主要次生代謝途徑，大豆異黃酮能在某些豆科植物抵抗逆境過程中發(fā)揮多種重要的生態(tài)作用，如避免紫外輻射的傷害(Bohm，1998)， 在植物的地上部，大豆異黃酮可在植物受到病源侵染時誘導(dǎo)合成，以抵抗植物病原微生物的侵襲，是具有廣譜抗菌活性的植物保護素(Harborne et al. , 1976 ；Adesanya et al., 1986 ;Dixon，2001)，對草食性昆蟲具有毒害作用和趨避作用(Lane et al.，1985)；在地下部，豆科植物根系分泌異黃酮類化合物對根瘤菌有趨化作用，還是根瘤菌結(jié)瘤基因的誘導(dǎo)物質(zhì)(Kosslak et al. , 1987 ；Hirsch, 1992 ；Tahara 和 Ingham，2000)。當(dāng)植物氮素缺乏時， 合成異黃酮的基因會被誘導(dǎo)表達，從而產(chǎn)生異黃酮類物質(zhì)作為根瘤菌的信號分子促使根瘤的形成(Subramanian et al.，2004)。鹽脅迫是植物遭遇逆境的一種，大豆異黃酮代謝可能與植物適應(yīng)鹽漬環(huán)境有關(guān)。 通過比較耐鹽型和鹽敏感型大豆中的主要次生代謝物發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮和大豆皂苷在這兩種類型的大豆中有很大區(qū)別，可以利用大豆異黃酮和大豆皂苷指標(biāo)來鑒定大豆的耐鹽性 (Wu et al.，2008)。耐鹽野生大豆種子中大豆異黃酮含量遠高于當(dāng)?shù)赝谑斋@的不耐鹽栽培大豆品種，而且在可控的栽培條件下，一定濃度的鹽漬條件有促進野生大豆籽粒中大豆異黃酮積累的作用，對于栽培大豆的大豆異黃酮形成則有抑制作用(周三等，2007)。在非豆科植物中，通過外施大豆異黃酮也能改善某些逆境條件下如酸雨和干旱脅迫下植物的生理指標(biāo)，減輕逆境的傷害作用(葉梅榮等，2008)。然而，內(nèi)、外源大豆異黃酮與大豆耐鹽性之間的關(guān)系并不明確，相關(guān)的應(yīng)用方法或技術(shù)，如通過外源大豆異黃酮浸種處理的方式，研究其對大豆植株耐鹽性的影響或?qū)}害的生理效應(yīng)，經(jīng)檢索目前未見這方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種利用外源大豆異黃酮緩解大豆幼苗鹽害的方法，以使大豆幼苗具有較高的耐鹽性，有效緩解大豆幼苗鹽害。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下 一種利用外源大豆異黃酮緩解大豆幼苗鹽害的方法，包括以下步驟(1)用DMSO溶解大豆異黃酮，配置成含1%(V/V)DMS0的大豆異黃酮水溶液，濃度不大于 1. 0 mg/L
(2)用大豆異黃酮水溶液浸大豆種子，恒溫箱25°C，浸種10h后置于發(fā)芽床上避光催
芽；
(3)取發(fā)芽苗播于盛有石英砂的具孔塑料杯中，置于盛有1/2Hoagland營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中，光照培養(yǎng)，營養(yǎng)液每2 3d更換一次；
(4)待第1對真葉長出時，移苗至具孔的泡沫板上，在盛有用1/2Hoagland營養(yǎng)液配制的10(Tl30mmOl/LNaCl溶液的周轉(zhuǎn)箱中進行培養(yǎng)，觀察幼苗的生長情況，拍照并測定其葉面積；處理6d后，分為根、莖、葉三部分取樣，采用HPLC法分別測定其大豆異黃酮含量；
其中，大豆異黃酮水溶液為大豆苷溶液或染料木苷溶液。大豆種子為耐鹽性較弱的栽培大豆品種N23674品種，耐鹽灘涂野大豆BB52種群及其經(jīng)逐代耐鹽性篩選而獲得的雜交后代4076株系。步驟(1)中，含1% DMSO的大豆異黃酮水溶液的濃度為0. 01 mg/L。大豆籽粒中含量較多的兩種大豆異黃酮組分為大豆苷和染料木苷，而大豆苷元和染料木素含量較少。苗期耐鹽系數(shù)是大豆耐鹽性鑒定的重要指標(biāo)之一，耐鹽系數(shù)值越大，表示耐鹽性越強。把籽粒中大豆異黃酮含量與相應(yīng)材料幼苗的耐鹽系數(shù)作相關(guān)性分析，其相關(guān)系數(shù)為0. 696，顯示兩者間具有極顯著正相關(guān)關(guān)系。大豆異黃酮也是耐鹽型和鹽敏感型大豆中具有顯著差異的主要次生代謝物之一。因此，大豆異黃酮可作為大豆耐鹽性鑒定的參考指標(biāo)之一，通過測定籽粒中大豆異黃酮含量，無需發(fā)芽或苗期培養(yǎng)，即可對大量種質(zhì)進行批量快速的耐鹽性篩選和鑒定。有益效果與現(xiàn)有的大豆幼苗相比，本發(fā)明的利用外源大豆異黃酮浸種處理緩解大豆幼苗鹽害的方法具有的突出優(yōu)點，包括(1)操作簡便、成本低廉、緩解效應(yīng)明顯；(2) 發(fā)現(xiàn)內(nèi)源大豆異黃酮含量與大豆耐鹽性有極顯著正相關(guān)性，通過測定籽粒中大豆異黃酮組分與含量，無需發(fā)芽或苗期培養(yǎng)，即可對大量種質(zhì)進行批量快速的耐鹽性篩選和鑒定，能作為大豆耐鹽性鑒定的參考指標(biāo)之一 ；(3)在浸種時外源添加大豆苷或染料木苷，即使?jié)舛鹊椭?. 01 mg/L時，也能有效緩解鹽脅迫對大豆幼苗生長的抑制作用，效果顯著，對耐鹽性相對較弱的栽培大豆品種效果更明顯，在實際生產(chǎn)應(yīng)用過程中，能夠有效節(jié)約成本，具有一定的實用性。


圖1是N23674、4076、BB52用不同濃度的大豆苷或染料木苷溶液浸種后在100 mmol/L NaCl脅迫下生長的幼苗；其中A、B、C、D分別代表0、0. 01、0. 1、1 mg/L大豆苷或染料木苷溶液浸種處理，E代表無大豆苷或染料木苷浸種及鹽脅迫處理；
圖2是不同濃度大豆苷溶液浸種后于100 mmol/L NaCl脅迫下N23674生長的幼苗葉面積變化圖；D表示大豆苷溶液，濃度分別為0、0. 01,0. 1和lmg/L，Cotrol為對照；
圖3是不同濃度大豆苷溶液浸種后于100 mmol/L NaCl脅迫下4076生長的幼苗葉面積變化圖；D表示大豆苷溶液，濃度分別為0、0. 01,0. 1和lmg/L，Cotrol為對照；
圖4是不同濃度大豆苷溶液浸種后于100 mmol/L NaCl脅迫下BB52生長的幼苗葉面積變化圖；D表示大豆苷溶液，濃度分別為0、0. 01,0. 1和lmg/L，Control為對照；
4圖5是不同濃度染料木苷溶液浸種后于100 mmol/LNaCl脅迫下N23674生長的幼苗葉面積變化圖；G表示染料木苷溶液，濃度為0、0. 01,0. 1和1 mg/L，Cotrol為對照；
圖6是不同濃度染料木苷溶液浸種后于100 mmol/LNaCl脅迫下4076生長的幼苗葉面積變化圖；G表示染料木苷溶液，濃度為0、0. 01,0. 1和1 mg/L，Control為對照；
圖7是不同濃度染料木苷溶液浸種后于lOOmmol/LNaCl脅迫下BB52生長的幼苗葉面積變化圖；G表示染料木苷溶液，濃度為0、0. 01,0. 1和1 mg/L，Control為對照；
圖8是大豆苷(D)和染料木苷(G)浸種(0.01 mg/L)處理后，鹽脅迫下栽培大豆N23674 幼苗中大豆異黃酮含量圖9是大豆苷(D)和染料木苷(G)浸種(0. 01 mg/L)處理后，鹽脅迫下野生大豆BB52 幼苗中大豆異黃酮含量圖10是大豆苷(D)和染料木苷(G)浸種(0.01 mg/L)處理后，鹽脅迫下雜交后代4076 幼苗中大豆異黃酮含量圖11是材料籽粒中大豆異黃酮含量表圖，表中，同一列不同字母表示P < 0. 05。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。以下實施例所使用的材料和分析方法如下
材料以耐鹽性不同的代表性栽培大豆品種N23674 (江蘇溧水，耐鹽性較弱)和灘涂野大豆種群BB52(山東墾利，耐鹽性強)及其雜交后代F5代株系(4013、4035、4076和4111等) 為試驗材料。各材料籽粒中大豆異黃酮含量如圖11所示。分析方法用高效液相色譜法(HPLC)測定其籽粒中大豆異黃酮含量；籽粒中大豆異黃酮采用溫和水解法提取，以高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測(王松等，2005)。標(biāo)準品大豆苷(Daidzin)、染料木苷(Genistin)、大豆苷元(Daidzein)、染料木素(Genistein)純度 ^ 99%，樣品根據(jù)標(biāo)樣的出峰時間定性，根據(jù)峰面積定量。大豆異黃酮總量為上述4種大豆異黃酮含量之和。統(tǒng)計分析測量結(jié)果，并應(yīng)用SPSS軟件中的二元定距變量相關(guān)分析法將大豆異黃酮含量與相應(yīng)材料幼苗耐鹽系數(shù)作相關(guān)性分析。實施例1
分別稱取適量的大豆苷和染料木苷，先以少量DMSO溶解，最終配制成含1% (V/V)DMS0 的大豆苷溶液和染料木苷溶液，濃度分別為0.01 mg/L、0. 1 mg/L和1.0 mg/L。取大豆種子， 用上述不同濃度的大豆苷溶液、染料木苷溶液和1%(V/V)DMS0溶液分別浸種，恒溫箱25°C， IOh后催芽。取出以1% (V/V)DMS0溶液浸種的一半種子，用去離子水催芽(Control)，另一半種子用100 mmol/L NaCl溶液催芽(NaCl單獨處理)，其它處理均是用100 mmol/L NaCl 溶液催芽。各處理選取發(fā)芽一致者播于盛有石英砂的具孔塑料杯中。除對照置于盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中，其余處理均置于含有100 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中。在適宜的光照和溫度下培養(yǎng)，處理液每纊3d更換一次。觀察幼苗的生長情況，拍照并計算葉面積形態(tài)指標(biāo)。如圖1所示，從大豆幼苗生長外觀上即可看出，100 mmol/ L NaCl的脅迫下，N23674、4076和BB52的幼苗生長均受到抑制，而經(jīng)過大豆苷或染料木苷浸種處理后，栽培大豆N23674品種和雜交后代4076株系幼苗生長所受的抑制作用均得到明顯緩解，野大豆BB52種群此效應(yīng)不明顯。葉面積指標(biāo)分析結(jié)果如圖2、圖3、圖4、圖5、圖6和圖7所示，表明大豆苷或染料木苷三個處理濃度之間的緩解效果多未達到顯著差異水平，但從生產(chǎn)應(yīng)用過程中節(jié)約成本的角度，優(yōu)選最低濃度進行。實施例2
根據(jù)實施例1的結(jié)果，選擇0. 01 mg/L的大豆苷溶液和染料木苷溶液進行浸種處理，每種材料的種子分別用1% (V/V) DMSO溶液、0. 01 mg/L的大豆苷溶液、0. 01 mg/L的染料木苷溶液于25°C恒溫箱內(nèi)浸種10h，然后置于發(fā)芽床上避光催芽，選取發(fā)芽一致者播于盛有石英砂的具孔塑料杯中，置于盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中，適宜的光照和溫度下培養(yǎng)，處理液每纊3d更換一次。待第1對真葉長出時，移苗至具孔的泡沫板上，在盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中進行水培。當(dāng)幼苗長至第1片復(fù)葉展開時，將1% DMSO溶液浸種處理的材料分成兩組，一組為對照(Control，1/2 Hoagland營養(yǎng)液)，另一組為NaCl單獨處理(NaCl，用l/2Hoagland營養(yǎng)液配制的130 mmol/L NaCl溶液)，其它的均用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液配制的130 mmol/L NaCl溶液進行水培，大豆苷浸種的處理命名為NaCl+D，染料木苷浸種的處理命名為NaCl+G。營養(yǎng)液或處理液每2d更換1次，處理6d后，分為根、莖、葉三部分取樣，采用HPLC法分別測定其大豆異黃酮含量。鹽脅迫下，大豆幼苗組織中的大豆異黃酮含量較對照有明顯增加，而兩種大豆異黃酮外源浸種處理則可使大豆異黃酮含量增加得更高，在栽培大豆N23674品種和雜交后代4076株系幼苗上表現(xiàn)更為明顯，如圖8、圖9和圖10所示。這說明鹽脅迫下和外源大豆異黃酮浸種處理后，均能通過提高大豆幼苗的內(nèi)源大豆異黃酮水平，以適應(yīng)鹽脅迫或緩解
權(quán)利要求
1.一種利用外源大豆異黃酮緩解大豆幼苗鹽害的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用DMSO溶解大豆異黃酮，配置成含1%DMSO的大豆異黃酮水溶液，濃度不大于1. 0 mg/L ；(2)用大豆異黃酮水溶液浸大豆種子，恒溫箱25°C，浸種10h后置于發(fā)芽床上避光催芽；(3)取發(fā)芽苗播于盛有石英砂的具孔塑料杯中，置于盛有1/2Hoagland營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中，光照培養(yǎng)，營養(yǎng)液每2 3d更換一次；(4)待第1對真葉長出時，移苗至具孔的泡沫板上，在盛有用1/2Hoagland營養(yǎng)液配制的10(T130 mmol/L NaCl溶液的周轉(zhuǎn)箱中進行培養(yǎng)，觀察幼苗的生長情況，拍照并測定其葉面積；處理6d后，分為根、莖、葉三部分取樣，采用HPLC法分別測定其大豆異黃酮含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用外源大豆異黃酮緩解大豆幼苗鹽害的方法，其特征在于步驟(1)中，大豆異黃酮水溶液的濃度為0. 01 mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用外源大豆異黃酮緩解大豆幼苗鹽害的方法，其特征在于所述大豆異黃酮水溶液為大豆苷溶液或染料木苷溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用外源大豆異黃酮緩解大豆幼苗鹽害的方法，包括(1)用DMSO溶解大豆異黃酮，配置成含1%DMSO的大豆異黃酮水溶液，濃度不大于1.0mg/L；(2)用大豆異黃酮水溶液浸大豆種子，恒溫箱25℃，浸種10h后置于發(fā)芽床上避光催芽；(3)取發(fā)芽苗播于盛有石英砂的具孔塑料杯中，置于盛有1/2Hoagland營養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中，光照培養(yǎng)，營養(yǎng)液每2~3d更換一次；(4)待第1對真葉長出時，移苗至具孔的泡沫板上，在盛有用1/2Hoagland營養(yǎng)液配制的100~130mmol/L NaCl溶液的周轉(zhuǎn)箱中進行培養(yǎng)，觀察幼苗生長狀況和測定葉面積；并在處理6d后，分為根、莖、葉三部分取樣，采用HPLC法分別測定其大豆異黃酮含量。該方法可增強大豆幼苗的耐鹽性，有效緩解大豆幼苗的鹽害，對耐鹽性弱的大豆材料效應(yīng)更明顯。
文檔編號A01C1/02GK102282931SQ201110176148
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者周強, 於丙軍, 武玉妹 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)