專利名稱：一種利用小型簡(jiǎn)易生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根生產(chǎn)人參皂苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利涉及利用一種小型簡(jiǎn)易生物反應(yīng)器，人工室內(nèi)培養(yǎng)人參不定根，并從中提取人參皂苷的技術(shù)，屬農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人參(Panax ginseng C. A. May.)為五加科(Araliaccae)人參屬名貴中藥植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，被譽(yù)為藥中之王。人參化學(xué)成分復(fù)雜，其中主要藥用成分為各種人參皂苷，其制品及皂苷提取物具有廣闊的世界市場(chǎng)。但人參5 6年栽培的漫長(zhǎng)周期使各項(xiàng)管理技術(shù)、土地、病蟲、農(nóng)殘等問(wèn)題成為栽培人參難以跨越的障礙。因此，利用生物反應(yīng)器規(guī)?；囵B(yǎng)細(xì)胞成為解決上述問(wèn)題的有效方法之一。生物反應(yīng)器具有工作體積大、單位 體積生產(chǎn)能力高、物理和化學(xué)條件控制方便、隨時(shí)隨地規(guī)模化生產(chǎn)等許多優(yōu)點(diǎn)。目前，人參細(xì)胞生物反應(yīng)器規(guī)?；囵B(yǎng)已獲得成功[Liu S等，Process Biochem, 1998, 33 (I) =69-79,FuruyaT等，Planta Med，1983，48 :83_87]。但有研究認(rèn)為，人參不定根和毛狀根中的人參阜苷含量比愈傷組織(細(xì)胞)中多[Yu Kff, Chungbuk National University, Korea, 2000,博士論文]。因此，人參不定根生物反應(yīng)器培養(yǎng)更引人注目。韓國(guó)該方面的研究處于世界領(lǐng)先地位，Choi等報(bào)道了利用500L生物反應(yīng)器規(guī)?；囵B(yǎng)人參不定根的中試研究結(jié)果[ChoiSE 等 Plant Cell Tissue Organ Cult，2000，62 :187-193.]。而我國(guó)對(duì)人參不定根生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)的技術(shù)研究卻相對(duì)較少。例如，樸炫春等報(bào)道了利用5L氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根的生長(zhǎng)周期，但未測(cè)定其皂苷的累積[樸炫春等，林業(yè)科技，2007，32 (6)54-56]。黃滔等優(yōu)化了搖瓶培養(yǎng)人參不定根系統(tǒng)，還未進(jìn)行生物反應(yīng)器培養(yǎng)[黃滔等，中國(guó)中藥雜志，2010,35(1) :13-17] 0本發(fā)明通過(guò)一種簡(jiǎn)單的小型玻璃生物反應(yīng)器(3 10L)，確定小規(guī)模培養(yǎng)人參不定根和生產(chǎn)人參阜苷的方法；目的是提供一種更加簡(jiǎn)單、室內(nèi)大量人工培養(yǎng)人參不定根的方法，為大規(guī)模培養(yǎng)人參不定根生產(chǎn)人參皂苷，提供技術(shù)參數(shù)，或?yàn)榇笠?guī)模生產(chǎn)提供人參不定根種子培養(yǎng)方法；或?yàn)檫M(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)人參不定根生產(chǎn)人參皂苷提供技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
首先將人參不定根在含有3. 0mg/L IBA的1/2SH固體培養(yǎng)基中大量繁殖。然后將人參不定根切成Icm長(zhǎng)，接種在裝有I. 5L 1/2SH (加有3. 0mg/L IBA和20g/L蔗糖)培養(yǎng)基、總體積為3L的生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)。定期取材測(cè)定不定根鮮重和干重、生長(zhǎng)量及3種人參皂苷含量(Rgl+Re+Rbl)，繪制不定根生長(zhǎng)和皂苷累積的動(dòng)態(tài)曲線，確定其生長(zhǎng)周期以及最佳收獲時(shí)間為7周。然后，在總體積為3L的生物反應(yīng)器中加入含有20g/L蔗糖的1.5L 1/2SH培養(yǎng)基(加有3. 0mg/L IBA)，接種8g人參不定根段。培養(yǎng)7周后收獲，其不定根人參皂苷含量(Rgl+Re+Rbl)及產(chǎn)量最高，分別為5. 16mg/g，30. 7Imgo按照上面的蔗糖濃度，在總體積為5和10L的生物反應(yīng)器中[分別裝有3和6L 1/2SH培養(yǎng)基(加有3. Omg/L IBA和20g/L蔗糖)]，初始接種人參不定根的鮮重分別為15和30g時(shí)，培養(yǎng)7周后它們壓、15分鐘))后使用的。培養(yǎng)環(huán)境為常規(guī)組織培養(yǎng)室(溫度24 26°C，光照強(qiáng)度1000 1500Lx，光/暗周期16h/8h，濕度60% 70% )的。本發(fā)明的優(yōu)越特征I、小型生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于操作2、利用小型生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定可以在人為控制條件下，隨時(shí)隨地生產(chǎn)人參不定根3、小型生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根無(wú)任何細(xì)菌病毒、重金屬污染，安全4、小型生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人參不定根中的人參皂苷Rgl和Re含量與大田栽培的人參含量相差不大


圖I生物反應(yīng)器示意圖a.薄膜空氣濾器；b.玻璃罐體；c.空氣噴頭；d.空氣流量計(jì)；e.空氣壓力泵；f.進(jìn)氣口 ；g.出氣口。圖2標(biāo)準(zhǔn)品(A)、生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根(B)和栽培4年人參根(C)中人參皂苷 Rgl、Re、Rbl 的 HPLC 圖譜圖3人參不定根的生物反應(yīng)器增殖培養(yǎng)A.繼代的人參不定根；B.人參不定根在生物反應(yīng)器培養(yǎng)；C. B中干燥的人參不定根圖4 3L生物反應(yīng)器中不定根生長(zhǎng)(A)和皂苷累積⑶的動(dòng)態(tài)曲線
具體實(shí)施例方式實(shí)例I確定小型生物反應(yīng)器內(nèi)人參不定根收獲周期I)小型玻璃生物反應(yīng)器所用小型生物反應(yīng)器為總體積3、5和IOL的氣升式小型玻璃生物反應(yīng)器自己開(kāi)發(fā)，北京玻璃儀器公司定制。2)人參不定根材料人參不定根的生物反應(yīng)器培養(yǎng)都在溫度為(25±2)°C培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)。人參不定根最初從韓國(guó)江原道野生山參(Panax ginseng C. A. May.)的須根(由韓國(guó)江原大學(xué)山林科學(xué)學(xué)院崔龍義教授鑒定)在1/2SH+3. Omg/L IBA+20g/L蔗糖+3. Og/L脫乙酰吉蘭糖膠(Gelrite)的固體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)而來(lái)，然后多次繼代增殖。3)三種人參皂苷(Rgl、Re、Rbl)的分析方法人參皂苷采用超聲提取精密稱取I. Og樣品粉末，IOmL 80%甲醇浸泡過(guò)夜，次日以80%甲醇室溫超聲提取3次，每次IOmL提取30min，合并提取液。80°C水浴減壓蒸干溶齊U，以20%乙腈溶解并定容至一定體積，搖勻，以O(shè). 45 μ m微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。人參皂苷的高效液相色譜(HPLC)分析方法流動(dòng)相為乙腈水按表I進(jìn)行線性梯度洗脫(v/v);流速1.0mL/min，柱溫25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)203nm，進(jìn)樣量20yL。利用上述條件分析3種人參皂苷標(biāo)品(Rgl、Re、Rbl)和樣品。3種人參皂苷的保留時(shí)間分別為Rgl 23. 46min, Re 24. 45min, Rbl 37. 25min。它們的回歸曲線和回歸系數(shù)分別為Rgl y = 4273. 8x+31641, R2 = O. 9991 ；Re y = 5602. 4x+47471, R2 = 0. 9994 ；Rbl y =4529. 9x+13221, R2 = O. 9994。表I乙腈/水流動(dòng)相梯度表(v/v)
時(shí)間乙腈水
O 13208013 3020 - 2580 — 75
30 3525 - 4075 — 60
35 4040 - 2060 - 80人參阜苷產(chǎn)量的計(jì)算方法人參阜苷產(chǎn)量(mg)=人參阜苷含量(mg/g) X人參不 定根生長(zhǎng)量(g)4) 3L生物反應(yīng)器培養(yǎng)人參不定根將增殖的人參不定根切成Icm長(zhǎng)，接種在裝有I. 5L 1/2SH (加有3. Omg/L IBA和20g/L蔗糖)培養(yǎng)基、總體積為3L的生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)。初始接種量(鮮重)為Sg。重復(fù)3 4個(gè)生物反應(yīng)器。每周取材I次，置于(60±1)1的烘箱中干燥4811后稱量干重，計(jì)算不定根生長(zhǎng)量不定根生長(zhǎng)量(g)=最終收獲不定根鮮/干重(g)_初始接種不定根鮮/重(g)及3種人參皂苷含量(Rgl+Re+Rbl)，繪制不定根生長(zhǎng)和皂苷累積的動(dòng)態(tài)曲線，從中確定其生長(zhǎng)周期以及最佳收獲時(shí)間為7周。實(shí)例2確定培養(yǎng)基中合適的蔗糖濃度在總體積為3L的生物反應(yīng)器中加入含有不同濃度蔗糖(20、40和60g/L)的I. 5L1/2SH培養(yǎng)基(加有3. Omg/L IBA)，接種8g人參不定根段。每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)7周后收獲，統(tǒng)計(jì)及測(cè)定人參不定根的生長(zhǎng)及皂苷的累積如表2。蔗糖濃度為40g/L時(shí)，人參不定根的生長(zhǎng)量達(dá)到最大值7. 30g，比蔗糖濃度為60g/L時(shí)的生長(zhǎng)量略高，而遠(yuǎn)高于20g/L蔗糖濃度時(shí)不定根最低的生長(zhǎng)量5. 95g。人參皂苷含量隨蔗糖濃度的增加而降低，蔗糖濃度最低(20g/L)時(shí)，皂苷含量達(dá)到最大值5. 16mg/g。20和40g/L濃度蔗糖下，人參皂苷產(chǎn)量沒(méi)有顯著差異，但都比60g/L蔗糖濃度下人參皂苷產(chǎn)量高。從節(jié)省的角度考慮培養(yǎng)應(yīng)該選用20g/L的蔗糖濃度。表2培養(yǎng)基中蔗糖濃度對(duì)人參不定根生長(zhǎng)和人參皂苷累積的影響
~鹿糖濃度人參不定根生長(zhǎng)量/人參皂苷含量人參皂苷產(chǎn)量
(g/L)(干重，g)(mg/g)(mg)
205.95 + 0. 14 c5. 16 + 0.04 a30. 71±0. 14 a
407. 30±0. 13 a4. 21±0. 04 b30. 77±0. 11 a
607.00±0.15b3.90±0.05c27.95土0.50 b注運(yùn)用Duncan多重比較,相同字母為相差不顯著(P < 0. 05)。下同。實(shí)例3確定生物反應(yīng)器內(nèi)人參不定根的最佳初始接種量
總體積為5和IOL的生物反應(yīng)器中[分別裝有3和6L 1/2SH培養(yǎng)基(加有3. Omg/L IBA和20g/L蔗糖)]，初始接種人參不定根的鮮重分別為10、15、20g和20、25、30g，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)7周后收獲，不定根的生長(zhǎng)量和皂苷累積情況統(tǒng)計(jì)如表3和表4。5L生物反應(yīng)器中不定根的生長(zhǎng)量隨初始接種量的增加而增加。低接種量(IOg)時(shí)，不定根生長(zhǎng)量最低，為6. 21g ;中等及較高水平的接種量(15和20g)均對(duì)不定根的生長(zhǎng)更為有利，但兩者間差距不顯著(9. 29和9. 36g)。人參皂苷含量在高接種量(20g)時(shí)明顯降低(4. 42mg/g);較低及中等接種量(10和15g)時(shí)人參皂苷的含量較高，且差異不顯著(5. 25和5. 16mg/g)。在5L生物反應(yīng)器中，中等水平的初始接種量(15g)最有利于人參皂苷的生產(chǎn)，其產(chǎn)量最高(48. 25mg)，遠(yuǎn)高于低接種量時(shí)人參皂苷的最低產(chǎn)量(32. 64mg)。表3 5L生物反應(yīng)器中初始接種量對(duì)人參不定根和人參皂苷累積的影響
權(quán)利要求
1.一種利用小型簡(jiǎn)易生物反應(yīng)器(3 10L)培養(yǎng)人參不定根生產(chǎn)人參阜苷的方法,其特征在于 長(zhǎng)度約I. Ocm、鮮重8g的人參不定根培養(yǎng)在裝有2. OL 1/2SH培養(yǎng)基的3L反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含3. Omg/L IBA和20g/L蔗糖。人參不定根生長(zhǎng)和 三種人參皂苷(Rgl、Re、Rbl)累積的最佳收獲期為7周；3L生物反應(yīng)器中，相同培養(yǎng)基中含20g/L、40g/L兩個(gè)蔗糖濃度對(duì)人參和三種人參皂苷累積較佳；5和IOL生物反應(yīng)器內(nèi)最佳初始量分別為15和30g。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用小型玻璃生物反應(yīng)器(3～10L)培養(yǎng)人參不定根的方法。首先將長(zhǎng)度約1.0cm的人參不定根培養(yǎng)在裝有2.0L 1/2SH培養(yǎng)基的3L反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含3.0mg/L IBA和20g/L蔗糖。定期分析人參不定根的生長(zhǎng)和三種人參皂苷(Rg1、Re、Rb1)的累積，確定了人參不定根在生物反應(yīng)器內(nèi)的最佳收獲周期為7周。3L生物反應(yīng)器培養(yǎng)基中三種蔗糖濃度(20g/L、40g/L、60g/L)中，20g/L、40g/L兩個(gè)濃度的蔗糖對(duì)人參不定根的人參不定根的生長(zhǎng)和皂苷的累積優(yōu)于60g/L蔗糖，兩者無(wú)顯著差別，但從節(jié)約角度考慮，應(yīng)該選擇20g/L蔗糖濃度用于生產(chǎn)。該濃度下，人參皂苷含量和產(chǎn)量分別為5.16mg/g、30.71mg。5和10L生物反應(yīng)器內(nèi)在初始接種量分別為10、15、20g和20、25、30g中，最佳量分別為15和30g，其不定根的生長(zhǎng)量分別為9.29和19.17g，皂苷含量分別為5.16和4.58mg/g。生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)7周的人參與栽培4年的人參相比，人參皂苷Rg1和Re含量相差不大；栽培人參中Rb1的含量遠(yuǎn)高于生物反應(yīng)器中培養(yǎng)得人參不定根中的含量。本發(fā)明可為人參不定根的小規(guī)模和進(jìn)一步擴(kuò)大化培養(yǎng)提供技術(shù)支持和參數(shù)，也可以作為大規(guī)模生產(chǎn)提供人參不定根種子生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102898493SQ20111021456
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月29日
發(fā)明者李玉花, 由香玲, 譚嘯, 代金玲, 吳昊 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué), 李玉花, 由香玲