專利名稱：利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根的方法。
背景技術(shù)：
東北刺人參el la tus Nakai)又名刺參,五加科刺參屬，多年生落葉灌木，是我國長白山特有的藥用植物。東北刺人參分布區(qū)域十分狹窄，主要分布于吉林省長白山區(qū)，俄羅斯、朝鮮也有少量分布。近10年來，由于人為大量采挖，自然資源遭到嚴重破壞。目前，長白山區(qū)天然東北刺人參資源已瀕臨滅絕，被列為國家二類保護植物，吉林省一類保護植物。東北刺人參的根和莖中含有多種皂苷、黃酮、揮發(fā)油、蒽醌、脂肪酸、蛋白質(zhì)、糖類和酚類等成分，以其干燥的根和莖作為藥材，功效可用于治療神經(jīng)衰弱、低血壓、糖尿病、精神憂郁等，且無任何毒副作用，在長白山區(qū)被稱作“木本人參”。東北刺人參具有抗衰老作用，用刺人參醇水提取物給小白鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)可延長小白鼠持續(xù)游泳的時間，耐缺氧能力提高64 %，檢測10多項與衰老相關(guān)指標的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有明顯的抗衰老作用。東北刺人參既可采用有性繁殖也可采用無性繁殖。但有性繁殖，因天然生長的東北刺人參結(jié)實率低，種子很少，偶爾采到的種子，發(fā)芽率很低。針對刺人參種子發(fā)芽率低的問題，劉繼生等采用種子層積處理法促進東北刺人參種胚后熟，從而使發(fā)芽率提高到56.8% ;但種子繁殖的苗木經(jīng)多年栽培后，因 病蟲害危害往往出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。刺人參無性繁殖包括分株、壓條或扦插等方式。其中分株法是利用有匍匐莖節(jié)間不定芽可獲得分生苗；壓條是在刺人參生長季節(jié)，選擇生長旺盛的長枝，并在節(jié)間刻傷組織后埋入土中，待小苗長出與母株分離后，成為獨立植株；扦插繁殖是用莖、根或帶芽的根莖作為插穗，用生長素處理后插入苗床，生根率較高，但移植成活率低。將通過無性繁殖得到的苗(扦插、壓條等)進行栽種，發(fā)現(xiàn)栽植后有假死現(xiàn)象，且恢復(fù)期生長期長。另外，無性繁殖的另一問題是，因種質(zhì)資源瀕危的現(xiàn)狀，繁殖材料來源短缺。東北刺人參也可通過組織培養(yǎng)，獲得種苗，但東北刺人參試管苗的馴化條件苛刻，成活率低，難以大量提供生產(chǎn)用苗。為了引種野生植株，1989年柳麗等利用仿生栽培技術(shù)，對刺人參進行引種試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺人參帶根移植成活率高，扦插苗成活率較低。此外，張順捷等也做了引種試驗，發(fā)現(xiàn)東北刺人參苗木在牡丹江地區(qū)引種可以成活。盡管如此，目前，東北刺人參尚未建立完善的苗木繁殖和人工栽培體系，所以在中藥及臨床應(yīng)用上存在資源短缺的問題，導(dǎo)致刺人參產(chǎn)品及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到阻礙。目前，因野生資源逐年匱乏，許多藥用植物都在進行人工栽培。但大田栽培時，植物生長受氣候、地理和季節(jié)的限制，且由于栽培管理中使用了農(nóng)藥化肥，導(dǎo)致有害物質(zhì)的殘留；同時有效物質(zhì)含量不穩(wěn)定、藥材與農(nóng)作物爭地等問題也是困擾我國中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展的難題。植物組織或器官培養(yǎng)物中有效成分含量高且穩(wěn)定，因此，以組織培養(yǎng)物代替其原植株作為藥源，是實現(xiàn)野生東北刺人參資源可持續(xù)利用的有效方式之一，這對拯救野生東北刺人參資源有著極其重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根的方法。具體是以東北刺人參種子誘導(dǎo)的不定根為材料，通過生物反應(yīng)器諸理化參數(shù)的調(diào)控，進而建立不定根反應(yīng)器培養(yǎng)體系，同時探明東北刺人參的抗氧化特性，為長白山區(qū)瀕危植物東北刺人參資源的保護和開發(fā)利用提供一種新方法。為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根的方法，在5 L生物反應(yīng)器中注入4 L MS培養(yǎng)基附加IBA 3 4 mg/L，白糖40 50 g/L，pH為5.8，注入空氣75 100 mL/min，接種20 40g不定根外植體進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)4(T50 d后獲得大量東北刺人參不定根，其中液體培養(yǎng)基的注入量與生物反應(yīng)器的體積呈倍性增加的關(guān)系，所述的生物反應(yīng)器為氣升式生物反應(yīng)器。本發(fā)明的氣升式生物反應(yīng)器是氣動式反應(yīng)器中的一種，其流動性均勻，提供低剪切力環(huán)境，結(jié)構(gòu)簡單，沒有其他生物反應(yīng)器(如攪拌式反應(yīng)器)所具有的如泄漏點和死角多等缺點。其主要的工作原理:氣體由反應(yīng)器底部的流量計和過濾膜進入反應(yīng)器，通過氣體分布裝置(噴嘴)霧狀噴入反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)基中，經(jīng)過氣液分離后在反應(yīng)器上部排除，從而帶動液體和培養(yǎng)物在反應(yīng)器的循環(huán)流動，達到攪拌目的。利用氣升式生物反應(yīng)器對東北刺人參不定根進行培養(yǎng)可以提高增殖速度，在短期內(nèi)獲得大量的外植體。同時從成本角度考慮，生物反應(yīng)器培養(yǎng)可減少培養(yǎng)基成本(瓊脂使用費)，另一方面又可以減少操作人員數(shù)，從而降低勞動強度和生產(chǎn)成本。因此，生物反應(yīng)器培養(yǎng)可為商業(yè)化生產(chǎn)提供一種新的途徑，并能解決目前東北刺人參野生植株瀕危及人工栽培難度大的問題，為長白山區(qū)瀕危植物東北刺人參資源的保護和開發(fā)利用提供一種新方法。 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明`實施例進行詳細說明。


圖1為本發(fā)明生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式如圖1，利用氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根，圖1中a:插頭；b:氣泵；c:空氣流量計；d:過濾膜；e:多孔噴嘴(孔徑15Mm) ； f:出氣口 ；箭頭表示空氣流動方向。具體實施步驟如下:
(一)材料與方法
1.東北刺人參不定根生物反應(yīng)器培養(yǎng) ①.1BA濃度的篩選
在5 L氣升式生物反應(yīng)器中，注入4 L液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為MS (植物組織培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基)加入不同濃度的IBA (吲哚乙酸)(2、3、4、5和6 mg/L)，pH調(diào)節(jié)5.8，在溫度121。。，壓力為1.2 kg/cm2的條件下高壓滅菌40 min，冷卻后注入反應(yīng)器中，然后在每個反應(yīng)器中接入 20 g 不定根，注入 50 mL/min (air volume/culture volume/min.)的空氣,在溫度為25±2 °C的條件下進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)40 d后調(diào)查不定根的鮮物重和干物重。②.白糖濃度的篩選
依據(jù)上述試驗結(jié)果，以白糖作為碳源，濃度設(shè)為30、40、50和60 g/L，其它條件同上，培養(yǎng)40 d后調(diào)查不定根的鮮物重和干物重。③.培養(yǎng)密度的篩選
依據(jù)上述試驗結(jié)果，在MS+IBA 3 mg/L+白糖50 g/L的培養(yǎng)基中，分別在每個反應(yīng)器內(nèi)接種10、20、30和40 g不定根，其它條件同上，培養(yǎng)40 d后調(diào)查不定根的鮮物重和干物重。④.空氣注入量的篩選
依據(jù)上述試驗結(jié)果，每個反應(yīng)器內(nèi)接種20 g不定根，暗培養(yǎng)，通氣量設(shè)置為50、75、100和125 mL/min，其它條件同上，培養(yǎng)40 d后調(diào)查不定根的鮮物重和干物重。⑤.培養(yǎng)天數(shù)的確定
依據(jù)上述實驗結(jié)果，通氣量設(shè)置為75 mL/min，其他條件同上，接種后5 d開始每隔
5d停止培養(yǎng)一個反應(yīng)器，調(diào)查不定根的鮮物重和干物重，直至第50 d。2.東北刺人參不定根的抗氧化活性
從東北刺人參反應(yīng)器培養(yǎng)40 d的不定根和栽培2年和5年植株根和莖中提取酚及多糖，比較酚和多糖含量，并采用DPPH自由基清除活性方法分析其抗氧化活性。(二)結(jié)果與分析
1.東北刺人參不定根生物反應(yīng)器培養(yǎng):..IBA濃度的篩選
植物生長調(diào)節(jié)劑對不定根生長影響很大，本試驗結(jié)果表明IBA濃度在31 mg/L范圍內(nèi)鮮物重和干物重較高，平均值分別達到332.9 g和29.7 g，其中IBA濃度為3 mg/L時鮮物重和干物重達到最大值，分別為378.3 g和34.8 g。當IBA濃度在3 4 mg/L范圍之外鮮物重和干物重逐漸下降，不定根的增殖率也呈下降的趨勢，在IBA濃度為3 mg/L時增殖系數(shù)最大，達到18.0。f.白糖濃度的篩選
將東北刺人參根切成約I Cm長，接種于MS附加IBA 3 mg/L的培養(yǎng)基中，30 d后調(diào)查結(jié)果，白糖濃度為4(T50 g/L時，不定根的增殖系數(shù)較大，平均值達到25.05，當白糖濃度為50 g/L時增殖系數(shù)最大，達到26.6，顯著好于其它處理。1.培養(yǎng)密度的篩選
本試驗結(jié)果表明反應(yīng)器內(nèi)接種密度為20 40 g時，不定根的鮮物重、干物重和增殖系數(shù)均較高，顯著好于其他處理，平均值分別達到355.47 g、32.47 g和12.23，當接種量為20g時，不定根的鮮物重、 干物重和增殖系數(shù)最大，分別為412.4 g、40.5 g和19.6，接種量增加產(chǎn)量下降不利于其生長。S.空氣注入量的篩選
反應(yīng)器中通入空氣，不僅能夠維持培養(yǎng)基中的氧氣濃度，而且對植物的生長以及代謝產(chǎn)物都起到作用。當通氣量為75 100 mL/min時，不定根長勢較好，鮮物重和干物重平均值分別達到346.7 g和35.25 g，其中通氣量為75 mL/min時鮮物重和干物重達到最大，分別為368.9 g和38.1 g,均好于其他處理。當通氣量為50 mL/min時,可能是由于氧氣不足鮮重和干重較少，當通氣量高于100 mL/min時生物量有所下降，由于氣體脅迫，不定根生長和分化效果不好。⑤.培養(yǎng)天數(shù)的確定
將東北刺人參不定根接種在含有MS+ IBA 3 mg.L—1+白糖50 g.L—1培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第
5d時幾乎沒有太大變化，10 d左右不定根開始膨大變粗，到15 d時，不定根開始分化出細根，18 d浮于液面上，不定根顏色較白，35 d之后不定根生長緩慢，在40飛0 d時鮮物重和干物重較高，其中40 d時干重達到最大26.3 g02.東北刺人參不定根的抗氧化活性
反應(yīng)器培養(yǎng)40 d刺人參不定根和2年生和5年生栽培刺人參根和莖中酚和多糖含量的比較，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器中培養(yǎng)40 d的東北刺人參不定根和栽培的刺人參在總酚含量上有區(qū)別，本試驗結(jié)果得出培養(yǎng)40 d后的不定根的總酚含量明顯高于栽培刺人參根和莖中的含量，不定根中總酚達到56 mg/g DW，產(chǎn)量達到490.0 mg/L，栽培的刺人參根和莖中總酚含量很接近，根中略高。多糖方面，不定根中含量和2年生刺人參中的含量相接近，達到70.0 mg/gDW，產(chǎn)量達到 612.5 mg/L。同時，還可以看出反應(yīng)器生產(chǎn)的不定根的多糖提取液和酚提取物對DPPH自由基有較明顯的清除能力，且清除能力隨著濃度的升高而增強。其中，酚提取物對DPPH消除率從26.6 %增長至94 %，而栽培2年生和5年生的無論是根還是莖的提取液在濃度為0.8mg/L時只達到了 50 %左右。在相同的濃度下，反應(yīng)器中不定根的多糖和酚溶液的消除率均顯著高于2年生和5年生的栽培刺人參。東北刺人參不定根具有較高的抗氧化活性，因此作為抗氧化藥物的開發(fā) ，有很高的利用價值。
權(quán)利要求
1.一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根的方法，在5 L生物反應(yīng)器中注入4 LMS培養(yǎng)基附加IBA 3 4 mg/L,白糖40 50 g/L，pH為5.8，注入空氣75 100 mL/min，接種2(T40 g不定根外植體進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)4(T50 d后獲得大量東北刺人參不定根，其中液體培養(yǎng)基的注入量與生物反應(yīng)器的體積呈倍性增加的關(guān)系，所述的生物反應(yīng)器為氣升式生物反應(yīng)器。`
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)東北刺人參不定根的方法，在5L氣升式生物反應(yīng)器中注入4LMS培養(yǎng)基附加IBA3~4mg/L，白糖40~50g/L，pH為5.8，注入空氣75~100mL/min，接種20~40g不定根外植體進行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)40~50d后獲得大量東北刺人參不定根。所獲得的東北刺人參不定根總酚含量均高于2年生和5年生栽培刺人參根和莖中的含量；不定根中多糖含量與2年生栽培刺人參根中的含量接近；本發(fā)明可以提高增殖速度，在短期內(nèi)獲得大量的外植體。生物反應(yīng)器培養(yǎng)可減少培養(yǎng)基成本，又降低勞動強度和生產(chǎn)成本，解決目前東北刺人參野生植株瀕危及人工栽培難度大的問題，為商業(yè)化生產(chǎn)提供一種新的途徑。
文檔編號A01H4/00GK103141394SQ20131010190
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者廉美蘭, 樸炫春, 高日, 于丹, 吳春花, 吳松權(quán) 申請人:延邊大學(xué)