專(zhuān)利名稱：一種提高牡蠣體內(nèi)dha含量的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高牡蠣體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分的育種方法，具體說(shuō)是一種提高牡蠣體內(nèi) DHA含量的育種方法。
背景技術(shù)：
DHA (二十二碳六烯酸，22:6n-3)，俗稱“腦黃金”，是人體必需的一種長(zhǎng)鏈多價(jià)不飽和脂肪酸，是大腦細(xì)胞膜的重要構(gòu)成成分，參與腦細(xì)胞的形成和發(fā)育，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞軸突的延伸和新突起的形成有重要作用，可維持神經(jīng)細(xì)胞的正常生理活動(dòng)，參與大腦思維和記憶形成過(guò)程。DHA還是視網(wǎng)膜光受體中最豐富的長(zhǎng)鏈多價(jià)不飽和脂肪酸，是視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，對(duì)促進(jìn)視網(wǎng)膜組織的發(fā)育，促進(jìn)視功能的發(fā)展，改善視敏銳性等具有重要作用。DHA同維生素、礦物質(zhì)一樣也是人體的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在人體大腦皮層中含量高達(dá)20%在人體大腦皮層中含量高達(dá)20%，在眼睛視網(wǎng)膜中所占比例最大，約占50%。因此，對(duì)胎嬰兒智力和視力發(fā)育至關(guān)重要，同時(shí)也可有效地預(yù)防老年癡呆、視力衰退等。近年研究表明，DHA還能夠降低膽固醇、抑制血小板聚集，從而預(yù)防心血管疾病。此外，DHA還具有很強(qiáng)的抗氧化功能，能夠提高機(jī)體免疫力、阻止腫瘤細(xì)胞的增生。然而，人體不能夠自己合成DHA，必須從食物中獲得。因此，如何提高食物中的DHA含量越來(lái)越引起人們的重視。
牡蠣俗稱“蠔”、“海蠣子”等，味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白含量高，素有“海洋牛奶” 之稱。牡蠣中也含有較高的不飽和脂肪酸，其含量通常在4. 74%-19. 96%。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，牡蠣重鎮(zhèn)安神，潛陽(yáng)補(bǔ)陰，軟堅(jiān)散結(jié)，收斂固澀；對(duì)于驚悸失眠、勞神傷脾、陽(yáng)萎、腰痛、崩漏等癥有療效。因品種和地區(qū)的差異，牡蠣的營(yíng)養(yǎng)成分也有一定的差別。
牡蠣也是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的種類(lèi)。據(jù)世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，全世界僅太平洋牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量在2003年就已達(dá)到440萬(wàn)噸。我國(guó)是貝類(lèi)養(yǎng)殖大國(guó)，同時(shí)也是牡蠣養(yǎng)殖大國(guó)，2009年，牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)350. 38萬(wàn)噸，占養(yǎng)殖貝類(lèi)總產(chǎn)量的32. 55%。近10年來(lái)我國(guó)牡蠣產(chǎn)量一直呈上升趨勢(shì)。目前，我國(guó)養(yǎng)殖的牡蠣多為巨蠣屬種類(lèi)，如太平洋牡販C 、近江牡販C、香港巨牡販C Ao/ 政葡萄牙牡販C angulata等。然而，由于養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，“水蠣子”日漸增多，導(dǎo)致牡蠣的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)不斷下降，嚴(yán)重地影響了牡蠣的產(chǎn)量和效益。因此，必須尋求一種方法來(lái)提高牡蠣的營(yíng)養(yǎng)成分，解決養(yǎng)殖牡蠣營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)下降問(wèn)題。
“同源遠(yuǎn)交”指的是源自于同一物種的不同亞種(種群)間的個(gè)體或群體水平的交配。眾所周知，雜交是動(dòng)植物遺傳改良的重要手段，其目的就是為了獲得雜種優(yōu)勢(shì)。雜種優(yōu)勢(shì)是指兩個(gè)遺傳背景不同的親本雜交產(chǎn)生的雜種F1在生長(zhǎng)勢(shì)、生活力、生殖力、抗逆性、產(chǎn)量和品質(zhì)上比親本的一方或雙親優(yōu)越的現(xiàn)象。但并不是所有雜交都能夠產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)。當(dāng)雜種的表型超越雙親表型的平均值時(shí)，這樣的雜交產(chǎn)生了雜種優(yōu)勢(shì)，當(dāng)雜種的表型值低于雙親表型的平均值時(shí)，這樣的雜交就產(chǎn)生了雜種衰退。研究表明，牡蠣的種間遠(yuǎn)源雜交絕大多數(shù)是不成功的。然而，利用種內(nèi)不同亞種或不同地理種群的同源遠(yuǎn)交方法改良牡蠣品種性狀卻取得了可喜的進(jìn)展，大多能夠產(chǎn)生正的雜種優(yōu)勢(shì)。但迄今為止，利用同源遠(yuǎn)交的育種方法提高牡蠣體內(nèi)DHA含量卻一直沒(méi)有報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為了提供一種簡(jiǎn)便、目標(biāo)明確地提高牡蠣營(yíng)養(yǎng)成分的育種方法，來(lái)解決我國(guó)牡蠣養(yǎng)殖營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)下降的問(wèn)題，從而推動(dòng)我國(guó)牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
本發(fā)明的技術(shù)方案是種貝選擇、純種鑒定及性腺促熟、雜種與純種組合的建立、 苗種培育與稚貝養(yǎng)成、DHA含量測(cè)定與比較等過(guò)程，可使雜種的DHA含量顯著提高，其操作步驟為1、種貝選擇、純種鑒定及性腺促熟種貝必須源自于同一種牡蠣的不同亞種或種群的純種，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)親本進(jìn)行純種鑒定，通過(guò)人工方法調(diào)控種貝性腺同步成熟。
2、雜種與純種組合的建立以性腺成熟的種貝為材料，解剖分別獲得精子和卵子。 然后采用種內(nèi)亞種間或種群間遠(yuǎn)交產(chǎn)生雜種組。同時(shí)，采用亞種內(nèi)或種群內(nèi)交配產(chǎn)生源自同一親本的純種組，作為雜種組的對(duì)照組。
3、幼蟲(chóng)培育與稚貝養(yǎng)成包括幼蟲(chóng)的培育密度、餌料、水溫、鹽度；稚貝為了降低環(huán)境效應(yīng)，雜種組和純種組從幼蟲(chóng)、稚貝，到成貝期間一直養(yǎng)殖在相同的環(huán)境條件下。
4、DHA含量的測(cè)定與比較采用氣相色譜測(cè)定雜種和純種牡蠣的DHA含量，然后雜種組與純種組進(jìn)行比較。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下1、通過(guò)I代雜交就可使牡蠣體內(nèi)的DHA含量顯著地提高20 %以上，效率高。
2、首次從提高多不飽和脂肪酸含量的角度改良養(yǎng)殖貝類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，開(kāi)辟了貝類(lèi)品種培育的新途徑，為其他貝類(lèi)新品種的培育起到了示范作用。
3、鑒于DHA對(duì)醫(yī)療、保健等方面的特殊作用，DHA含量的提高可也可提高牡蠣產(chǎn)品的附加值，經(jīng)濟(jì)價(jià)值得到提高，增加養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶的收入，市場(chǎng)前景廣闊。
4、本方法不需要轉(zhuǎn)基因、藥物處理等技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，實(shí)用性強(qiáng)。
本發(fā)明是一種提高牡蠣營(yíng)養(yǎng)成分的方法，通過(guò)這種技術(shù)可顯著提高牡蠣體內(nèi)的 DHA含量。這種方法培育的牡蠣由于富含DHA，在醫(yī)療和保健等方面具有特殊價(jià)值。通過(guò)本發(fā)明可提高牡蠣的營(yíng)養(yǎng)品種和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有效地遏制目前養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)品價(jià)格賤、產(chǎn)值低等問(wèn)題，為高值化牡蠣品種的培育提供一條新途徑。本發(fā)明不需要通過(guò)轉(zhuǎn)基因、藥物處理等復(fù)雜技術(shù)，因此該產(chǎn)品對(duì)生物和環(huán)境安全沒(méi)有影響。
具體實(shí)施方式
1、種貝選擇、純種鑒定及性腺促熟2010年6月，從汕頭和青島兩地各選擇100 個(gè)健康、無(wú)損傷的I齡牡蠣為種貝。先各取10個(gè)，通過(guò)形態(tài)學(xué)和16S測(cè)序?qū)ΨN貝進(jìn)行純種鑒定，結(jié)果表明青島養(yǎng)殖的牡販為Crassos trea gigas gigas、汕頭養(yǎng)殖的牡販為 Crassostrea gigas二者都屬于太平洋牡販個(gè)種、均為純種,但屬于不同亞種。 來(lái)自青島養(yǎng)殖的牡蠣簡(jiǎn)稱青島牡蠣、來(lái)自汕頭養(yǎng)殖的的牡蠣簡(jiǎn)稱汕頭牡蠣。種貝先在海區(qū)自然催熟半個(gè)月，然后再移到室內(nèi)、放在4個(gè)500L的聚乙烯桶中對(duì)性腺進(jìn)行人工促熟。每天換水2-3次、以亞心形扁藻+叉鞭金藻+酵母混合投喂、不間斷充氣。約10天左右，種貝性腺可同步成熟。
2、雜種和純種組合的建立以性腺成熟的青島牡蠣和汕頭牡蠣為種貝，解剖分別獲得各自的精子和卵子。每個(gè)亞種的雌雄種貝都用20個(gè)，接著將同一雜種的卵子混在一起并等分為兩部分、同一亞種的精子也混在一起。然后取適量的青島牡蠣精子與汕頭牡蠣卵子受精進(jìn)行亞種間雜交，建立了同源雜種組；同時(shí)取適量的青島牡蠣精子與青島牡蠣卵子受精、取適量的汕頭牡蠣精子與汕頭牡蠣卵子受精進(jìn)行亞種內(nèi)近交，建立了兩個(gè)同源純種組，作為雜種組的對(duì)照組。在27°C -28°C、鹽度31-32條件下，經(jīng)過(guò)24h，受精卵發(fā)育至D型幼蟲(chóng)。
3、幼蟲(chóng)培育與稚貝養(yǎng)成幼蟲(chóng)培育在室內(nèi)進(jìn)行，主要包括培育密度、餌料、水溫、鹽度；稚貝養(yǎng)成在海上進(jìn)行。用300目篩絹網(wǎng)收集D型幼蟲(chóng)放入500L的聚乙烯桶中充氣培育。幼蟲(chóng)培育的初始密度約2個(gè)/ml、每個(gè)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。幼蟲(chóng)的餌料以等邊金藻和扁藻為主，每日投餌3次，投餌量前3天每次I萬(wàn)個(gè)藻類(lèi)細(xì)胞/ml、接下來(lái)7天每次5萬(wàn)個(gè)藻類(lèi)細(xì)胞/ml、之后每次投喂10萬(wàn)個(gè)藻類(lèi)細(xì)胞/ml ;每日換水I次，殼頂期和出眼點(diǎn)時(shí)將幼蟲(chóng)換入其他干凈的500L的聚乙烯桶中培育。每?jī)商鞂?duì)幼蟲(chóng)培養(yǎng)密度進(jìn)行定量，并通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)水體以使每個(gè)培育桶中的幼蟲(chóng)密度基本一致。幼蟲(chóng)培育期間不加抗生素。15天后，幼蟲(chóng)眼點(diǎn)率超過(guò)30 %，投放牡蠣殼或扇貝殼等附著基，按每個(gè)附著基附著8-10個(gè)稚貝投放。投放附著基約I周后，幼蟲(chóng)全部變態(tài)為稚貝。稚貝在室內(nèi)500L的聚乙烯桶中繼續(xù)養(yǎng)殖I周，將附有稚貝的牡蠣殼或扇貝殼用繩子串起并做好標(biāo)記，在天氣晴朗的下午出池，掛到海上進(jìn)行稚貝養(yǎng)成；之后，定期檢查稚貝的生長(zhǎng)和存活情況。6個(gè)月后，可生長(zhǎng)到5cm-6cm。為了減少環(huán)境的影響，從幼蟲(chóng)、稚貝到養(yǎng)成階段，雜種組與純種組的養(yǎng)殖環(huán)境始終保持一直。
4、DHA含量的測(cè)定與比較從雜種組和純種組中各取15個(gè)成體牡蠣為材料,活體解剖獲得新鮮的軟體組織。同一種的軟體組織先攪勻、真空冷凍干燥再研磨成粉。先用氯仿-甲醇混合液抽提脂肪，然后用NaOH甲醇溶液對(duì)脂肪進(jìn)行甲酯化，最后用氣相色譜儀分析脂肪酸組分，測(cè)定出雜種組和純種組樣品中的DHA含量。雜種牡蠣的DHA含量達(dá)到 16. 24%、純種牡蠣的DHA含量平均值為12. 54%，然后對(duì)雜種與純種的DHA含量 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)雜種牡蠣體內(nèi)的DHA含量比純種牡蠣體內(nèi)的DHA含量高出了 29.51%。因此，同源遠(yuǎn)交能夠提高牡蠣體內(nèi)的DHA含量達(dá)20%以上。
顯然本發(fā)明能夠提高顯著地牡蠣體內(nèi)的DHA含量，從而可有效地遏制目前養(yǎng)殖牡蠣營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)低下的問(wèn)題，為高值化牡蠣品種的培育提供了一條新途徑。
權(quán)利要求
1.一種提高牡蠣體內(nèi)DHA含量的育種方法，包括下列步驟 (1)種貝選擇、純種鑒定及性腺促熟種貝必須源自于同一種牡蠣的不同亞種或種群的純種，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)親本進(jìn)行純種鑒定，通過(guò)人工方法調(diào)控種貝性腺同步成熟； (2)雜種與純種組合的建立以性腺成熟的種貝為材料，解剖分別獲得精子和卵子，每種種貝的雌雄個(gè)體數(shù)至少20個(gè)，然后采用種內(nèi)亞種間或種群間遠(yuǎn)交產(chǎn)生雜種組，同時(shí)，采用亞種內(nèi)或種群內(nèi)交配產(chǎn)生源自同一親本的純種組，作為雜種組的對(duì)照組； (3)幼蟲(chóng)培育與稚貝養(yǎng)成幼蟲(chóng)培育在室內(nèi)進(jìn)行，主要包括培育密度、餌料、水溫、鹽度；稚貝養(yǎng)成在海上進(jìn)行，幼蟲(chóng)培育的初始密度為2個(gè)/ml，每天全換水一次，充氣培育；餌料為等鞭金藻和亞心形扁藻，日投餌3次，投餌量前3天為I萬(wàn)個(gè)藻類(lèi)細(xì)胞/ml、接下來(lái)7天增加到5萬(wàn)個(gè)藻類(lèi)細(xì)胞/ml，之后增加到10萬(wàn)個(gè)藻類(lèi)細(xì)胞/ml ;每?jī)商鞂?duì)幼蟲(chóng)培養(yǎng)密度進(jìn)行定量，并通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)水體以使每個(gè)培育桶中的幼蟲(chóng)密度基本一致，幼蟲(chóng)培育期間不加抗生素，當(dāng)209^30%的幼蟲(chóng)出現(xiàn)眼點(diǎn)時(shí)，投放處理好的牡蠣殼、扇貝殼等采苗器進(jìn)行采苗，按每個(gè)附著基附著8一10個(gè)稚貝投放,當(dāng)水體中的浮游幼蟲(chóng)全部附著變態(tài)后，繼續(xù)在室內(nèi)培養(yǎng)一周左右，然后將附有稚貝的牡蠣殼或扇貝殼用繩子串起并做好標(biāo)記，在天氣晴朗的下午出池，掛到海上進(jìn)行稚貝養(yǎng)成；之后，定期檢查稚貝的生長(zhǎng)和存活情況，6個(gè)月后，可生長(zhǎng)到5cm-6cm，為了降低環(huán)境效應(yīng)，雜種組和純種組從幼蟲(chóng)、稚貝，到成貝期間一直養(yǎng)殖在相同的環(huán)境條件下； (4)DHA含量的測(cè)定與比較從雜種組和純種組中各取至少15個(gè)成體牡蠣為材料，活體解剖獲得新鮮的軟體組織，同一種的組織先攪勻、真空冷凍干燥再研磨成粉，先用氯仿-甲醇混合液抽提脂肪，然后用NaOH甲醇溶液對(duì)脂肪進(jìn)行甲酯化，最后用氣相色譜儀分析脂肪酸組分，測(cè)定出雜種組和純種組樣品中的DHA含量并進(jìn)行比較。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高牡蠣體內(nèi)DHA含量的育種方法，利用來(lái)自于同一物種不同亞種或種群的純種牡蠣為親本，通過(guò)種內(nèi)亞種間或種群間同源遠(yuǎn)交能夠產(chǎn)生DHA含量高的雜種后代，本發(fā)明能夠提高牡蠣體內(nèi)的DHA含量達(dá)20%以上，效率高。本發(fā)明不需要轉(zhuǎn)基因、藥物處理等技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，實(shí)用性強(qiáng)。本發(fā)明能夠提高顯著地牡蠣體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分，從而可有效地遏制目前養(yǎng)殖牡蠣營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)低下的問(wèn)題，為高值化牡蠣品種的培育提供了一條新途徑，市場(chǎng)前景廣闊。
文檔編號(hào)A01K61/00GK103004648SQ20111028318
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者鄭懷平, 王迪文, 孫澤偉, 劉合露, 張濤, 林清, 孫穎 申請(qǐng)人:汕頭大學(xué)