專利名稱：海島棉脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其在纖維改良上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白，在棉花纖維中特異表達(dá)編碼該蛋白的基因能夠提高棉花品種的纖維長度。
背景技術(shù)：
利用基因工程手段提高棉花的纖維品質(zhì)包括棉花的纖維長度是當(dāng)前棉花分子育種的重要方向。植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LTP)是一類小分子堿性蛋白，占植物可溶性總蛋白的4%左右。LTP是一種多功能的蛋白家族，LTP蛋白家族的成員不僅參與了磷脂在生物膜之間的運(yùn)輸，而且還在生物膜、角質(zhì)和脂質(zhì)的形成、植物的生殖發(fā)育以及信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程中發(fā)揮了重要的作用。近期的研究表明，LTP蛋白具有信號(hào)肽，可以從細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外并定位于細(xì)胞壁上。LTP蛋白的細(xì)胞壁定位功能對于植物的抗病反應(yīng)、抗逆境反應(yīng)(高溫、高鹽、 干旱協(xié)迫)、以及生物膜和脂質(zhì)的形成具有重要作用。在棉花的纖維發(fā)育過程中，脂類代謝在棉纖維快速伸長中發(fā)揮了重要的作用。在棉花胚培養(yǎng)基中添加碳鏈長度在20以上的脂類化合物能夠促進(jìn)纖維的伸長發(fā)育。煙草中脂類運(yùn)輸?shù)鞍谆虻难芯勘砻?，脂類運(yùn)輸?shù)鞍拙哂惺杷杉?xì)胞壁的功能。但是到目前為止，哪種蛋白參與運(yùn)輸C20以上的脂類化合物并不清楚，利用基因工程手段提高棉花的纖維長度也沒有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因以及其片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在提高棉花脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在胚細(xì)胞中的表達(dá)水平從而促進(jìn)棉花纖維伸長方面的用途。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次采用分子克隆方法從海島棉胚特異表達(dá)的 cDNA中分離獲得了新的Itp基因，并且通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了它具有促進(jìn)纖維伸長功能，Itp基因轉(zhuǎn)入植物后可導(dǎo)致棉花纖維伸長。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明包括以下內(nèi)容1、提供了一種新的分離出的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(以下簡稱為“LTP”蛋白質(zhì))，包含具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽；(b)將 SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(較佳地1-20個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進(jìn)棉花纖維伸長功能的LTP蛋白質(zhì)活性的由(a)衍生的多肽。2、提供了編碼上述多肽的多核苷酸，選自(a)編碼上述LTP蛋白質(zhì)多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO 1中1-363位的序列；(b)具有SEQ ID NO :1中1-400位的序列。3、提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。4、提供了制備上述LTP蛋白質(zhì)多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有活性的多肽。5、提供了上述多核苷酸和LTP蛋白質(zhì)多肽的用途，即，在培育提高棉花纖維長度的棉花品種方面的應(yīng)用。6、提供了一種改變植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以提高棉花纖維品質(zhì)的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有SEQ ID NO :1所示序列的多核苷酸，所述的LTP選自下組(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進(jìn)棉花纖維伸長的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使Ipt基因編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入Ipt基因的DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。在本發(fā)明中，術(shù)語“LTP蛋白質(zhì)”、“LTP多肽”或“脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”可互換使用，都指具有LTP氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的 LTP蛋白質(zhì)。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“分離的LTP蛋白或多肽”是指LTP多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化LTP 蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主， 本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括LTP蛋白質(zhì)的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、 “衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然LTP蛋白質(zhì)相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。根據(jù)本文所述， 這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“LTP多肽”指具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。 該術(shù)語還包括具有與LTP蛋白質(zhì)相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地 1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或 N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括LTP蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)程度條件下能與Itp DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含LTP多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了 LTP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有LTP多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸， 通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供LTP蛋白質(zhì)或多肽的類似物。這些類似物與天然LTP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到。在本發(fā)明中，“LTP蛋白質(zhì)保守性變異多肽”指與SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比， 有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表 權(quán)利要求
1.一種分離的LTP蛋白質(zhì)多肽，其特征為包含具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.權(quán)利要求1所述的多肽，所述保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是 SEQ ID NO :2序列被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的，且具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗性和LTP蛋白質(zhì)活性的多肽。
3.權(quán)利要求1或2所述的多肽在提高棉花纖維長度和強(qiáng)度方面的功能與應(yīng)用。
4.一種分離的多核苷酸，其特征在于，包含(a)編碼權(quán)利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或(b)與(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
5.權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，其序列選自(a)具有SEQID NO :1中1-363位的序列；或(b)具有SEQID NO :1中1-400位的序列。
6.權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸在提高棉花纖維長度和強(qiáng)度方面的功能與應(yīng)用。
7.一種載體，其特征在于含有權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸。
8.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求7所述的載體。
9.一種具有LTP蛋白質(zhì)活性的多肽的制備方法，其特征在于包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有LTP蛋白質(zhì)活性的多肽。
10.一種改變植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗性，以提高植物纖維品質(zhì)的方法，包括(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求4或5所述的多核苷酸；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使LTP蛋白質(zhì)DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入LTP蛋白質(zhì)DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的能夠提高棉花纖維品質(zhì)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因lpt及其編碼的LTP蛋白質(zhì)多肽，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種LTP蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明還公開了lpt基因在提高棉花纖維長度和強(qiáng)度方面的功能與應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102321163SQ20111030535
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者左開井, 王勁, 陳繼軍, 韓慧超 申請人:左開井, 王勁