專利名稱：一種防治煙草青枯病的植物源殺菌劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農藥技術領域，特別涉及植物源殺菌劑領域，具體涉及一種防治煙草青枯病的植物源殺菌。
背景技術：
莧菜是莧科(Amaranthaceae)莧屬中以嫩莖葉為食的一年生草本植物，富含多種營養(yǎng)成分。莧屬全世界約有40種，我國有20余種，分布較廣，原產于中美洲和東南亞的熱帶與亞熱帶地區(qū)，中國也是莧屬植物的原產地之一。莧菜有兩大類，一類是以葉子作為蔬菜食用的蔬菜莧，另一類則主要是收獲種子的籽粒莧，起源于中美洲或南美洲。蔬菜莧的主要品種是Amaranthus tricolor，起源于南亞或東南亞，并逐漸擴展到熱帶和亞熱帶地區(qū)，這種蔬菜在中國尋常人家餐桌上很常見。目前在長江流域以南地區(qū)栽培較多，是一種營養(yǎng)型綠色蔬菜。已有的研究結果表明蔬菜莧耐旱耐瘠、抗病蟲害能力強，其營養(yǎng)十分豐富，含有氨基酸、脂肪酸及微量元素等，是一種天然的無公害綠色功能性食品。美國、英國等國家根據(jù)莧菜的特點建立了提取葉蛋白的工廠，將莧菜葉蛋白列入各種營養(yǎng)食譜；唐業(yè)昌等研究認為野莧菜每IOOg鮮物含有218kJ的熱量，其他營養(yǎng)也相當豐富。特別是莧菜籽中的蛋白質含量比常見植物種子中含量都高，只是比大豆中的含量低，所含胡蘿卜素比茄果類高2倍以上，其鐵的含量比菠菜高1倍，鈣的含量則比菠菜高3倍，可為人體提供豐富的營養(yǎng)物質，有利于強身健體，提高機體的免疫力；另外，還含有蕓香苷、槲皮素、鯊烯、短肽 (Iunasin)等。然而，莧菜不含草酸，其鈣、鐵進入人體后很容易被吸收利用，還是減肥餐桌上的主角，常食可以減肥，促進排毒，防止便秘。近年來，隨著莧菜研究的不斷深入，人們研究發(fā)現(xiàn)莧菜的氯仿提取物對溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)、大腸桿菌(E. coli)、李其Jf特菌(L. monocytogenes)、沙門菌 (Salmonella spp.)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)具有很高的抗菌能力，并且提取分離了活性物質鄰苯二甲酸二乙酯(Di-ethyl phtalate)。Rizzello等在籽粒莧的種子水提取物中提取了抗真菌的活性肽。Lina等在籽粒莧的種子中提取分離了具有抗菌活性的肽，并且該活性肽對白色念珠菌(Candida albicans)、木霉菌(Trichoderma sp.)、茄病鐮刀菌 (Fusrium solani)、產黃青霉(Penicillium chryso-genum)、蕩枝酸腐病菌(Geotrichum candidum)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、交鏈抱菌(Altemaria alterata)等具有抑菌作用。另外也有研究認為野莧菜的乙醇提取物也對以上多種病原微生物具有抗菌作用， 而且從莧菜中提取的蛋白質對黃瓜花葉病毒(CMV)具有顯著的抑制作用。然而，目前的研究僅限于采用莧菜粗提物對食品污染菌和部分致病真菌的探討，而對植物致病細菌和真菌的研究較少，本發(fā)明基于這一點，選用莧菜葉粗提物對煙草青枯病的控制效果進行了研究。煙草青枯病是植物細菌性土傳病害，是熱帶、亞熱帶和一些溫暖地區(qū)煙草的重要病害。目前在我國長江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生，其中以廣東、福建、臺灣、湖南、江西、廣西東部、安徽南部、四川、重慶及貴州局部煙區(qū)為害嚴重，個別年份常常暴發(fā)流行，造成毀滅性損失，并且該病有向北方煙區(qū)擴散的趨勢。煙草青枯病病菌是一種土壤習居菌，主要在土壤中的植株病殘體上越冬，通?？梢栽谕寥乐写婊顢?shù)年之久，并可以隨著流水、根際接觸和農事操作等多種途徑廣泛傳播。該菌系復雜，寄主廣泛，除危害煙草外，還可侵染包括番茄、 花生、馬鈴薯、香蕉等在內的近50個科300多種植物。所以，煙草青枯病的防治十分困難， 該病的防治一直是學術界的一大難題，倍受重視。目前針對該病，生產上主要是采用水旱輪作和休田期撒施石灰消毒等農業(yè)措施進行防治，但水旱輪作易受環(huán)境和栽培條件的限制，實施起來較困難；休田期撒施石灰雖可緩解病情，但易造成土壤板結?？共∮N工作也面臨很大的困難。人們嘗試篩選一些抗菌素用于青枯菌防治，如鏈霉素、四環(huán)素、青霉素、放線素酮等，但效果均不夠理想。在化學防治上， 雖然室內的毒力測定篩選出不少對青枯病菌有較好抑制作用的化學藥劑，但防治效果不穩(wěn)定，難以控制病害，迄今為止還沒有一種化學農藥可以有效地控制青枯病的發(fā)生。因此，大多數(shù)的科研者積極探索生物防治煙草青枯病。以往的研究，主要采用莧菜葉和種子粗提取物研究醫(yī)療、食品污染菌和部分污染真菌，本發(fā)明在前期研究的基礎上，研究了莧菜粗提取物對煙草青枯病的控制效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種能夠替代傳統(tǒng)化學殺菌劑、對煙草青枯病的防治效果好的植物源殺菌劑。該植物源殺菌劑可以有效防治煙草青枯病。本發(fā)明的技術方案之一一種植物源殺菌劑，主要有效成分為莧菜粗提物，其中每毫升植物源殺菌劑中含有莧菜粗提物的質量為0. 17毫克 0. 5毫克。優(yōu)選每毫升植物源殺菌劑中含有莧菜粗提物的質量為0.5毫克。所述莧菜粗提物的制備方法為將莧菜葉片清洗晾干，研碎獲得莧菜汁液，再用旋轉蒸發(fā)儀在溫度為40°c -45°c，轉速為110r/min-120r/min的條件下旋轉蒸發(fā)至膏狀，得膏狀物，即為所述莧菜粗提物。本發(fā)明的植物源殺菌劑，可以由莧菜粗提物和無菌水組成，其中每毫升植物源殺菌劑中含有莧菜粗提物的質量為為0. 17毫克 0. 5毫克，優(yōu)選每毫升植物源殺菌劑中含有莧菜粗提物的質量為0.5毫克。本發(fā)明的植物源殺菌劑在防治煙草青枯病方面的應用。本發(fā)明的技術方案之二本發(fā)明提供了莧菜粗提物在制備防治煙草青枯病植物源殺菌劑方面的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點為1、本發(fā)明的植物源殺菌劑效果好，其抑制中濃度EC5tl為0. 0415mg/mL,防病效果最好達到了 90.四％，明顯高于現(xiàn)有煙草青枯病殺菌劑的防病效果。2、莧菜粗提物仿生農藥毒性低、無公害，對環(huán)境安全，方便使用，又節(jié)約成本。3、本發(fā)明的成本低，易于大面積推廣應用，盆栽煙草青枯病防治效果在77. 00 90.之間，顯著高于現(xiàn)有煙草青枯病殺菌劑的防病效果。4、莧菜粗提物選擇性強，對人畜安全。


圖1是莧菜粗提物對煙草青枯病菌的拮抗效果圖。
具體實施例方式下面結合具體試驗和實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步說明，本發(fā)明試驗和實施例中涉及的百分比均為質量百分比。本發(fā)明所使用的莧菜粗提物可以用研缽將莧菜葉片研碎取其汁液，生產技術成熟；原料供應充足，而且是可再生資源；獲得途徑多樣，既可規(guī)?；斯しN植，也可采集野生植株。實施例1 一、實驗儀器HG-303型電熱干燥培養(yǎng)箱(南京實驗儀器廠)；RE-52A型旋轉濃縮蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌消毒器(上海申安醫(yī)療器械廠)； SW-CJ-2FD型凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；B⑶-230冰箱(Haier集團公司)； AUW-220電子天平(日本島津公司)；工農-16型人工背負式噴霧器(湖南農業(yè)大學生物安全實驗室提供)；研缽、量筒、燒杯、稱量紙、培養(yǎng)皿、直尺、打孔器、試管、移液槍、塑料盆等常用試驗用品均有湖南農業(yè)大學生物安全科學技術學院提供。二、實驗試劑本發(fā)明使用的2，3，5_氯化三苯基四氮唑(TTC由國藥集團化學試劑有限公司購買)；硫酸鏈霉素，(由華北制藥集團購買)；77%可殺得濕性粉劑(由美國國信公司購買)； 25%多菌靈可濕性粉劑(由四川國光農化有限公司購買)；3%克菌康可溶性粉劑(由廈門凱利生物制品有限公司購買)；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂等其他常用試劑(由天根生化北京有限公司購買)；試驗用的無菌水由湖南農業(yè)大學生物安全科學技術學院提供。三、菌種和煙草品種煙草青枯病菌標準菌株，由湖南農業(yè)大學植物病理學實驗室提供；煙草品種為 Κ3260四、莧菜粗提物的制備將新鮮的莧菜葉片用水沖洗完泥土后晾干，使用研缽把葉片研碎獲得新鮮的莧菜汁液，再使用旋轉蒸發(fā)儀在溫度為40°C 45°C，轉速為llOr/min 120r/min的條件旋轉蒸發(fā)至膏狀，最后將膏狀物放到三角瓶中，置于4°C冰箱備用。五、莧菜粗提物對煙草青枯病菌的拮抗活性檢測采用平皿打孔法。將煙草青枯病菌懸浮液(1 X 108Cfu/mL) 200 μ L均勻涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，然后打孔(cp=5mm)，將待測粗提物注入孔內，每孔50yLJ8°C培養(yǎng)Mh，觀察抑菌狀況及抑菌圈大小，每個處理3次重復。六、莧菜粗提物對煙草青枯病菌的室內毒力測定根據(jù)前期進行預備試驗結果，將莧菜粗提物用無菌水分別配成濃度為0. 5、0. 25、 0. 17,0. 125,0. lmg/mL的標準溶液各1L，置于冰箱中備用。煙草青枯病菌菌液制備參照方中達的方法，先將煙草青枯病菌(細菌)在牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，緩慢加入無菌水輕微振蕩將細菌洗于無菌水中配成細菌懸浮液，采用TTC培養(yǎng)基平板計數(shù)法配制濃度為1 X IO8細菌懸浮液。七、煙草青枯病菌的室內抑菌測定在含有IXlO8細菌懸浮液的試管中，分別加入莧菜粗提物濃度為0. 5,0. 25,0. 17、 0. 125,0. lmg/mL，硫酸鏈霉素濃度為 0. 8、0. 4、0. 2、0. 1,0. 05mg/mL，可殺得濃度為 10、5、 2. 5,1. 25,0. 625mg/mL,多菌靈濃度為 2、1、0. 5,0. 25,0. 125mg/mL,克菌康濃度為 4、2、1、 0. 5,0. 25mg/mL，并以清水為對照，于室溫下靜置0. 5h，然后取0. ImL含藥劑的細菌懸浮液于TTC牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上涂布，置于暗培養(yǎng)48h，計算活菌數(shù)，每處理3次重復。然后，通過菌落生長抑制概率值和提取物濃度對數(shù)值之間的線性回歸分析(y = a+bX)，求出莧菜提取物對供試煙草青枯菌的有效抑制中濃度EC5tl (mg/mL)。實施例2:莧菜粗提物對煙草青枯病的盆栽實驗盆栽實驗選擇在湖南農業(yè)大學植物醫(yī)院溫室大棚內進行，先將培育好的煙草幼苗移栽到塑料盆內，移栽IOd后采用莖部穿刺接種煙草青枯病菌，保持大棚內溫度白天四 32°C，晚上21 M°C，濕度為90%，以使不同盆內的煙草均勻發(fā)病。盆栽實驗共分為6個處理即0. 5,0. 25,0. 17,0. 125,0. lmg/mL莧菜粗提物和0. 82mg/mL硫酸鏈霉素處理，并以清水為空白對照，每處理需要煙苗100棵，每處理重復3次，在病害始發(fā)期施藥，每隔IOd施 1次藥，共施藥3次，每次試驗用工農-16型人工背負式噴霧器施藥，以噴濕葉片正反面藥液剛不下滴為度，用藥液量^g/百株。取樣和調查在處理區(qū)和對照區(qū)調查煙草青枯病的發(fā)病情況。調查對作物的其他影響；觀察是否有藥害產生，有藥害則記錄藥害程度；樣品則采用五點取樣法，選擇有代表性的煙株100 株作為定點株，分別在是要后7d進行調查。按病情分級標準，記錄發(fā)病情況，計算各處理病株率、病情指數(shù)及防治效果。取樣法、分級標準和病情指數(shù)按全國煙草行業(yè)煙草病害調查分級標準GB/T23222-2008進行，防治效果按煙草病害藥效試驗方法Yc/40_1996進行。各級別分級標準及結果計算方法如下0級全株無病。1級莖部偶有褪綠斑，或病側二分之一以下葉片凋萎。3級莖部有黑色條斑，但不超過莖高二分之一，或病側二分之一至三分之二葉片凋萎。5級莖部黑色條斑超過莖高二分之一，但未到達頂部，或病側三分之二以上葉片凋萎。7級莖部黑色條斑到達莖頂部，或病株葉片全部凋萎。9級病株基本枯死。藥效計算方法
調查總株數(shù)χ最高級別數(shù)值xl()()
權利要求
1.一種植物源殺菌劑，其特征是，主要有效成分為莧菜粗提物，其中每毫升植物源殺菌劑中含有莧菜粗提物的質量為0. 17毫克 0. 5毫克。
2.根據(jù)權利要求1所述的植物源殺菌劑，其特征是，所述莧菜粗提物的制備方法為 將莧菜葉片清洗晾干，研碎獲得莧菜汁液，再用旋轉蒸發(fā)儀在溫度為40°C _45°C，轉速為 110r/min-120r/min的條件下旋轉蒸發(fā)至膏狀，得膏狀物，即為所述莧菜粗提物。
3.根據(jù)權利要求1所述的植物源殺菌劑，其特征是，由莧菜粗提物和無菌水組成，其中每毫升植物源殺菌劑中含有莧菜粗提物的質量為0. 5毫克。
4.權利要求1-3之一所述植物源殺菌劑在防治煙草青枯病方面的應用。
5.莧菜粗提物在制備防治煙草青枯病植物源殺菌劑方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農藥技術領域，特別涉及植物源殺菌劑領域，具體提供了一種防治煙草青枯病的植物源殺菌劑，主要有效成分為莧菜粗提物和無菌水，其中每毫升植物源殺菌劑中含有莧菜粗提物的質量在0.17～0.5毫克之間。本發(fā)明具有的優(yōu)點和較好效果為1.莧菜菜葉粗提物取材方便，既可工廠化生產，又可由農民直接應用；2.效果顯著，其抑制中濃度EC50為0.0415mg/mL，盆栽煙草青枯病防治效果在77.00％-90.29％之間，明顯高于硫酸鏈霉素等其它現(xiàn)有煙草青枯病殺菌劑的效果；3.莧菜粗提物高效、低毒、無公害，對環(huán)境安全。
文檔編號A01N65/08GK102388925SQ20111031799
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月19日 優(yōu)先權日2011年10月19日
發(fā)明者劉雙清, 廖曉蘭, 張亞, 蘇品, 黃璜 申請人:湖南農業(yè)大學