專利名稱：一種兼抗煙草黑脛病和青枯病的生防菌株Trb3的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種兼抗煙草黑脛病和青枯病的生防菌株Trb3，用于煙草土傳病害的無(wú)公害防治。
背景技術(shù)：
煙草黑脛病和青枯病是煙草上最具毀滅性的兩種病害之一。煙草黑脛病又稱煙草疫病，煙農(nóng)稱為“黑桿瘋”、“黑根”、“烏頭病”，是由Phytophthora parasitica var nicotianae引起的，中國(guó)各主要產(chǎn)煙區(qū)均有不同程度發(fā)生，發(fā)病較重的區(qū)域一般發(fā)病率達(dá)5% 15%，重者達(dá)30%以上，給煙草生產(chǎn)造成很大損失。
煙草青枯病是由布可氏桿菌(Ralstonia solanacearum)弓丨起的一種煙草土傳病害，在我國(guó)南方煙區(qū)發(fā)病普遍，其中廣東、廣西、福建、四川、浙江、湖南和貴州較重，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可使全田煙草枯死。煙草黑脛病和青枯病田間發(fā)病條件和發(fā)病時(shí)期接近，云南、貴州、四川、湖南、廣東、廣西、福建等南方煙區(qū)發(fā)生亦相當(dāng)普遍，并多與煙草青枯病混合發(fā)生，故危害更為嚴(yán)重。近年來(lái)，隨著煙草種植年限延長(zhǎng)，全國(guó)各煙區(qū)發(fā)病情況日趨嚴(yán)重。由于生產(chǎn)上栽培煙草品種對(duì)這兩種病害抗性較差或綜合抗性不足，目前仍依賴化學(xué)防治。防治煙草黑脛病主要農(nóng)藥品種為甲霜靈和霜霉威，防治煙草青枯病主用藥劑為農(nóng)用硫酸鏈霉素。藥劑品種較為單一，且均已有十幾年甚至幾十年的使用歷史，導(dǎo)致防治效果下降，防治成本增加，環(huán)境污染加劇。此外，煙草屬于吸食性產(chǎn)品，隨著人們對(duì)環(huán)境與健康的日益重視，減少農(nóng)藥使用，促進(jìn)安全優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)，對(duì)改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。生物防治對(duì)環(huán)境友好，在某些情況下防治效果優(yōu)于化學(xué)藥劑，特別是在病害發(fā)病高峰期常伴隨高溫多雨，化學(xué)藥劑難以發(fā)揮作用。因此，生防菌劑的開發(fā)成為近期研究的熱點(diǎn)，無(wú)致病力菌株、芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌等生防因子研究應(yīng)用較多。但現(xiàn)有研究?jī)H局限于單一防治對(duì)象篩選生防菌株，而煙草黑脛病和青枯病在多數(shù)煙區(qū)為混合發(fā)生，導(dǎo)致防病效果不佳。因此，篩選能夠兼具抗煙草黑脛病、青枯病生防特性的菌株，對(duì)提高病害的防治效果、降低防治成本具有重要意義。由于當(dāng)前煙草黑脛病和青枯病的生物防治技術(shù)均針對(duì)單一作用靶標(biāo)，缺乏能同時(shí)對(duì)煙草黑脛病和青枯病有良好生防效果的菌劑，由于煙草黑脛病和青枯病在山東以及南方煙區(qū)多為混合發(fā)生，從而導(dǎo)致防治效果不佳、防治成本增高。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述技術(shù)問題，本發(fā)明篩選出對(duì)煙草黑脛病和青枯病均具有良好生防效果的優(yōu)良菌株，實(shí)現(xiàn)一菌兩治，達(dá)到提高防效、降低成本的良好效果。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種兼抗煙草黑脛病和青枯病的生防菌株Trb3，為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，于2012年3月7日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 5855。所述的生防菌株Trb3用于制備生防菌劑的方法如下將所述的生防菌株Trb3在LB培養(yǎng)液28 V 180rpm振蕩培養(yǎng)36-40小時(shí)，然后6000rpm離心10分鐘，用滅菌水配成進(jìn)行稀釋配制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為IXlO9 lX1010cfu/ml。所述LB培養(yǎng)液配方是酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉10g、蒸懼水1000ml,并調(diào)節(jié)pH值為7.0。所述的生防菌劑在防治煙草黑脛病和青枯病的應(yīng)用方法如下 在煙草移栽時(shí)蘸根20分鐘，或稀釋100倍后在移栽時(shí)灌根使用，每株灌40ml稀釋液；移栽后在發(fā)病前或出現(xiàn)零星病株時(shí)，用該生防菌劑100倍液灌根，每株灌40ml稀釋液，連續(xù)使用2-3次，每次間隔7-10天。與現(xiàn)有煙草黑脛病和青枯病防治技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明是專門針對(duì)煙草黑脛病和青枯病開發(fā)的生防制劑，由于是生物制劑，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來(lái)的一系列問題，有利于煙草的無(wú)公害生產(chǎn)；生產(chǎn)中煙草黑脛病和青枯病普遍混合發(fā)生，本發(fā)明對(duì)兩種病害兼防兼治，效果良好，一藥兩治還可以為農(nóng)民節(jié)省防治成本；本發(fā)明菌株分離自煙草根際，占有良好的生態(tài)位，有利于充分發(fā)揮菌株優(yōu)勢(shì)。所述生防菌劑在煙草移栽前蘸根，也可以在移栽時(shí)灌根使用。移栽后，在煙草黑脛病和青枯病即將進(jìn)入發(fā)病期時(shí)灌根使用，連續(xù)使用2-3次，每次間隔7-10天。使用后，菌株通過抑制病原菌、促進(jìn)煙株生長(zhǎng)等多種生防機(jī)制起作用，從而達(dá)到防病的效果。試驗(yàn)表明，在溫室中所述生防菌劑對(duì)煙草黑脛病和青枯病均有防治效果，對(duì)煙草黑脛病防治效果達(dá)72. 3%，對(duì)煙草青枯病防治效果為65. 7%。田間施用Trb3菌株制劑對(duì)煙草黑脛病、青枯病混發(fā)煙田防治效果為61. 04%。


圖I是生防菌株Trb3的系統(tǒng)發(fā)育分析；圖2是生防菌株Trb3對(duì)煙草黑脛病菌的抑制效果；圖3是生防菌株Trb3對(duì)煙草青枯病菌的抑制效果。
具體實(shí)施例方式一、菌種鑒定一種兼抗煙草黑脛病和青枯病的生防菌株Trb3，為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis), Trb菌株菌體桿狀，染色均勻，革蘭氏染色陽(yáng)性，鞭毛周生，產(chǎn)芽孢，在PDA平板培養(yǎng)基上菌落圓形，不透明，有皺紋，乳脂色；在平板培養(yǎng)基表面擴(kuò)展很快，肉湯培養(yǎng)液中形成菌膜。根據(jù)形態(tài)特征和生理生化特征，見表1，初步認(rèn)為生防菌株Trb3屬于枯草芽孢桿菌。通過對(duì)生防菌株Trb3的16S rDNA序列分析,獲得了 1455bp的序列，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行Blastn搜索，其中同源性最高的是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，選擇與生防菌株Trb3同源性高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果如圖I所示，Trb3菌株與枯草芽孢桿菌同源性較高。依據(jù)此結(jié)果，再根據(jù)菌體形態(tài)和生理生化特征(如表I所示)可以將生防菌株Trb3歸入芽孢桿菌屬，與枯草芽孢桿菌形成一個(gè)類群。表I生防菌株Trb3主要形態(tài)和生理生化特征
I落圓形水解淀粉反應(yīng)「
形狀__桿狀降解酪氨酸反應(yīng) -
革蘭氏染色 +__葡萄糖產(chǎn)酸__+
孢子染色+木糖產(chǎn)酸__+
41°C生長(zhǎng)+__阿拉伯糖產(chǎn)酸+
4。。生長(zhǎng)____甘露醇產(chǎn)酸__+
好氧和厭氧 +卵磷脂利用__—
接觸酶__+__梓檬酸鹽利用__+
_運(yùn)動(dòng)性_ +吲哚的產(chǎn)生-
V-P實(shí)驗(yàn)+耐鹽性5% NaCl + ~注“ + ”表示陽(yáng)性反應(yīng)表示陰性反應(yīng)二、生防菌株Trb3煙草黑脛病菌、煙草青枯病菌的抑菌效果I)生防菌株Trb3對(duì)煙草黑脛病菌的抑菌效果本發(fā)明中，LB培養(yǎng)液的配方是酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉10g、蒸懼水1000ml,并調(diào)節(jié)pH值為7.0。生防菌株Trb3在LB培養(yǎng)液28°C 180rpm振蕩培養(yǎng)36-40小時(shí)，然后6000rpm離心10分鐘，備用。在無(wú)菌條件下將融化的適量固體燕麥培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)，凝固后，在平板中央接入直徑5_黑脛病菌菌絲塊，然后用直徑5. Omm無(wú)菌濾紙片蘸發(fā)酵液，將在培養(yǎng)皿邊緣等距離接種3塊蘸菌液濾紙片，以蘸無(wú)菌水濾紙片作對(duì)照。28°C培養(yǎng)3天后，檢查結(jié)果見圖2所示，Trb3對(duì)煙草黑脛病菌周圍形成較大的抑菌圈，黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)稀疏，表明生防菌株Trb3對(duì)煙草黑脛病有較強(qiáng)的抑制效果，抑菌帶寬達(dá)I. 87cm，菌絲生長(zhǎng)稀疏。2)生防菌株Trb3對(duì)煙草青枯病菌的抑菌效果生防菌株Trb3在LB培養(yǎng)液28°C 180rpm振蕩培養(yǎng)36-40小時(shí)，然后6000rpm離心10分鐘，備用。在無(wú)菌條件下將融化的適量固體PDA培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)，在其上均勻涂布青枯病菌(3X106cfU/ml)100ia。然后在平板中央接入蘸Trb菌株發(fā)酵液的無(wú)菌濾紙片，置將28°C培養(yǎng)24小時(shí)。結(jié)果如圖3所示，生防菌株Trb3對(duì)青枯病菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，抑菌圈直徑達(dá)2. 13cm。三、生防菌劑Trb3制備生防菌株Trb3用于制備生防菌劑Trb3的方法如下將所述生防菌株Trb3在LB培養(yǎng)液28 V 180rpm振蕩培養(yǎng)36-40小時(shí)，然后6000rpm離心10分鐘，用滅菌水配成進(jìn)行稀釋配制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為IXlO9 lX1010cfu/ml。四、生防菌劑Trb3對(duì)煙草黑脛病和青枯病的防效I)溫室盆栽試驗(yàn)檢測(cè)生防菌劑Trb3對(duì)煙草黑脛病和青枯病的防效選擇大小一致、四葉一心的煙苗進(jìn)行試驗(yàn)，共設(shè)七個(gè)處理(I)移栽時(shí)采用20ml107cfu/ml菌劑對(duì)煙苗灌根，移栽后I天接種107cfu/ml青枯菌Ralstonia solanacearum菌懸液20ml ； (2)不用菌劑Trb3處理，移栽后7天直接接種107cfu/ml青枯菌Ralstoniasolanacearum菌懸液20ml ； (3)移栽時(shí)采用20mll07cfu/ml菌劑對(duì)煙苗灌根,移栽后7天接種黑脛病菌菌谷3g ； (4)不用菌劑Trb3處理，移栽后7天接種黑脛病菌菌谷3g ； (5)移栽時(shí)采用20ml 107cfu/ml菌劑對(duì)煙苗灌根,移栽后7天分別接種107cfu/ml青枯菌Ralstoniasolanacearum菌懸液20ml和黑脛病菌菌谷3g ； (6)不用菌劑Trb3處理，移栽后7天分別接種107cfu/ml青枯菌Ralstonia solanacearum菌懸液20ml和黑胚病菌菌谷3g ； (7)不用菌劑Trb3處理，移栽后7天取20ml無(wú)菌水灌根。每個(gè)處理10株，三次重復(fù)，在溫度30°C，光照為每天12小時(shí)，相對(duì)濕度85%條件下，15天后調(diào)查發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防效。結(jié)果如表2所示，生防菌劑Trb3對(duì)煙草青枯病防效為67. 32% 79. 74%,平均防效為74. 63 ;對(duì)煙草黑脛病的防效為79. 21% 87. 49%，平均防效為83. 74 ;對(duì)煙草黑脛病和青枯病混合接種防效為61. 99 70. 38%，平均為67. 02%。
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表2生防菌劑Trb3對(duì)煙草青枯病和黑脛病的溫室防治效果測(cè)定
權(quán)利要求
1.一種兼抗煙草黑脛病和青枯病的生防菌株Trb3，為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，于2012年3月7日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 5855。
2.權(quán)利要求I所述的生防菌株Trb3制備的生防菌劑。
3.權(quán)利要求2所述的生防菌劑在抗煙草黑脛病和青枯病的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述的生防菌株Trb3用于制備所述的生防菌劑的方法是，將所述的生防菌株Trb3在LB培養(yǎng)液28°C 180rpm振蕩培養(yǎng)36-40小時(shí)，然后6000rpm離心10分鐘，用滅菌水配成進(jìn)行稀釋配制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為IX IO9 IX 101(lCfu/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的生防菌株Trb3用于制備所述的生防菌劑的方法，其特征在于，所述LB培養(yǎng)液配方是酵母膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉10g、蒸餾水1000ml，并調(diào)節(jié)pH值為7.0。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種兼抗煙草黑脛病和青枯病的生防菌株Trb3，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，所述菌株Trb3制備菌劑的方法是，將所述菌株Trb3在LB培養(yǎng)液28℃180rpm振蕩培養(yǎng)36-40小時(shí)，然后6000rpm離心10分鐘，用滅菌水配成進(jìn)行稀釋配制成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1×109～1×1010u/ml。Trb3菌株菌劑在煙草移栽前蘸根或移栽時(shí)灌根使用，移栽后在煙草黑脛病和青枯病即將進(jìn)入發(fā)病期時(shí)灌根使用。溫室中Trb3菌株菌劑對(duì)煙草黑脛病防治效果達(dá)72.3％，對(duì)煙草青枯病防治效果為65.7％，田間施用菌株Trb3菌劑對(duì)煙草黑脛病、青枯病混發(fā)煙田防治效果為61.04％。
文檔編號(hào)C12R1/125GK102747013SQ20121015908
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月22日
發(fā)明者馮超, 孔凡玉, 張成省, 徐茜, 林勇, 王靜, 羅定棋, 陳志厚 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所, 四川省煙草公司瀘州市公司, 福建省煙草公司南平市公司