專利名稱：大豆食心蟲核糖體蛋白基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種大豆食心蟲核糖體蛋白基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆食心蟲(Leguminivora glycinivorella(Mats. Obraztsov))是我國(guó)東北大豆產(chǎn)區(qū)發(fā)生最嚴(yán)重的一種蟲害，主要是幼蟲蛀入豆莢危害豆粒。一般年份蟲食率10% 20 %，重害年份30% 40 %，個(gè)別年份超過(guò)50 %以上。造成被害豆粒不完整或破粒，降低大豆產(chǎn)量和品質(zhì)。黑龍江是我國(guó)大豆之鄉(xiāng)，大豆種植面積占全國(guó)的33. 2 %，占東北的64%， 總產(chǎn)量占全國(guó)的37. 3%，在我國(guó)大豆生產(chǎn)中起著舉足輕重的作用。但近年來(lái)由于氣候變化和“豆麥產(chǎn)區(qū)”小麥種植面積逐年減少，重迎茬大豆種植比例逐漸增力卩，致使大豆食心蟲發(fā)生加重。據(jù)黑龍江省植保站統(tǒng)計(jì)2009年黑龍江省大豆食心蟲的發(fā)生面積為1720. 5萬(wàn)畝； 2010年大豆食心蟲的發(fā)生面積為1383. 7萬(wàn)畝。黑龍省每年大豆種植面積都在6000萬(wàn)畝左右，接近1/3大豆田遭受不同程度的害蟲侵害，不僅使大豆田嚴(yán)重減產(chǎn)，而且降低大豆商品質(zhì)量使大豆優(yōu)質(zhì)率只有50% -60%，嚴(yán)重影響其在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力。為了減少害蟲對(duì)大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的危害，以黑龍江為例，豆農(nóng)每年至少使用2次化學(xué)殺蟲劑對(duì)大豆食心蟲和草地螟進(jìn)行防治?，F(xiàn)在使用的化學(xué)殺蟲劑都是廣譜性殺蟲劑，不僅殺死目標(biāo)昆蟲，而且殺死有益昆蟲，同時(shí)化學(xué)殺蟲劑在自然界可以長(zhǎng)期存在，在土壤和河流中逐漸積累，破壞土壤和河流的生態(tài)環(huán)境；化學(xué)殺蟲劑還可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，誘發(fā)致畸、致癌、嚴(yán)重?fù)p害人體健康。因此各種不必利用化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治大豆害蟲的方法日益受到重視。轉(zhuǎn)蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)抗蟲基因雖為害蟲防治一度帶來(lái)了希望，并在抗蟲棉的應(yīng)用上獲得了舉世矚目的成果。培育抗大豆食心蟲的大豆品種的傳統(tǒng)育種方法雖然有效，但周期長(zhǎng)，效率低。所以，現(xiàn)在需要建立一種防治大豆食心蟲的新方法，能夠更精確、更高效的控制大大豆食心蟲，加快我國(guó)抗大豆食心蟲育種研究速度。RNA干擾是利用外源導(dǎo)入或轉(zhuǎn)錄載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的雙鏈RNA介導(dǎo)受體細(xì)胞中的序列特異的同源性mRNA發(fā)生降解或翻譯受阻，引發(fā)受體細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后基因沉默，使與此相應(yīng)的內(nèi)源靶基因的表達(dá)被阻抑，從而得到類似于“基因敲除”的基因阻抑效果。顯微注射法是RNAi研究中最廣泛使用的dsRNA導(dǎo)入方法，該方法在蟋蟀G. bimaculatus、擬谷盜 Tribolium castaneum、家香Bombyx mori、舌甘菜液蛾S. exigua、褐飛風(fēng)Nilaparvata Iugens 等昆蟲中均取得成功。但顯微注射法dsRNA方法只能用于研究昆蟲基因功能，不能采用該方法在田間對(duì)害蟲進(jìn)行防控。如果利用植物表達(dá)與昆蟲生長(zhǎng)關(guān)鍵基因匹配的dsRNA分子， 當(dāng)昆蟲取食這類植物后，將這些dsRNA攝入體內(nèi)，在昆蟲體內(nèi)發(fā)生RNA干擾現(xiàn)象，使關(guān)鍵基因的表達(dá)被明顯抑制，從而達(dá)到控制害蟲的目的。這就是利用RNA干擾技術(shù)防治害蟲的基本過(guò)程。RNA干擾利用的是基因片段，在轉(zhuǎn)錄后誘導(dǎo)相應(yīng)靶基因沉默，與常規(guī)轉(zhuǎn)抗蟲基因相比，RNA干擾介導(dǎo)的昆蟲基因沉默不產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)，具有更高的生物安全性。由于該方法具有高效、特異、安全等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種非常具有前途的控制害蟲的新方法，能夠更好的防治那些以農(nóng)作物為食、影響農(nóng)作物產(chǎn)量的害蟲，是農(nóng)作物害蟲防御領(lǐng)域的突破。而且， 目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)利用RNA干擾防治大豆食心蟲的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種編碼大豆食心蟲核糖體蛋白的基因，其堿基序列如 SEQ ID NO 1 所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種含有大豆食心蟲核糖體蛋白基因的載體。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供大豆食心蟲核糖體蛋白基因在提高大豆抗食心蟲能力中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種提高大豆抗食心蟲能力的方法，將大豆食心蟲核糖體蛋白基因?qū)氪蠖菇M織或細(xì)胞，得到食心蟲抗性提高的大豆，所述大豆食心蟲核糖體蛋白基因的核苷酸序列如如SEQ IDNO 1所示。所述大豆食心蟲核糖體蛋白基因通過(guò)含有所述大豆食心蟲核糖體蛋白基因的載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞。本發(fā)明的技術(shù)路線為1)利用分子生物學(xué)方法克隆大豆食心蟲核糖體蛋白基因，命名為大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因；2)體外合成PO基因的dsRNA，利用顯微注射技術(shù)將PO基因dsRNA導(dǎo)入到一齡末大豆食心蟲幼蟲體內(nèi)，結(jié)果證明P0基因是大豆食心蟲核糖體重要組成部分，在蛋白質(zhì)的合成中起著重要作用，PO基因mRNA被降解后，大豆幼蟲由于不能合成生長(zhǎng)發(fā)育所需的蛋白質(zhì)而大量死亡。本發(fā)明克隆了一種大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因，體外合成PO基因的dsRNA，利用顯微注射技術(shù)將PO基因dsRNA導(dǎo)入到一齡末大豆食心蟲幼蟲體內(nèi)，結(jié)果證明P0基因是大豆食心蟲核糖體重要組成部分，在蛋白質(zhì)的合成中起著重要作用，PO基因mRNA被降解后，大豆幼蟲由于不能合成生長(zhǎng)發(fā)育所需的蛋白質(zhì)而大量死亡。該基因可以作為靶基因用于構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，用于培育高抗大豆食心蟲大豆種質(zhì)。


圖1大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，M :DL15000DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 引物1和引物2的PCR產(chǎn)物；圖2大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，M :DL15000DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 引物3和引物4PCR產(chǎn)物；圖3大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因3’ race的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，M DL15000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 引物GPSl和引物GPS2PCR產(chǎn)物；圖4大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因全長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，M DL15000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :PCR產(chǎn)物；圖5大豆食心蟲核糖體蛋白PO在大豆食心蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)模式；圖6大豆食心蟲核糖體蛋白PO在大豆食心蟲不同組織的表達(dá)模式；圖718srDNA和PO基因目的片段體外合成的dsRNA電泳檢測(cè)結(jié)果圖，a)M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-3 :18srDNA 的 dsRNA ；4-6 :P0 基因的 dsRNA ；圖8注射不同濃度POdsRNA對(duì)大豆食心蟲幼蟲死亡率的影響；圖9注射不同濃度dsRNA對(duì)大豆食心蟲幼蟲POmRNA表達(dá)水平的影響；圖10注射POdsRNA對(duì)大豆食心蟲幼蟲死亡率的影響；圖11注射dsRNA對(duì)大豆食心蟲幼PO基因mRNA表達(dá)水平的影響；圖12注射POdsRNA對(duì)大豆食心蟲幼蟲體重的影響；圖13注射POdsRNA對(duì)大豆食心蟲幼蟲發(fā)育的影響；圖14RNAi植物表達(dá)載體pJawohl8_P0RNAi的構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)路線做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因克隆及序列分析利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的7個(gè)昆蟲的大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行保守性分析，設(shè)計(jì)2條引物引物 1 5-GATGGG (T) TAGGGAGG (A) ACAA-3 ；
引物 2 5-GNACATCGTTGATGATTTC-3利用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為:95°C 5min，95°C lmin，57. 1°C lmin， 72°C 2min，30循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物約為479bp，電泳結(jié)果如圖1所示。將PCR產(chǎn)物回收并進(jìn)行測(cè)序。利用NCBI的Blast相似搜索分析表明，該序列與Bombyx mori等鱗翅目昆蟲的核糖體蛋白PO基因同源性為80%左右， 表明該序列是大豆食心蟲核糖體蛋白基因片段，而且該序列包括基因的起始密碼子ATG，為大豆食心蟲核糖體蛋白基因片斷1。根據(jù)測(cè)序結(jié)果和7個(gè)昆蟲的大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因3’端另一個(gè)保守區(qū)設(shè)計(jì)2條引物引物 3 5-GGGTACTATTGAAATCATCAACGAT-3 ；引物 4 5-TARTCRAAVAGACCRAAGCCCAT-3。利用引物3 和引物 4 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，95°C 5min，95°C lmin,48°C lmin，72°C 2min, 30循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物約為45!3bp， 電泳結(jié)果如圖2所示。將PCR產(chǎn)物回收并進(jìn)行測(cè)序，為大豆食心蟲核糖體蛋白基因片斷2。根據(jù)測(cè)序結(jié)果和Takara公司3’ race試劑盒說(shuō)明書，設(shè)計(jì)GPSl和GPS2條引物GPSl 5-CTTGTTGGCTATTGCTG-3GPS2 5-AGAAGAAGGTCGAGGAG-3根據(jù)3’ race試劑盒說(shuō)明書利用GPSl和GPS2克隆核糖體蛋白質(zhì)PO基因的3’端序列，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物約為261bp，電泳結(jié)果如圖3所示。將 PCR產(chǎn)物回收并進(jìn)行測(cè)序，為大豆食心蟲核糖體蛋白基因片斷3。將上述大豆食心蟲核糖體蛋白基因片斷1、片斷2和片斷3，3段序列利用DNAman 軟件拼接成全長(zhǎng)的大豆食心蟲核糖體基因序列，利用拼接序列結(jié)果設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因全長(zhǎng)，瓊脂糖凝膠電泳如圖4所示，將PCR產(chǎn)物回收并進(jìn)行測(cè)序，大豆食心蟲核糖體基因全長(zhǎng) PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與3段序列拼接序列結(jié)果完全一致，全長(zhǎng)1084bp，其堿基序列如SEQ IDNO 1所示，命名為大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因。利用ORF Finder軟件預(yù)測(cè)的開放閱讀框位置為2bp到95^p，3 ‘ UTR區(qū)含有推測(cè)的加尾信號(hào)AATAAA及Ploy A尾巴。大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因開放閱讀框長(zhǎng)度為 954bp，編碼317個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)的分子量為34kDa，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 所示。大豆食心蟲核糖體蛋白質(zhì)序列包括3個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域第一功能結(jié)構(gòu)是位于氨基酸44-47的rRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；第二功能結(jié)構(gòu)域是位于氨基酸182498的與核糖體蛋白質(zhì) Pl和P2互作的結(jié)構(gòu)域；第三個(gè)高度保守的功能結(jié)構(gòu)域位于四0-317的延伸因子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例2大豆食心蟲核糖體蛋白PO基因的表達(dá)模式分析為了確定大豆食心蟲PO基因在大豆食心蟲不同發(fā)育時(shí)期和大豆食心蟲幼蟲不同組織的表達(dá)情況，從7月末8月初大豆田間出現(xiàn)大豆食心蟲成蟲開始，收集卵、幼蟲、蛹、成蟲四個(gè)時(shí)期的大豆食心蟲樣品，收集的蟲樣分別放入無(wú)toase的EP管后立即在液氮中冷凍，放入_80°C的低溫冰箱中保存。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。選取大豆食心蟲3-4齡幼蟲進(jìn)行解剖，剖取的神經(jīng)節(jié)、表皮、唾腺、中腸、卵巢、睪丸和脂肪體7個(gè)組織分別放入無(wú)toase的EP 管后立即在液氮中冷凍，放入-80°C的低溫冰箱中保存。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。利用Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)提取大豆卵、幼蟲、蛹、成蟲四個(gè)時(shí)期和神經(jīng)節(jié)、表皮、 唾腺、中腸、卵巢、睪丸和脂肪體7個(gè)組織的總RNA，利用采用!^rmentas公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈.以cDNA為模板，利用RT-PCR和熒光定量PCR對(duì)結(jié)果表明POmRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。熒光定量PCR按照Τ0Υ0Β0公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-的程序進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)中所使用的基因及其引物如下actin-s 5' GGC GACATAGCACAGCTTCTC 3'actin-a 5' ATCCTCCGTCTGGACTTGGC3‘PO-s 5' CAGCAAATCCGTATGTCCCT3‘ΡΟ-a 5' CTTGATATGCGGCAACAGC 3'RT-PCR和熒光定量PCR結(jié)果表明pOmRNA在各發(fā)育階段均表達(dá)，包括卵、幼蟲、蛹、 成蟲四個(gè)時(shí)期(圖5)；成蟲期pOmRNA的表達(dá)量最高，幼蟲的期pOmRNA表達(dá)量較高，卵中表達(dá)量最低。同時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)POmRNA在這7個(gè)組織中均有表達(dá)，其中中腸的表達(dá)量最高，神經(jīng)節(jié)、脂肪體POmRNA表達(dá)量較高，其他4個(gè)組織相對(duì)表達(dá)量較低(圖6)。實(shí)施例3不同濃度POdsRNA對(duì)大豆食心蟲幼蟲死亡率的影響體外合成PO基因的dsRNA利用DNAman軟件對(duì)大豆食心蟲和其他鱗翅目昆蟲的PO基因進(jìn)行分析，選擇大大豆食心蟲PO基因的保守區(qū)域，根據(jù)T7RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒(Promega， USA)設(shè)計(jì)如下引物PoT7sense5-GGATCC-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GCACCAGCCATTCTTGACA-3Po antisense-5-CCTCGACCTTCTTCTCCT-3Po sense5-CACCAGCCATTCTTGACA-3Po T7antisense-5-GGATCC-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GCCTCGACCTTCTTCTCCT體外合成長(zhǎng)度為349bp的POdsRNA，利用1. 5%的瓊脂糖檢測(cè)dsRNA片段的大小。 結(jié)果顯示，合成的dsRNA與預(yù)期的結(jié)果一致，如圖7所示。
不同濃度POdsRNA對(duì)大豆食心蟲幼蟲死亡率的影響國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果表明只有合適濃度的dsRNA才可以引起RNAi效果，因此本發(fā)明設(shè)計(jì)了 5 μ g/ μ L(高濃度)，2. 5 μ g/ μ L(中濃度)，0. 5 μ g/ μ L(低濃度)的dsRNA進(jìn)行試驗(yàn)，以期找到一個(gè)合適的抑制靶基因表達(dá)的濃度。禾_顯微注射技術(shù)將相同體積的靶基因3 種濃度dsRNA和生理鹽水分別導(dǎo)入到100條一齡末大豆食心蟲幼蟲體內(nèi)，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。 注射后的幼蟲放入溫度^TC,濕度80%，光照18h的人工氣候箱內(nèi)利用天然飼料豆莢進(jìn)行飼養(yǎng)，7 后統(tǒng)計(jì)不同濃度的大豆食心蟲幼蟲的死亡率，提取注射相應(yīng)處理組的總RNA，利用熒光定量PCR對(duì)靶基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明dsRNA為μ L時(shí)大豆食心蟲的死亡率明顯高于生理鹽水和其他濃度(圖8)。利用熒光定量PCR檢測(cè)注射5 μ g/μ L，2. 5g/μ L，0.5 μ g/μ L三種濃度的 POdsRNA和生理鹽水7 幼蟲的POmRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明注射5 μ g/ μ LdsRNA 72h時(shí)幼蟲體內(nèi)的PO基因的基本被沉默，而且基因表達(dá)抑制水平顯著高于注射2. 5 μ g/ μ L和 0. 5 μ g/ μ L (圖9)，因此表明采用濃度5 μ g/ μ L POdsRNA進(jìn)行注射，PO基因沉默效果最好， 對(duì)大豆食心蟲影響最大。將濃度為5 μ g/μ L的大豆食心蟲pOdsRNA導(dǎo)入大豆食心蟲幼蟲1 后，幼蟲的死亡率就達(dá)到了 63. 6%極顯著高于對(duì)照生理鹽水8%的死亡率(圖10)。利用熒光定量PCR 檢測(cè)PO基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射大豆食心蟲pOdsRNA 12h后，pOdsRNA 誘導(dǎo)的大豆食心蟲幼蟲內(nèi)源的PO基因mRNA降解，基本抑制96%的大豆食心蟲幼蟲內(nèi)源的 PO基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平(圖11)。核糖體蛋白PO基因是大豆食心蟲核糖體重要組成部分，在蛋白質(zhì)的合成中起著重要作用，PO基因mRNA被降解后，大豆幼蟲由于不能合成生長(zhǎng)發(fā)育所需的蛋白質(zhì)而大量死亡。到第IOd時(shí)注射POdsRNA的大豆食心蟲幼蟲的死亡率達(dá)到了 96. 8%，而對(duì)照生理鹽水僅為31. 3%，進(jìn)一步表明PO基因沉默后對(duì)大豆食心蟲有致死作用。同時(shí)注射POdsRNA的大豆食心蟲幼蟲體重也顯著降低低于對(duì)照(圖12)，而且注射生理鹽水的大豆食心蟲幼蟲基本發(fā)育到4齡，而注射POdsRNA的大豆食心蟲幼蟲大部分還處于二齡(圖13)。因此表明核糖體蛋白PO基因在大豆食心蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，該基因可以作為靶基因用于構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，用于培育高抗抗大豆食心蟲大豆種質(zhì)。實(shí)施例4核糖體蛋白PO基因RNAi表達(dá)載體構(gòu)建及大豆遺傳轉(zhuǎn)化核糖體蛋白PO基因RNAi表達(dá)載體構(gòu)建核糖體蛋白PO基因RNAi表達(dá)載體構(gòu)建流程參見圖14，由于大豆轉(zhuǎn)化效率較低， 而且轉(zhuǎn)化效率因基因型不同差別很大，所以在進(jìn)行體外人工合成PO的dsRNA的同時(shí)，利用introgen公司的Gateway技術(shù)構(gòu)建高效植物表達(dá)載體構(gòu)建，在設(shè)計(jì)擴(kuò)增用于體外轉(zhuǎn)錄 dsRNA的PO目的片段引物時(shí)，在引物上下游的5’端加上attb特異序列形成Gateway接頭， 引物具體如下Po attB 15-GGGG ACA AGT TTG TAC AM AM GCA GGC TTCCACCAGCCATTCTTGACA-3Po attB25-GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTCCCTCGACCTTCTTCTCCT-3利用引物Po attBl和引物Po attB2以大豆食心蟲cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為95°C 5min,95°C lmin,62°C lmin,72°C 2min，30 循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物約為356bp，將擴(kuò)增產(chǎn)物利用DNA凝膠回收試劑盒獲得帶Gateway接頭的PO目的片段。利用introgen BP Clonase Enzyme Mix進(jìn)行中間載體pD0NR201和Gateway接頭的PO目的片段的Bp連接反應(yīng)，構(gòu)建帶有PO目的基因片段的入門克隆(PD0NR201-P0)，利用introgen LPClonase Enzyme Mix將已構(gòu)建好的入門克隆 (pD0NR201-P0)載體與植物RNAi表達(dá)載體pJawohl8_RNAi進(jìn)行LP反應(yīng)，構(gòu)建了 PO基因的 RNAi植物表達(dá)載體pJaWOhl8-P0RNAi，PCR鑒定陽(yáng)性的克隆轉(zhuǎn)化子，用凍融法將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞。大豆種子經(jīng)氯氣消毒處理，萌發(fā)培養(yǎng)7d后，將兩片子葉從子葉節(jié)處縱向切開，保留2-3mm下胚軸，用解剖刀切去萌發(fā)的頂芽和側(cè)芽，用帶有植物表達(dá)RNAi載體 PJawohlS-PORNAi農(nóng)桿菌浸染大豆子葉節(jié)，經(jīng)ppT篩選得到TO抗性苗，利用PO基因特異性引物Po sense 5’ -CACCAGCCATTCTTGACA-3’Po antisense 5'-CCTCGACCTTCTTCTCCT-3‘對(duì)TO代抗性苗進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，獲得PCR陽(yáng)性10株系(DN50-P0-1，DN50-P0_4， DN50-P0-5, DN50-P0-7, DN50-P0-9， DN50-P0-18， DN50-P0-18， DN50-P0-22， DN50-P0-63， DN50-P0-71)，PO植物表達(dá)RNAi載體整合到大豆中，獲得表達(dá)豆食心蟲POdsRNA的轉(zhuǎn)基因株系。實(shí)驗(yàn)例轉(zhuǎn)基因大豆抗食心蟲性驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因后代材料抗食心蟲鑒定在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因中間試驗(yàn)基地進(jìn)行防蟲網(wǎng)室中進(jìn)行。在防蟲網(wǎng)室內(nèi)種植穩(wěn)轉(zhuǎn)表達(dá)豆食心蟲P0dsRNAT2代轉(zhuǎn)基因株系(DN50-P0-9和 N50-P0-71)和受體材料(東農(nóng)50)，每個(gè)品種種15盆，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。于8月上中旬 (5 15日)大豆食心蟲成蟲發(fā)生盛期到田間捕蛾，進(jìn)行網(wǎng)室內(nèi)人工接蟲。接蟲密度20對(duì) /m2。每5天接蟲一次，分早、中、晚三期接入，以增大成蟲選擇適宜豆莢產(chǎn)卵的機(jī)會(huì)。籽粒成熟后，每次重復(fù)隨機(jī)取樣10株，脫粒后調(diào)查蟲食率。大豆抗蟲性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)蟲食率> 30% 為高感(HS) ；30%>蟲食率彡20%為感蟲⑶；20%>蟲食率彡13%為中度感蟲(M) ；13% >蟲食率彡9%為抗蟲(R)；蟲食率<9%為高抗0 )。數(shù)據(jù)分析采用SAS8.02進(jìn)行。結(jié)果如下表1T2轉(zhuǎn)基因大豆部分農(nóng)藝性狀及抗蟲分析
權(quán)利要求
1.一種編碼大豆食心蟲核糖體蛋白的基因，其堿基序列如SEQ IDNO :1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述大豆食心蟲核糖體蛋白基因的載體。
3.權(quán)利要求2所述載體為RNAi植物表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求3所述RNAi植物表達(dá)載體為pJawohl8-P0RNAi。
5.用權(quán)利要求2-4任意一項(xiàng)所述含有大豆食心蟲核糖體蛋白基因的載體轉(zhuǎn)化的具有殺蟲能力的植物細(xì)胞、組織或植株。
6.權(quán)利要求1所述大豆食心蟲核糖體蛋白基因在提高大豆抗食心蟲能力中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述含有大豆食心蟲核糖體蛋白基因的載體在在提高大豆抗食心蟲能力中的應(yīng)用。
8.一種提高大豆抗食心蟲能力的方法，將大豆食心蟲核糖體蛋白基因?qū)氪蠖菇M織或細(xì)胞，得到食心蟲抗性提高的大豆，所述大豆食心蟲核糖體蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述大豆食心蟲核糖體蛋白基因通過(guò)含有所述大豆食心蟲核糖體蛋白基因的載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，提供了一種大豆食心蟲核糖體蛋白P0基因，其堿基序列如SEQ ID NO1所示。體外合成P0基因的dsRNA，利用顯微注射技術(shù)將P0基因dsRNA導(dǎo)入到一齡末大豆食心蟲幼蟲體內(nèi)，結(jié)果證明P0基因是大豆食心蟲核糖體重要組成部分，在蛋白質(zhì)的合成中起著重要作用，P0基因mRNA被降解后，大豆幼蟲由于不能合成生長(zhǎng)發(fā)育所需的蛋白質(zhì)而大量死亡。該基因可以作為靶基因用于構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，用于培育高抗大豆食心蟲大豆種質(zhì)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102399787SQ201110338659
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者孟凡立, 張大勇, 李文濱, 王志坤 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)