專利名稱：極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因的克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因的克隆及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高濃度的鹽引起植物體內(nèi)的離子失衡和高滲脅迫，導(dǎo)致植物發(fā)育不良、生長緩慢， 特別是降低農(nóng)作物產(chǎn)量。嚴(yán)重的鹽脅迫或滲透脅迫會(huì)引起植物體內(nèi)的第二脅迫-氧化脅迫的發(fā)生，甚至導(dǎo)致植物死亡。因此，鹽脅迫受到人們的廣泛關(guān)注，提高作物的耐鹽性亦愈來愈受到人們的重視。通過轉(zhuǎn)基因提高作物的耐鹽能力是一種行之有效的辦法。因此，尋找與鹽脅迫有關(guān)的基因并研究其具體功能，以及調(diào)控途徑具有重要的理論和實(shí)踐意義。在所有活細(xì)胞中，核糖體是蛋白質(zhì)合成所必需的細(xì)胞器。核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分，它通過促進(jìn)核糖體RNA折疊而使之處于最利于其執(zhí)行翻譯功能的構(gòu)象狀態(tài)，而提高蛋白質(zhì)生物合成的效率和準(zhǔn)確度，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡，在生物體的生長、 發(fā)育中起著關(guān)鍵性的作用。核糖體蛋白(RP)是核糖體的重要組成部分，在核糖體的翻譯過程中起重要的作用，例如對(duì)rRNA進(jìn)行折疊，形成有功能的三維結(jié)構(gòu)；在蛋白質(zhì)合成過程中對(duì)核糖體的空間構(gòu)象進(jìn)行調(diào)整；在核糖體的結(jié)合位點(diǎn)上協(xié)同rRNA催化蛋白質(zhì)的合成。2001 年，Uechi等成功繪制出了全部80條RPG的遺傳物理圖譜，將80條RPG定位于2條性染色體和20條常染色體(除7號(hào)和21號(hào)常染色體)上，同時(shí)80條RPG的序列也已確定。到目前為止，80種RP中的75種，其氨基酸序列已確定，這為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。目前已知 RP在進(jìn)化過程中高度保守，RP氨基酸序列在幾乎所有哺乳動(dòng)物中均相同，酵母菌RP與人類 RP極其相似，原核細(xì)菌和真菌的RP數(shù)量比人類少得多，其氨基酸序列仍與人類相似。過去一直認(rèn)為RP的合成在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中都進(jìn)行了調(diào)控，近年來通過DNA芯片技術(shù)證明RP 的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與細(xì)胞的生長條件保持嚴(yán)格的一致，表明轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控在RP合成中起到了主導(dǎo)作用。核糖體蛋白進(jìn)化過程中高度保守的，在核糖體的生物合成或成熟的核糖體功能中是至關(guān)重要的。此外，核糖體蛋白具有不同的額外的核糖體的功能，如細(xì)胞凋亡，DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄。越來越多關(guān)于核糖體蛋白的數(shù)據(jù)已經(jīng)證明，許多核糖體蛋白可以調(diào)節(jié)反式激活功能調(diào)控因子如NF-JB，P53，c-Myc和核受體調(diào)節(jié)蛋白等。此外，核糖體的一個(gè)亞基蛋白質(zhì)可以直接綁定到mRNA的非翻譯區(qū)，進(jìn)而導(dǎo)致受到本身核糖體的特異性的轉(zhuǎn)錄的翻譯。總的來說，這些研究結(jié)果表明，核糖體蛋白可能存在一個(gè)更廣泛的功能。近年來發(fā)現(xiàn)，在核糖體蛋白中存在著可與DNA結(jié)合的特征結(jié)構(gòu)，人們由此推測(cè)，由核糖核酸(RNA)轉(zhuǎn)變?yōu)楹说鞍左w的核糖體可能是在RNA上添加一些本來就存在的蛋白后形成的。人們還觀察到，多種核糖體蛋白除組成核糖體外還具備其他的功能。核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分，在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成中發(fā)揮重要作用。近來人們發(fā)現(xiàn)，核糖體具有參與DNA修復(fù)、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控和細(xì)胞分化等核糖體外功能。 核糖體蛋白質(zhì)的一個(gè)亞基可以直接控制基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。首次發(fā)現(xiàn)在人類核糖體蛋白K(核蛋白K)和KH域結(jié)合RNA或DNA。RPS3結(jié)構(gòu)之中發(fā)現(xiàn)NF-JB Ρ65同源二聚體和亞基P65-P50DNA的異質(zhì)二聚體協(xié)同約束力的復(fù)合物增強(qiáng)了 DNA結(jié)合。RPS3損失產(chǎn)生負(fù)面影響NF-JB能夠誘導(dǎo)基因表達(dá)的變化。RPS3也參與其他額外的核糖體的活動(dòng)，它可以作為一種DNA修復(fù)內(nèi)切酶或caspase依賴的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。已有研究表明RPS3核糖體蛋白除了組成核糖體的主要成分之外，在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成中發(fā)揮重要作用，還具有DNA修復(fù)、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控和細(xì)胞分化等核糖體外功能。 在眾多的研究中，并沒有看到在極端嗜鹽曲霉RPS3核糖體蛋白的研究，而極端嗜鹽曲霉作為一種具有嗜鹽性的物種，對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力比較強(qiáng)，在極端嗜鹽曲霉中一定存在多抗基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于(1)提供一種DNA序列，其編碼一種極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因，命名為SpRPS3ae ;(幻提供一種利用基因工程方法得到極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白； (3)提供極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae在菌株抗鹽基因工程方面的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。從實(shí)驗(yàn)室中一種極端嗜鹽曲霉cDNA文庫中，利用PCR方法篩選克隆出極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae 利用RNAiso Reagent (購自大連Takara公司)提取極端嗜鹽曲霉CCHA總RNA，由上海intrigeon公司合成極端嗜鹽曲霉CCHA cDNA文庫，從極端嗜鹽曲霉酵母表達(dá)文庫中，篩選出抗鹽轉(zhuǎn)化子，測(cè)序得到編碼SpRPS3ae的序列，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)上下游引物，并以極端嗜鹽曲霉CCHA cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆出SpRPS3ae的全長基因。極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae由774個(gè)堿基組成，含有一個(gè)完整的開放閱讀框架，為序列表中的SEQ ID N0:1序列。開放讀碼框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為 TAG。本發(fā)明還提供了一種極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白，它是由一種極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae序列編碼，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示，是含有161個(gè)氨基酸殘基，其分子量大小為18. 60938kDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為10. 45。一種重組原核表達(dá)載體含有極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae，重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。如實(shí)施例二所述，還可利用基因工程的方法，在高效大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出具有生物活性的極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae。關(guān)于在酵母抗鹽基因工程方面的應(yīng)用一種極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae在酵母菌株抗鹽基因工程方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于提供了一種極端嗜鹽曲霉的核糖體蛋白基因SpRPS3ae及蛋白，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并將驗(yàn)證正確的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)菌株中誘導(dǎo)表達(dá)，通過高鹽、中鹽和低鹽脅迫后觀察測(cè)定菌落生物活性，分析極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae可提高菌株抗鹽的能力。


圖1為以極端嗜鹽曲霉CCHA cDNA為模板，PCR擴(kuò)增電泳圖其中M:marker 自上到下大小為1849bp、1050bp、73m3p、424bpJ80bp1、2、3:目的條帶圖2為SpRPS3ae原核表達(dá)載體的構(gòu)建過程示意圖
圖3為SDS-PAGE原核表達(dá)全蛋白電泳圖其中M=Marker 從上至下為 97、66、43、31 (kDa)1、2 含有重組克隆質(zhì)粒pET_32a :SpRPS3ae的BL21宿主菌全蛋白CK 含有空載體質(zhì)粒pET_32a的BL21宿主菌全蛋白圖4為低鹽脅迫后酵母菌株生活力平板菌落示意5為中鹽脅迫后酵母菌株生活力平板菌落示意6為高鹽脅迫后酵母菌株生活力平板菌落示意4、圖5和圖6中ff(GS115)野生型酵母菌株GSl 15 ；SpRPS3ae 轉(zhuǎn)SpRPS3ae基因陽性酵母菌株。0% :ff(GS115)和SpRPS3ae未做稀釋鹽脅迫處理；10% :ff(GS115)和 SpRPS3ae 稀釋 10 倍鹽脅迫處理；100% :ff(GS115)和 SpRPS3ae 稀釋 100 倍鹽脅迫處理；1000% :ff(GS115)和 SpRPS3ae 稀釋 1000 倍鹽脅迫處理。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一克隆極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae1.提取 RNA 取500mg極端嗜鹽曲霉用RNAiso Reagent提取極端嗜鹽曲霉總RNA。2.構(gòu)建 cDNA 文庫取總RNA，由hvitrigeon公司構(gòu)建合成cDNA文庫，利用酵母轉(zhuǎn)化方法篩選出轉(zhuǎn)化子，測(cè)序得到序列，經(jīng)比對(duì)分析為40s核糖體蛋白基因，命名為SpRPS3ae。3.極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae片段的克隆根據(jù)測(cè)序得到的40s核糖體蛋白基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物，并以極端嗜鹽曲霉 cDNA文庫為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。特異性引物如下SpRPS3ae-Pl :5，-GGATCCACCGTAGTCGCAGTCATG-3，，斜體堿基為 BamH I 酶切位點(diǎn)；SpRPS3ae-P2 :5，-GAGCTCTTTTTGTCTCTTGCTCTCCG-3，，斜體堿基為 Sac I 酶切位
點(diǎn)ο克隆PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min ；94°C變性50sec ；58°C退火30sec ；72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在大約774bp 位置上有一特異性的條帶(圖1)。按常規(guī)方法將片段克隆到PMD18-T Vector (購自大連 Takara公司)中，并經(jīng)上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae的序列分析
經(jīng)測(cè)序該基因cDNA序列開放閱讀框包含774bp，含有一個(gè)完整的開放閱讀框架， 如序列表中的SEQ ID NO :1中所示。編碼161個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :2中所示，分子量大小為18. 60938kDa，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為10. 45，結(jié)果表明獲得了全長基因的cDNA序列。禾Ij 用 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)對(duì)該基因編碼的氨基酸進(jìn)行保守區(qū)域分析，結(jié)果表明該蛋白屬40s核糖體蛋白。對(duì)SpRPS3ae基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行BLAST，顯示的幾乎都為40s核糖體蛋白家族，與已確定功能的其他物種氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析和同源性分析極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae 與 aspergillus flavus nrrl3357 禾口 aspergillus oryzae rib40 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系最近， 而與sclerotinia sclerotiorum 1980 uf_70系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。。利用SOPMA對(duì)極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)含有37. 89%的α螺旋(h)，20. 50%的延伸鏈(e)，34. 16%的隨機(jī)卷曲(c)，7.45%的β旋轉(zhuǎn)⑴。實(shí)施例二 極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae在菌株中的高效表達(dá)1.原核表達(dá)載體的構(gòu)建為了表明極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae的編碼功能，將極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae連接到pET-32a(+)的Me I和BamH I位點(diǎn)之間，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得高效表達(dá)。設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物5，-GGATCCACCGTAGTCGCAGTCATG-3，，斜體堿基為 BamH I 酶切位點(diǎn)；5，-GAGCTCAGCAGCGATGTGGAGTAGA-3，，斜體堿基為 c I 酶切位點(diǎn)。按分子克隆常規(guī)實(shí)驗(yàn)程序，用PCR的方法擴(kuò)增出兩端帶有特定酶切位點(diǎn)的基因編碼序列，將基因和載體PMD18-T(購于上海鼎國生物公司)連接，驗(yàn)證正確。取pMD18: SpRPS3ae質(zhì)粒和pET_32a(+)質(zhì)粒(購于上海鼎國生物公司)分別用BamHUac I雙酶切、 再連接(構(gòu)建過程見圖2)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株(購于凱基生物公司)中， 并用含100ug/ml Amp的LB培養(yǎng)基篩選重組子。經(jīng)質(zhì)粒酶切鑒定和PCR鑒定后，將連接正確的重組子進(jìn)行測(cè)序，證明插入載體的DNA序列的閱讀框架是正確的。將構(gòu)建成帶有極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae的表達(dá)載體，命名ρΕΤ_3^ι :SpRPS3ae，用于誘導(dǎo)表達(dá)分析。2.原核表達(dá)將含有pET-32a :SpRPS3ae重組子的菌株，接種于LB培養(yǎng)基(1L 蛋白胨IOg, 酵母提取物5g，NaCL 10克)，37 °C培養(yǎng)至菌液0D600 = 0. 4-0. 6。將BL21重組表達(dá)菌株研磨及超聲破碎，我們得到了含有重組克隆質(zhì)粒pET-32a :SpRPS3ae的BL21宿主菌粗酶液。 進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，從圖3中可以看出，極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae 在BL21菌株中高效表達(dá)。實(shí)施例三鹽脅迫后轉(zhuǎn)基因酵母菌株細(xì)胞生活力測(cè)定通過構(gòu)建酵母表達(dá)文庫，將極端嗜鹽曲霉的40s核糖體蛋白基因SpRPS3ae成功重組于pPICZ alpha A載體中，并且進(jìn)行了表達(dá)和抗鹽性的驗(yàn)證。分別取轉(zhuǎn)酵母陽性克隆和野生型酵母菌株的單菌落于5mL含100μ g/mL Zeocin的YPD液體培養(yǎng)基中，30°C、200r/min振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 5。將已培養(yǎng)到相同OD值的轉(zhuǎn)酵母陽性克隆和野生型酵母菌株菌液分別稀釋10倍，100倍，1000倍，然后分別吸取原始濃度菌液和稀釋稀釋10倍，100倍，1000 倍菌液 IOuL 接種于 10% NACL YPD 平板，15% NACL YPD 平板，20% NACL YPD 平板。30°C培養(yǎng)兩到三天,分別觀察10% NACL YPD平板，15% NACL YPD平板，20% NACL YPD平板上轉(zhuǎn)酵母陽性克隆和野生型酵母菌株的生長情況。 結(jié)果表明鹽脅迫下陽性克隆菌株生活力明顯高于野生型菌株，將酵母陽性克隆和野生型酵母菌株(GS115)分別吸取原始濃度菌液和稀釋10倍，100倍，1000倍菌液IOuL 接種于10% NACLYPD平板、15% NACLYPD平板和20% NACLYPD平板上之后觀察到的菌落生長情況表明30°C培養(yǎng)兩到三天到四天之后，轉(zhuǎn)SpRPS3ae基因酵母菌株分別在低鹽(10% NACL)YPD平板，中鹽(15% NACL)YPD平板，高鹽(20% NACL)YPD平板上均能生長，而野生型酵母菌株GS115均不能生長(如圖4、圖5和圖6)。說明極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因 SpRPS3ae能提高菌株的抗鹽能力。
權(quán)利要求
1.一種極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae，其特征在于其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO 1 所示。
2.一種極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白，其特征在于它是由權(quán)利要求1所述的一種極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae序列編碼、其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.—種重組原核表達(dá)載體，其特征在于含有如權(quán)利要求1所述的極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae。
4.一種用權(quán)利要求3所述的重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1所述的一種極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因SpRPS3ae在酵母菌株抗鹽基因工程方面的應(yīng)用。
全文摘要
極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因的克隆及應(yīng)用屬分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO1所示；同時(shí)提供極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白，它由極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因序列編碼、其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO2所示；重組原核表達(dá)載體含有極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因；重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞；本發(fā)明極端嗜鹽曲霉核糖體蛋白基因的應(yīng)用，能提高酵母菌株的抗鹽能力。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102517296SQ20111038193
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者劉曉丹, 劉金亮, 張世宏, 潘洪玉, 謝麗霞, 賈保磊, 魏毅 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)