專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
蕓薹屬植物在十字花科中具有較重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蕓薹屬中包含了六個(gè)最基本的品種類(lèi)型，包括白菜型油菜(B. rapa, 2n = 20，AA)、黑芥(B. nigra，2n = 16，BB)和甘藍(lán)(B. oleracea，2n = 18，CC)三個(gè)二倍體種，以及甘藍(lán)型油菜(B. napus，2n = 38，AACC)、 芥菜型油菜(B. juncea, 2n = 36，AABB)和埃塞俄比亞芥(B. carinata,2n = 34，BBCC)三個(gè)四倍體復(fù)合種，這就是著名的禹氏三角(UN，1935)。這些蕓薹屬植物在遺傳改良中具有很大的潛力，每個(gè)種都存在獨(dú)特的特異基因。例如，白菜型油菜具有較強(qiáng)的抗潮和抗寒能力，特別是它具有較短的生育期，這些特征使得它在生產(chǎn)上具有很大的價(jià)值，但是產(chǎn)量低以及易受病害則在某種程度上限制了它的推廣。而埃塞俄比亞芥卻具有很強(qiáng)的抗病能力以及特殊的黃色種皮，但它的生育期長(zhǎng)成為了在生產(chǎn)上應(yīng)用最大的障礙。在自然界中，蕓薹屬含有A，B和C三個(gè)基因組的六倍體物種(AABBCC)是不存在的。但在其他物種中六倍體是可以存在并且在生產(chǎn)上得到大量應(yīng)用，例如六倍體小麥。近期的研究中，Tian E等人在題為"Synthesis of a Brassica trigenomic allohexaploid(B. carinataXB. rapa) de novo and its stability in subsequent generations" (Theoretical and Applied Genetics，2010，121，1431-1440)以及 Pradhan 等人在題為 “Successful induction of trigenomic hexaploid Brassica from a triploid hybrid of B. napus L. and B. nigra(L)Koch. ”(Euphytica，2010，176，87-98)的文章中，通過(guò)蕓薹屬不同物種間的雜交(B. rapaXB. carinata, B. nigraXB. napus, B. juncea, B. napus 禾口 B. carinata 三者之間等)獲得了一種新型并且穩(wěn)定的六倍體油菜，這種六倍體油菜包含蕓薹屬的三個(gè)基因，對(duì)蕓薹屬作物的研究和蕓薹屬中ABC基因組作圖等具有很大的影響。自1982年Lichter首次報(bào)道油菜游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株以來(lái)，蕓薹屬作物，尤其是油菜的小孢子培養(yǎng)，小孢子的出胚率、出胚量以及胚培養(yǎng)及再生植株方面都獲得了很大的成功。但對(duì)于這種新型的六倍體油菜的小孢子培養(yǎng)鮮有報(bào)道。我們知道甘藍(lán)型油菜游離小孢子培養(yǎng)比較容易，但蕓薹屬中的其他作物例如甘藍(lán)屬和芥菜屬的小孢子培養(yǎng)難度比較大，尤其是對(duì)于較難出胚的品種來(lái)說(shuō)特別不易。因此，在這種人工雜交合成的六倍體油菜中包含了 ABC三個(gè)基因組，我們不能確定三個(gè)基因組同時(shí)存在的情況是否會(huì)影響到小孢子培養(yǎng)的出胚率及胚的質(zhì)量，從而對(duì)將來(lái)DH(doubled haploid，雙單倍體)群體的建立有障礙。因此，尋找一種適合六倍體油菜小孢子培養(yǎng)的方法顯得極其重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，成功培育出了第一個(gè)人工雜交六倍體油菜小孢子來(lái)源的雙單倍體群體，為將來(lái)制作六倍體油菜遺傳圖譜以及與農(nóng)業(yè)相關(guān)性狀的QTL提供了很好的資源。一種人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)取人工雜交六倍體油菜的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體；(2)將滅菌后的六倍體油菜花蕾加入到1/2B5-13培養(yǎng)基中研磨成懸浮液，過(guò)濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液得到沉淀；在所述沉淀中加入NLN-13液體培養(yǎng)基，將小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3 X IO5 5 X IO5個(gè)細(xì)胞/mL后，再依次加入秋水仙堿溶液和活性炭混合液，得到六倍體油菜小孢子培養(yǎng)的混合懸浮液；(3)將所述六倍體油菜小孢子培養(yǎng)的混合懸浮液在黑暗條件下于30°C 33°C恒溫?zé)峒ぬ幚? 3天后，在黑暗條件下于20°C 培養(yǎng)10天 15天，直至肉眼可見(jiàn)時(shí)， 在黑暗條件下于20°C 再震蕩培養(yǎng)5天 10天，得到子葉期胚狀體；(4)將所述子葉期胚狀體接種到含有細(xì)胞分裂素的再生培養(yǎng)基中，在每天12小時(shí) 18小時(shí)光照和20°C 下培養(yǎng)，形成再生芽；(5)切取再生芽接種至不含激素的生根培養(yǎng)基中，在每天12小時(shí) 18小時(shí)光照和 20°C 條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，將根生長(zhǎng)健壯的苗煉苗后移栽到土壤里，得到再生植株， 鑒定倍性。本發(fā)明中，所述人工雜交六倍體油菜通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)方法制備得到，具體詳見(jiàn) Pradhan A 等(2010). Successful induction of trigenomic hexaploid Brassica from a triploid hybrid of B. napus L. and B. nigra(L. )Koch. Euphytica 176,87-98.以及 Tian E^ (2010) Synthesis of a Brassica trigenomic allohexaploid(B. carinataXB. rapa)de novo and its stability in subsequent generations. Theoretical andApplied Genetics 121,1431-1440.中的記載。本發(fā)明中，所述花蕾為自然界中不存在的人工雜交六倍體油菜的花蕾，優(yōu)選所述花蕾的長(zhǎng)度為2 4mm，花粉母細(xì)胞處于單核晚期至雙核早期，花蕾的數(shù)目為80 100個(gè)。本發(fā)明中，所述滅菌采用本領(lǐng)域常規(guī)的滅菌方法?？紤]到次氯酸鈉滅菌的效果較好，并且沒(méi)有毒害，本發(fā)明中優(yōu)選采用次氯酸鈉溶液將人工雜交六倍體油菜花蕾滅菌15 30分鐘，后用無(wú)菌水清洗干凈。所述次氯酸鈉溶液，以IL計(jì)，組成為次氯酸鈉56ml 100ml、無(wú)水乙醇100ml、洗潔精8 10滴和余量的無(wú)菌水，配制成體積百分為5. 6 10%的次氯酸鈉水溶液。本發(fā)明中所述1/2B5-13液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末1. 6g(即，減半的B5完全培養(yǎng)基粉末)，蔗糖130g，IL無(wú)菌水，PH5. 6 6. 2。所述NLN-13液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為NLN液體培養(yǎng)基IL和蔗糖130g，PH 5. 6 6. 2。所述NLN液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為Austratec 公司的NLN培養(yǎng)基粉末1. 92g， IL無(wú)菌水。所述秋水仙堿溶液的質(zhì)量百分濃度為0. 3% 0. 8%。秋水仙堿是植物加倍技術(shù)中最常用的試劑，可以作用在植物的根，子房等器官實(shí)現(xiàn)染色體加倍。在小孢子游離過(guò)程中加入秋水仙堿溶液的加倍率比較高，而且用量少污染小。所述活性炭混合液，以IL計(jì)，組成為NLN液體培養(yǎng)基1L，瓊脂糖2 5g和8
515g活性炭。所述再生培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末3. 21g，IL無(wú)菌水，蔗糖20 30g，瓊脂粉2 4g，植物凝膠3 5g，1 3ml濃度為 0. 5 1. 5mg/ml的細(xì)胞分裂素以及PH5. 6 6. 2。所述生根培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末3. 21g，IL無(wú)菌水，蔗糖20 30g，瓊脂粉2 4g，植物凝膠3 5g以及PH5. 6 6. 2。Austratec 公司的 NLN 培養(yǎng)基粉末 1. 92g,組成為KN03125mg，Ca(NO3)2 · 4H20 500mg, MgSO4 61mg, KH2PO4 125mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 IOmg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, 0. 5mg 維生素 Bi，0. 5mg 維生素B6,生物素0. 05mg,葉酸0. 5mg, NaFeEDTA 36. 70mg,肌醇IOOmg,甘氨酸2mg,煙酸 5mg, L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，絲氨酸lOOmg。Austratec 公司的 Gamborg，B5 完全培養(yǎng)基粉末 3. 21g，組成為=NaH2PO4. H2O 150mg, CaCl2 113. 24mg,KI 0. 75mg, KNO3 2500mg, (NH4) 2S04134mg，MgSO4 · 7H20 125mg, H3BO3 3. Omg, MnSO4 · H2O IOmg, ZnSO4 · 7H202mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 ·6Η20 0. 025mg, IOmg 維生素 Bi, Img 維生素 B6,Na2EDTA 37. 3mg,FeSO4 ·7Η20 27. 8mg, 肌醇lOOmg，煙酸lmg。減半的B5 完全培養(yǎng)基粉末，組成為=NaH2PO4. H2O 75mg, CaCl256. 62mg, KI 0. 375mg, KNO3 1250mg, (NH4)2SO4 67mg, MgSO4 · 7H2062. 5mg, H3BO3 1. 5mg, MnSO4 · H2O 5mg, ZnSO4 · 7H20 lmg, Na2MoO4 · 2H200. 125mg, CuSO4 · 5H20 0. 0125mg, CoCl2 · 6H20 0. 0125mg, 5mg 維生素 Bi，0. 5mg 維生素 B6，Na2EDTA 18. 65mg,FeSO4 ·7Η20 13. 9mg，肌醇 50mg，煙酸 0. 5mg。步驟(2)中，所述的研磨、離心、棄上清液及用NLN-13液體培養(yǎng)基分散小孢子細(xì)胞的操作可以重復(fù)進(jìn)行1 2次S卩，步驟O)的具體步驟可以如下將滅菌后的六倍體油菜花蕾加入到1/2B5-13培養(yǎng)基中研磨成懸浮液，過(guò)濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液得到沉淀后；在沉淀中再次加入1/2B5-13培養(yǎng)基研磨成懸浮液，再次過(guò)濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液，再次得到沉淀；在所述沉淀中加入NLN-13液體培養(yǎng)基， 在顯微鏡下利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算小孢子細(xì)胞濃度，再用一定量的NLN-13液體培養(yǎng)基小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3 X IO5 5 X IO5個(gè)細(xì)胞/mL后，依次加入秋水仙堿溶液和活性炭混合液，得到六倍體油菜小孢子培養(yǎng)的混合懸浮液。步驟O)中，所述的過(guò)濾可采用44μπι無(wú)菌濾網(wǎng)。所述的離心的條件一般為 900rpm/min 1200rpm/min 離心 3 5min。步驟(3)中，熱激后的小孢子懸浮液能夠更促進(jìn)小孢子細(xì)胞的胚胎發(fā)生。步驟(3)中，所述子葉期小孢子胚狀體可放入3°C 8°C冰箱中冷藏保存，以延長(zhǎng)胚狀體的保存期限。步驟(3)中，在黑暗條件下培養(yǎng)溫度優(yōu)選為25士2°C，S卩在黑暗條件下25士2°C于培養(yǎng)至肉眼可見(jiàn)胚狀體時(shí)，再在黑暗條件下于25 士 2°C條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)。在黑暗條件下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)相對(duì)于不搖動(dòng)培養(yǎng)的小孢子吸收營(yíng)養(yǎng)更充分，因此胚生長(zhǎng)的較迅速以及較健壯。步驟(4)中，所述培養(yǎng)條件優(yōu)選為每天16小時(shí)光照和25°C下培養(yǎng)。一般培養(yǎng)時(shí)間為20 30天。步驟中，所述的子葉期小孢子胚狀體接種到再生培養(yǎng)基上，只需要留下已經(jīng)直接成苗的幼芽，其他愈傷組織都不再保留，這樣既保證了苗的質(zhì)量也避免了不必要的時(shí)間浪費(fèi)。步驟(5)中，所述的直接成苗的幼苗接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件優(yōu)選為每天 16小時(shí)光照和25 °C下培養(yǎng)。一般培養(yǎng)時(shí)間為25 30天。步驟(5)中，移栽時(shí)用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，減去較長(zhǎng)的根，以便于移栽。隨后植于裝好滅菌土的穴盤(pán)中，塑料膜罩住保濕5 7天，在溫室中培養(yǎng)15 20天后移栽到大的盆缽中。步驟(5)中，所述的鑒定可采用本領(lǐng)域常用的倍性鑒定方法，如取再生植株的最嫩的葉片檢測(cè)各再生植株倍性。可用美國(guó)BD公司的BDFACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析的鑒定。本發(fā)明所述的六倍體油菜小孢子培養(yǎng)方法與傳統(tǒng)的甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)方法相比，得到的小孢子胚狀體的質(zhì)量更好，小孢子數(shù)目更多，利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器將游離出的小孢子細(xì)胞數(shù)目做了適當(dāng)調(diào)整，對(duì)于小孢子的胚胎發(fā)生具有很重要的作用。在小孢子游離過(guò)程中進(jìn)行秋水仙堿加倍，不僅污染小而且加倍的效率比用根浸染的方法高。對(duì)子葉型小孢子胚狀體進(jìn)行低溫保存，能大大的延長(zhǎng)胚狀體的保存期限。用傳統(tǒng)方法在25°C的培養(yǎng)室中保存的子葉型胚狀體一般7 10天不移入再生培養(yǎng)基中便變黃死亡，而利用低溫保存的小孢子胚狀體可保存長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月的時(shí)間。本發(fā)明中在游離小孢子細(xì)胞的過(guò)程中利用1/2B5-13 培養(yǎng)基作為游離培養(yǎng)基比傳統(tǒng)的NLN-13培養(yǎng)基具有更好的效果。再生培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基都采用B5成分的固體培養(yǎng)基成苗率和生根率更高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明首次公開(kāi)了一種新型的人工合成的蕓薹屬油菜品種(人工雜交六倍體油菜)小孢子培養(yǎng)的方法，培育出了第一個(gè)人工雜交六倍體油菜小孢子來(lái)源的雙單倍體群體。利用此種方法培育出來(lái)的六倍體油菜小孢子得到的雙單倍體群體，為將來(lái)制作含有ABC 三個(gè)基因組的六倍體油菜遺傳圖譜以及與農(nóng)業(yè)相關(guān)性狀QTL提供了很好的資源。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。實(shí)施例1 (1)培養(yǎng)基配制①NLN液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為Austratec 公司的NLN培養(yǎng)基粉末1. 92g， IL無(wú)菌水，過(guò)濾滅菌。②NLN-13液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為NLN液體培養(yǎng)基IL和蔗糖130g，PH5. 8， 過(guò)濾滅菌。③1/2B5-13液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末1. 6g( S卩，減半的B5完全培養(yǎng)基粉末)，蔗糖130g，IL無(wú)菌水，PH5. 8，過(guò)濾滅菌。④再生培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末3. 21g，IL無(wú)菌水，蔗糖20g，瓊脂粉3g，植物凝膠4g，1. 5ml細(xì)胞分裂素(lmg/ml)以及 PH5. 8，高溫高壓滅菌。⑤生根培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末3. 21g，IL無(wú)菌水，蔗糖20g，瓊脂粉3g，植物凝膠4g以及PH5. 8，高溫高壓滅菌。Austratec 公司的 NLN 培養(yǎng)基粉末 1. 92g,組成為KN03 125mg, Ca(NO3)2 · 4H20 500mg, MgSO4 61mg, KH2PO4 125mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 IOmg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, 0. 5mg 維生素 Bi，0. 5mg 維生素B6,生物素0. 05mg,葉酸0. 5mg, NaFeEDTA 36. 70mg,肌醇IOOmg,甘氨酸2mg,煙酸 5mg, L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，絲氨酸lOOmg。Austratec 公司的 Gamborg，B5 完全培養(yǎng)基粉末 3. 21g，組成為=NaH2PO4. H2O 150mg, CaCl2 113. 24mg,KI 0. 75mg, KNO3 2500mg, (NH4) 2S04134mg，MgSO4 · 7H20 125mg, H3BO3 3. Omg, MnSO4 · H2O IOmg, ZnSO4 · 7H202mg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 ·6Η20 0. 025mg, IOmg 維生素 Bi, Img 維生素 B6,Na2EDTA 37. 3mg,FeSO4 ·7Η20 27. 8mg, 肌醇lOOmg，煙酸lmg。減半的B5 完全培養(yǎng)基粉末，組成為=NaH2PO4. H2O 75mg, CaCl256. 62mg, KI 0. 375mg, KNO3 1250mg, (NH4)2SO4 67mg, MgSO4 · 7H2062. 5mg, H3BO3 1. 5mg, MnSO4 · H2O 5mg, ZnSO4 · 7H20 lmg, Na2MoO4 · 2H200. 125mg, CuSO4 · 5H20 0. 0125mg, CoCl2 · 6H20 0. 0125mg, 5mg 維生素 Bi，0. 5mg 維生素 B6，Na2EDTA 18. 65mg,FeSO4 ·7Η20 13. 9mg，肌醇 50mg，煙酸 0. 5mg。(2)六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)1)供體植株花蕾的選擇取六倍體油菜生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害的初花期的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體；取花蕾長(zhǎng)度為2mm、單核晚期至雙核早期的花蕾80個(gè)；2)花蕾的滅菌用次氯酸鈉56ml/L+無(wú)水乙醇100ml/L+洗潔精10滴+無(wú)菌水配制成的體積百分濃度為5. 6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把花蕾放入小瓶中，加入50ml次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒20分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水蕩洗3次后，備用；3)在超凈工作臺(tái)上將滅菌后的花蕾一并置于無(wú)菌燒杯中，加入少量1/2B5-13培養(yǎng)基，用滅過(guò)菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮1/2B5-13培養(yǎng)基至30ml ；該懸浮液用44 μ m無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾到50ml離心管中，蓋緊，900rpm/min離心;3min，離心后倒掉上清液，往沉淀中再加入30ml的1/2B5-13培養(yǎng)基，按上述方法再離心1次，棄上清液；往沉淀中加入NLN-13液體培養(yǎng)基30ml，取1. 5ul溶液用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在5X顯微鏡下計(jì)算小孢子細(xì)胞密度為9 X IO5個(gè)細(xì)胞/mL。所需的密度為3 X IO5個(gè)細(xì)胞/mL，因此再補(bǔ)加60mL的 NLN-13液體培養(yǎng)基，分裝到9個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中，每皿IOmL小孢子懸浮液，每皿中依次加入 40ul秋水仙堿溶液(質(zhì)量百分濃度為0. 5% )及IOOul高壓滅菌后的活性炭混合液(1L活性炭混合液的組成為NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2g和IOg活性炭)。4)將裝有該小孢子混合懸浮液的培養(yǎng)皿，加蓋后用pamfilm@封口膜(美國(guó) parafilm公司)封口，錫紙包裹后置于32. 5°C恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理3 天；再置于25°C恒溫培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)12天；至肉眼可見(jiàn)胚狀體時(shí)，置于25°C培養(yǎng)搖床上搖動(dòng)培養(yǎng)7天后得到子葉期胚狀體，放入4°C冰箱中冷藏保存；5)將子葉期胚狀體接種至再生培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、25°C條件下培養(yǎng)M 天，直接形成再生幼芽；6)切取生長(zhǎng)健康的再生幼芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、25°C條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)；25天后將根生長(zhǎng)健壯的苗用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，減去較長(zhǎng)的根，以便于移栽。隨后植于裝好滅菌土的穴盤(pán)中，塑料膜罩住保濕5天，在溫室中培養(yǎng)15天后移栽到大的盆缽中，得到再生植株。7)取再生植株的嫩葉，用美國(guó)BD公司的BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析， 檢測(cè)各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。檢測(cè)方法如下以四倍體甘藍(lán)型油菜作為對(duì)照樣品，先用流式細(xì)胞儀對(duì)四倍體甘藍(lán)型油菜進(jìn)行檢測(cè)，并將四倍體甘藍(lán)型油菜PI-DNA-A的峰值的指數(shù)調(diào)為50，000。再通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)各植株進(jìn)行檢測(cè)得到的直方圖中的數(shù)據(jù)，可以很容易估計(jì)出樣品的倍性水平。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)上述實(shí)施例1所得的各植株倍性，分別得到檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果中PI-DNA-A峰值為 35，000，顯示相應(yīng)植株倍性為未成功加倍的六倍體油菜小孢子來(lái)源的單倍體，不保存該單倍體植株；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果中PI-DNA-A峰值為70，000,顯示相應(yīng)植株倍性為成功完成加倍的六倍體油菜的雙單倍體，保存該雙單倍體植株。結(jié)果六倍體油菜出胚率為81個(gè)/蕾。實(shí)施例2:(1)培養(yǎng)基配制①NLN液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。②NLN-13液體培養(yǎng)基，組成為NLN液體培養(yǎng)基IL和蔗糖130g，pH6. 0，過(guò)濾滅菌。③1/2B5-13液體培養(yǎng)基，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末1.6g(即，減半的B5完全培養(yǎng)基粉末)，IL無(wú)菌水，和蔗糖130g，PH6.0，過(guò)濾滅菌。④再生培養(yǎng)基，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末3. 21g， IL無(wú)菌水，蔗糖25g，瓊脂粉2. 5g，植物凝膠4. 5g，1. 5ml細(xì)胞分裂素(lmg/ml)，ρΗ6· 0，高溫高壓滅菌。⑤生根培養(yǎng)基，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末3. 21g， IL無(wú)菌水，蔗糖25g，瓊脂粉2. 5g，植物凝膠4. 5g，pH6. 0,高溫高壓滅菌。Austratec 公司的 NLN 培養(yǎng)基粉末 1. 92g、Austratec 公司的 Gamborg，B5 完全培養(yǎng)基粉末3. 21g、減半的B5完全培養(yǎng)基粉末的組成同實(shí)施例1。(2)六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)1)供體植株花蕾的選擇取六倍體油菜生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害的初花期的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體；取花蕾長(zhǎng)度為3mm、單核晚期至雙核早期的花蕾90個(gè)；(2)花蕾的滅菌用次氯酸鈉80ml/L+無(wú)水乙醇100ml/L+洗潔精8滴+無(wú)菌水配制成的體積百分濃度為8. 0%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把花蕾放入小瓶中，加入50ml次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒15分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水蕩洗4次后，備用；(3)在超凈工作臺(tái)上將滅菌后的花蕾一并置于無(wú)菌燒杯中，加入少量1/2B5-13培養(yǎng)基，用滅過(guò)菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮1/2B5-13培養(yǎng)基至30ml ；該懸浮液用44 μ m無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾到50ml離心管中，蓋緊，1000rpm/min離心％iin，離心后倒掉上清液，往沉淀中再加入30ml的1/2B5-13培養(yǎng)基，按上述方法再離心1次，棄上清液；往沉淀中加入NLN-13液體培養(yǎng)基30ml，取1. 5ul溶液用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在5X顯微鏡下計(jì)算小孢子細(xì)胞密度為10X IO5個(gè)細(xì)胞/mL。所需的密度為5 X IO5個(gè)細(xì)胞/mL，因此再補(bǔ)加30mL的NLN-13液體培養(yǎng)基，分裝到6個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中，每皿IOmL小孢子懸浮液，每皿中依次加入 40ul秋水仙堿溶液(質(zhì)量百分濃度為0. 6% )及IOOul高壓滅菌后的活性炭混合液(1L活性炭混合液的組成為NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖3g和8g活性炭)。(4)將裝有該小孢子混合懸浮液的培養(yǎng)皿，加蓋后用parafilm 封口膜(美國(guó) parafilm公司)封口，錫紙包裹后置于30°C恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理2天； 再置于25°C恒溫培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)10天；至肉眼可見(jiàn)胚狀體時(shí)，置于25°C培養(yǎng)搖床上搖動(dòng)培養(yǎng)8天后，得到子葉期胚狀體，放入5°C冰箱中冷藏保存；(5)將子葉期胚狀體接種至再生培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、25°C條件下培養(yǎng) 20天，直接形成再生幼芽；(6)切取生長(zhǎng)健康的再生幼芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、25°C條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)；觀天后將根生長(zhǎng)健壯的苗用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，減去較長(zhǎng)的根，以便于移栽。隨后植于裝好滅菌土的穴盤(pán)中，塑料膜罩住保濕6天，在溫室中培養(yǎng)18 天后移栽到大的盆缽中，得到再生植株。(7)取再生植株的嫩葉，用美國(guó)BD公司的BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，采用與實(shí)施例1相同的方法檢測(cè)各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。結(jié)果六倍體油菜出胚率為65個(gè)/蕾。實(shí)施例3 (1)培養(yǎng)基配制①NLN液體培養(yǎng)基，同實(shí)施例1。②NLN-13液體培養(yǎng)基，組成為NLN液體培養(yǎng)基IL和蔗糖130g，pH5. 6，過(guò)濾滅菌。③1/2B5-13液體培養(yǎng)基，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末1.6g(即，減半的B5完全培養(yǎng)基粉末)，IL無(wú)菌水，和蔗糖130g，PH5.6，過(guò)濾滅菌。④再生培養(yǎng)基，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末3. 21g， IL無(wú)菌水，蔗糖30g，瓊脂粉3. 5g，植物凝膠3. 5g，1. 5ml細(xì)胞分裂素(lmg/ml)，ρΗ5· 6，高溫高壓滅菌。⑤生根培養(yǎng)基，組成為Austratec 公司的Gamborg，B5完全培養(yǎng)基粉末3. 21g， IL無(wú)菌水，蔗糖30g，瓊脂粉3. 5g，植物凝膠3. 5g，pH5. 6，高溫高壓滅菌。Austratec 公司的 NLN 培養(yǎng)基粉末 1. 92g、Austratec 公司的 Gamborg，B5 完全培養(yǎng)基粉末3. 21g、減半的B5完全培養(yǎng)基粉末的組成同實(shí)施例1。(2)六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)1)供體植株花蕾的選擇取六倍體油菜生長(zhǎng)健康、無(wú)病蟲(chóng)害的初花期的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體；取花蕾長(zhǎng)度為4mm、單核晚期至雙核早期的花蕾100個(gè)；(2)花蕾的滅菌用次氯酸鈉100ml/L+無(wú)水乙醇100ml/L+洗潔精9滴+無(wú)菌水配制成的體積百分濃度為10%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把花蕾放入小瓶中，加入50ml次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動(dòng)進(jìn)行表面消毒30分鐘，再在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水蕩洗5次后，備用；(3)在超凈工作臺(tái)上將滅菌后的花蕾一并置于無(wú)菌燒杯中，加入少量1/2B5-13培養(yǎng)基，用滅過(guò)菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮1/2B5-13培養(yǎng)基至30ml ；該懸浮液用44 μ m無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾到50ml離心管中，蓋緊，1200rpm/min離心5min，離心后倒掉上清液，往沉淀中再加入30ml的1/2B5-13培養(yǎng)基，按上述方法再離心1次，棄上清液；往沉淀中加入NLN-13液體培養(yǎng)基30ml，取1. 5ul溶液用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在5X顯微鏡下計(jì)算小孢子細(xì)胞密度為8X IO5個(gè)細(xì)胞/mL。所需的密度為4X IO5個(gè)細(xì)胞/mL，因此再補(bǔ)加30mL的 NLN-13液體培養(yǎng)基，分裝到6個(gè)滅菌的培養(yǎng)皿中，每皿IOmL小孢子懸浮液，每皿中依次加入 40ul秋水仙堿溶液(質(zhì)量百分濃度為0. 8% )及IOOul高壓滅菌后的活性炭混合液(1L活性炭混合液的組成為NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖3g和12g活性炭)。(4)將裝有該小孢子混合懸浮液的培養(yǎng)皿，加蓋后用parafilm 封口膜(美國(guó) parafilm公司)封口，錫紙包裹后置于33°C恒溫生化培養(yǎng)箱里、黑暗條件下熱激處理1天； 再置于25°C恒溫培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)15天；至肉眼可見(jiàn)胚狀體時(shí)，置于25°C培養(yǎng)搖床上搖動(dòng)培養(yǎng)10天后，得到子葉期胚狀體，放入6°C冰箱中冷藏保存；(5)將子葉期胚狀體接種至再生培養(yǎng)基中，在每天16小時(shí)光照、25°C條件下培養(yǎng)觀天，直接形成再生幼芽；(6)切取生長(zhǎng)健康的再生幼芽接種至生根培養(yǎng)基上，在每天16小時(shí)光照、25°C條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)；30天后將根生長(zhǎng)健壯的苗用蒸餾水洗凈組培苗根部培養(yǎng)基，減去較長(zhǎng)的根，以便于移栽。隨后植于裝好滅菌土的穴盤(pán)中，塑料膜罩住保濕7天，在溫室中培養(yǎng)20 天后移栽到大的盆缽中，得到再生植株。(7)取再生植株的嫩葉，用美國(guó)BD公司的BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性分析，采用與實(shí)施例1相同的方法檢測(cè)各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。結(jié)果多倍體油菜出胚率為78個(gè)/蕾。
權(quán)利要求
1.一種人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取人工雜交六倍體油菜的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體；(2)將滅菌后的六倍體油菜花蕾加入到1/2B5-13培養(yǎng)基中研磨成懸浮液，過(guò)濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液得到沉淀；在所述沉淀中加入NLN-13液體培養(yǎng)基，將小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3X IO5 5X IO5個(gè)細(xì)胞/mL后，再依次加入秋水仙堿溶液和活性炭混合液，得到六倍體油菜小孢子培養(yǎng)的混合懸浮液；(3)將所述六倍體油菜小孢子培養(yǎng)的混合懸浮液在黑暗條件下于30°C 33°C恒溫?zé)峒ぬ幚? 3天后，在黑暗條件下于20°C 培養(yǎng)10天 15天，直至肉眼可見(jiàn)時(shí)，在黑暗條件下于20°C 再震蕩培養(yǎng)5天 10天，得到子葉期胚狀體；(4)將所述子葉期胚狀體接種到含有細(xì)胞分裂素的再生培養(yǎng)基中，在每天12小時(shí) 18 小時(shí)光照和20°C 下培養(yǎng)，形成再生芽；(5)切取再生芽接種至不含激素的生根培養(yǎng)基中，在每天12小時(shí) 18小時(shí)光照和 20°C 條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，將根生長(zhǎng)健壯的苗煉苗后移栽到土壤里，得到再生植株， 鑒定倍性。
2.如權(quán)利要求1所述的人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述 1/2B5-13 液體培養(yǎng)基，以 IL 計(jì)，組成為=NaH2PO4. H2O 75mg，CaCl256. 62mg，KI 0. 375mg, KNO3 1250mg, (NH4)2SO4 67mg, MgSO4 · 7H2062. 5mg, H3BO3 1. 5mg, MnSO4 · H2O 5mg, ZnSO4 · 7H20 lmg, Na2MoO4 · 2H200. 125mg, CuSO4 · 5H20 0. 0125mg, CoCl2 · 6H20 0. 0125mg, 5mg 維生素 Bi，0. 5mg 維生素 B6，Na2EDTA 18. 65mg,FeSO4 ·7Η20 13. 9mg，肌醇 50mg，煙酸 0. 5mg, 蔗糖130g, IL無(wú)菌水，PH5. 6 6. 2 ；所述NLN-13液體培養(yǎng)基，以IL計(jì)，組成為NLN液體培養(yǎng)基IL和蔗糖130g，PH 5. 6 6. 2 ；所述秋水仙堿溶液的質(zhì)量百分濃度為0. 3% 0. 8% ；所述活性炭混合液，以IL計(jì)，組成為NLN液體培養(yǎng)基1L、瓊脂糖2 5g和8 15g活性炭；所述 NLN 液體培養(yǎng)基，以 IL 計(jì)，組成為=KNO3 l25mg，Ca (NO3)2 .4H2O5OOmgJgSO4 61mg， KH2PO4 125mg, H3BO3 6. 2mg, MnSO4 · H2O 18. 95mg, ZnSO4 · 7H20 IOmg, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg，0. 5mg 維生素 B1，0. 5mg 維生素 B6，生物素 0. 05mg,葉酸 0. 5mg, NaFeEDTA 36. 70mg,肌醇 IOOmg,甘氨酸 2mg,煙酸 5mg, L-谷氨酰胺 800mg,谷胱甘肽30mg，絲氨酸lOOmg，IL無(wú)菌水；所述再生培養(yǎng)基，以 IL 計(jì)，組成為=NaH2PO4. H2O 150mg, CaCl2113. 24mg, KI 0. 75mg， KNO3 2500mg, (NH4)2SO4 134mg，MgSO4 .7H20125mg，H3BO3 3. OmgjMnSO4 'H2O 1 Omg，ZnSO4 ·7Η20 2mg, Na2MoO4 · 2H200. 25mg, CuSO4 · 5H20 0. 025mg, CoCl2 · 6H20 0. 025mg, IOmg 維生素 Bi, lmg 維生素 B6, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H20 27. 8mg，肌醇 lOOmg，煙酸 lmg, IL 無(wú)菌水，蔗糖20 30g，瓊脂粉2 4g，植物凝膠3 5g，1 3ml濃度為0. 5 1. 5mg/ml的細(xì)胞分裂素以及PH5. 6 6. 2 ；所述生根培養(yǎng)基，以 IL 計(jì)，組成為=NaH2PO4. H2O 150mg, CaCl2113. 24mg, KI 0. 75mg，KNO3 2500mg, (NH4)2SO4 134mg，MgSO4 .7H20125mg，H3BO3 3. Omg，MnSO4 ·Η20 1 Omg，ZnSO4 ·7Η20 2mg, Na2MoO4 · 2Η200. 25mg, CuSO4 · 5Η20 0. 025mg, CoCl2 · 6Η20 0. 025mg, IOmg 維生素 Bi, Img 維生素 B6, Na2EDTA 37. 3mg, FeSO4 · 7H20 27. 8mg，肌醇 lOOmg，煙酸 lmg，IL 無(wú)菌水，蔗糖20 30g，瓊脂粉2 4g，植物凝膠3 5g，以及PH5. 6 6. 2。
3.如權(quán)利要求1或2所述的人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述花蕾的長(zhǎng)度為2 4mm，花粉母細(xì)胞處于單核晚期至雙核早期，花蕾的數(shù)目為 80 100個(gè)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟( 為將滅菌后的六倍體油菜花蕾加入到1/2B5-13培養(yǎng)基中研磨成懸浮液，過(guò)濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液得到沉淀后；在沉淀中再次加入1/2B5-13培養(yǎng)基研磨成懸浮液，過(guò)濾所得濾液經(jīng)離心、棄上清液，再次得到沉淀；再在所述沉淀中先加入NLN-13 液體培養(yǎng)基，在顯微鏡下利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算小孢子細(xì)胞濃度，并用一定量的NLN-13液體培養(yǎng)基小孢子細(xì)胞濃度調(diào)至3X IO5 5X IO5個(gè)細(xì)胞/mL，再依次加入秋水仙堿溶液和活性炭混合液，得到六倍體油菜小孢子培養(yǎng)的混合懸浮液。
5.如權(quán)利要求1或2所述的人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟O)中，所述的過(guò)濾采用44 μ m無(wú)菌濾網(wǎng)。
6.如權(quán)利要求1或2所述的人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟O)中，所述的離心的條件為900 1200rpm/min離心3 5min。
7.如權(quán)利要求1或2所述的人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中，在黑暗條件下培養(yǎng)溫度為25士2°C。
8.如權(quán)利要求1或2所述的人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)中所述子葉期胚狀體在;TC 8°C保存。
9.如權(quán)利要求1或2所述的人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟中，培養(yǎng)條件為每天16小時(shí)光照和25°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為20 30天。
10.如權(quán)利要求1或2所述的人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(5)中，培養(yǎng)條件為每天16小時(shí)光照和25°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為25 30天。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人工雜交六倍體油菜小孢子再生植株的培養(yǎng)方法，包括取人工雜交六倍體油菜的花序作為小孢子培養(yǎng)的供體；將滅菌后的六倍體油菜花蕾加入到1/2B5-13培養(yǎng)基中研磨成懸浮液，過(guò)濾、離心得到沉淀；先后加入NLN-13液體培養(yǎng)基、秋水仙堿和活性炭的混合液，得到小孢子混合懸浮液；黑暗條件下熱激處理后培養(yǎng)，得到子葉期胚狀體；接種到再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)直接形成再生芽；切取再生芽接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，移栽得到再生植株，鑒定倍性。本發(fā)明首次公開(kāi)了人工雜交六倍體油菜小孢子培養(yǎng)的方法，首次培育出六倍體油菜小孢子來(lái)源的雙單倍體群體，為后續(xù)建立ABC基因組的連鎖遺傳圖提供便利。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102362579SQ201110355698
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者周偉軍, 王兵, 耿鑫鑫, 許玲 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)