專利名稱：提高小麥耐鹽性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高小麥耐鹽性的方法，屬于小麥育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
環(huán)境脅迫嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量，而鹽脅迫的影響尤其嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計，耕地面積的 20%和灌溉耕地的50%受到不同程度的鹽漬化影響，而且受影響的面積逐年擴大。鹽漬化在干旱和半干地區(qū)的影響更大，每年約有10萬公頃的耕地因鹽漬化而被荒廢。如果鹽漬化土壤可以被利用，估計可以增加約130萬公頃的可用耕地。因此開展植物的抗鹽性研究和開展植物抗鹽育種具有重要的意義。小麥?zhǔn)俏覈褪澜缱钪匾募Z食作物之一，是人類生存的主要食物來源。普通小麥?zhǔn)遣贿m宜在鹽堿地種植的，通過轉(zhuǎn)基因的方法培育耐鹽的小麥品種種植于鹽堿地，可極大的提高我國和世界的小麥產(chǎn)量，為世界的糧食安全做出貢獻。 同時通過在鹽堿地種植耐鹽堿的小麥可極大地改善鹽堿地的生態(tài)環(huán)境。通過傳統(tǒng)育種的方法來提高作物的耐鹽性能夠獲得的效果是非常有限的，這主要由于植物的耐鹽性在分子及生理水平上都是由復(fù)雜的機制來調(diào)控的。在分子水平上，植物的耐鹽性通常具有多基因性狀的特點，而在生理水平上，鹽土植物和具低耐鹽性的植物也顯示出很大范圍的適應(yīng)性，這給傳統(tǒng)育種工作帶來很大的困難。基因工程技術(shù)通過改變一個或幾個基因的活性來提高植物的耐鹽性，它是在基因水平上提高植物耐鹽性，更具有精確性和穩(wěn)定性，提高了育種的高效性，極大地加快了育種速度，對于我們了解耐鹽植物復(fù)雜的性狀以及耐鹽機制也是非常必要的。水是維系植物生長發(fā)育的重要成分，占活細(xì)胞鮮重的80%以上。以往普遍認(rèn)為水分是通過簡單的擴散方式自由進入植物細(xì)胞，但水通道蛋白(aquaporin)的發(fā)現(xiàn)證明水分是通過這種專一性的通道進入細(xì)胞內(nèi)的。Maurel和Chrispeels等人認(rèn)為水通道蛋白的發(fā)現(xiàn)是一個革命性的發(fā)現(xiàn)。高等植物水通道蛋白在干旱、鹽、低溫和營養(yǎng)虧缺等脅迫條件下的水分吸收過程中的作用尤其重要。有學(xué)者認(rèn)為，植物中一些水通道基因的表達是保守的，而另外一些則響應(yīng)環(huán)境因子(如干旱和高鹽)的變化而進行表達(Johansson et al.，2000)。水通道對脅迫的響應(yīng)一般可分成兩個方面一是脅迫啟動現(xiàn)存水通道基因的表達，提高表達速度， 使水通道的數(shù)量迅速增加；二是脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生新的水通道基因，從而表達新的水通道 (Yamaguchi^Shinozaki et al.，1992 ；Fray et al.，1994)。Yamada 等(1995)發(fā)現(xiàn)，冰草在面臨高鹽脅迫時水通道MipA、MipB和MipC的表達發(fā)生了變化，從而使植物在脅迫開始后的 2天內(nèi)，細(xì)胞膨壓恢復(fù)到脅迫前的水平。雖然迄今為止已從幾十種植物中發(fā)現(xiàn)了水通道蛋白，但鹽生植物的細(xì)胞質(zhì)膜水通道蛋白基因的報道也較少，目前只從中等耐鹽的鹽生植物冰花克隆了水通道蛋白基因，與已報道的這些植物相比，鹽生植物海蓬子具有更強耐鹽性，其最適生長環(huán)境要求200mMNaCl 高鹽濃度，不僅可以在0 SOOmM鹽濃度下生長也可以進行全海水灌溉培養(yǎng)。發(fā)明人通過抑制消減雜交的方法，克隆獲得了一個海蓬子的水通道蛋白基因(SbPIPl)，構(gòu)建了適宜于小麥基因槍轉(zhuǎn)化的單子葉植物高效表達載體pAHC25-SbPIPl，采用基因工程的方法將海蓬子的SbPIPl基因?qū)肫胀ㄐ←湥岣咝←湹哪望}性，目前未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前小麥耐鹽種質(zhì)資源貧乏狀況，提供一種采用轉(zhuǎn)基因方法將可提高植物耐鹽性的鹽生植物海蓬子的水通道蛋白基因SbPIPl基因?qū)肫胀ㄐ←溒贩N，從而提高小麥的耐鹽性。本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的1. 一種提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于以下步驟a)構(gòu)建一個海蓬子的水通道蛋白基因釙PIPl的表達載體pAHC25_SbPIPl ；b)通過基因槍法將海蓬子的SbPIPl基因的表達載體pAHC25_SbPIPl導(dǎo)入受體小麥幼胚細(xì)胞；對所述的小麥幼胚細(xì)胞進行愈傷組織誘導(dǎo)、植株再生，獲得轉(zhuǎn)基因待選植株；C)對轉(zhuǎn)基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株；d)陽性轉(zhuǎn)基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T4代轉(zhuǎn)基因純合株系；e)對T4代轉(zhuǎn)基因純合株系后代進行耐鹽性篩選，獲得耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。在本發(fā)明中所述的海蓬子水通道蛋白基因SbPIPl表達載體pAHC25_SbPIPl通過以下步驟獲得A、制備質(zhì)粒 PUC18-PSN 設(shè)計上游引物SEQ No. 5和下游引物SEQ No. 6，以含Nos3，序列的質(zhì)粒 pCAMBIA-2301序列SEQ No. 4為模板，以引物SEQ No. 5和SEQ No. 6對模板進行擴增，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進行純化回收，以PUC18為基礎(chǔ)質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶HindIII 和I^stI對Nos3’片段和PUC18分別進行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-N ；設(shè)計上游引物SEQ No. 7和下游引物SEQ No. 8，以含有釙PIPl基因編碼序列的海蓬子葉片cDNA文庫為模板，以引物SEQ No. 7和SEQ No. 8擴增所述cDNA文庫模板，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進行純化回收，以PUC18-N為載體，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和I^stI 對SbPIPl基因編碼序列和PUC18-N載體分別進行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4 DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-SN ；設(shè)計上游引物SEQ No. 9和下游引物SEQ No. 10，以含有Ubiquitin基因啟動子的玉米基因組為模板，以引物SEQ No.9和SEQ No. 10擴增所述玉米基因組模板，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進行純化回收，以PUC18-SN為載體，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI對 Ubiquitin和PUC18-SN分別進行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用 T4DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-PSN ；B、制備 pAHC254bPIPl 表達載體采用限制性內(nèi)切酶HindIII對PUC18-PSN質(zhì)粒DNA進行完全酶切，切下 Ubiquitin+SbPIPl+NosS'嵌合基因片段，采用0. 8 %的瓊脂糖電泳，對3. Okb左右的酶切片段進行回收；采用限制性內(nèi)切酶HindIII對pAHC25質(zhì)粒DNA進行完全酶切，切除原有表達盒，采用0. 8 %的瓊脂糖電泳，對5. 5kb左右的酶切片段進行回收；用T4DNA連接酶對兩個回收片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得海蓬子水通道蛋白基因SbPIPl的表達載體，該質(zhì)粒命名為 pAHC25-SbPIPl。在本發(fā)明中對轉(zhuǎn)基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株是指設(shè)計上游引物SEQ No. 11和下游引物SEQ No. 12，通過SEQ No. 11和SEQ No. 12對待選植株進行 PCR篩選，電泳檢測，能擴增出大小為581bp的擴增片段的植株確定為陽性轉(zhuǎn)基因植株。在本發(fā)明中對T4代轉(zhuǎn)基因純合株系后代進行耐鹽性篩選是指在小麥的發(fā)芽期對被測后代采用在鹽脅迫的條件下進行發(fā)芽試驗，計算相對鹽害指數(shù)，根據(jù)鹽害指數(shù)判斷轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性；鹽害指數(shù)=[(對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率]X 100% ；其中，對照發(fā)芽率是未導(dǎo)入pAHC25_SbPIPl的親本在清水下的發(fā)芽率；處理發(fā)芽率是指T4代轉(zhuǎn)基因純合株系后代在含1. 0% NaCl溶液脅迫條件下的發(fā)芽率；耐鹽性的分級標(biāo)準(zhǔn)由強至弱依次為1、2、3、4、5級，1級的鹽害指數(shù)為0-20.0%， 2級的鹽害指數(shù)為20. -40.0%，3級的鹽害指數(shù)為40. 1_60. 0 %，4級的鹽害指數(shù)為 60. 1% -80.0%，5級的鹽害指數(shù)為80. 1% -100.0%，其中1級為耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的優(yōu)點在于與常規(guī)的種質(zhì)培育方法相比，選取的目的基因來自鹽生植物， 該水通道蛋白基因?qū)?xì)胞水分進出的調(diào)控能力更強，對提高小麥的耐鹽性針對性更強；由轉(zhuǎn)化植株到純合的轉(zhuǎn)基因株系時間短并且對受體親本的重要農(nóng)藝性狀影響小，培育的周期短、減少對重要農(nóng)藝性狀選育所需的人工經(jīng)驗的依賴性。


圖1海蓬子SbPIPl基因的表達載體的示意圖。圖2PUC18的示意圖。圖3pAHC25的示意圖。圖4表達載體pAHC25_SbPIPl的構(gòu)建過程示意圖。圖5 ；代部分轉(zhuǎn)基因待選植株SbPIPl基因的PCR檢測的電泳圖，其中1-7泳道為轉(zhuǎn)基因待選植株；8泳道為未轉(zhuǎn)基因?qū)廂?3親本對照；9泳道為陽性質(zhì)粒對照；10泳道為DL2000 Maeker分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖6 T4代部分轉(zhuǎn)基因植株SbPIPl基因的PCR檢測的電泳圖，其中1-7泳道為T4代轉(zhuǎn)SbPIPl基因的植株；8泳道為未轉(zhuǎn)基因?qū)廂?3親本對照；9泳道為陽性質(zhì)粒對照；10泳道為DL2000 Maeker分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施例方式本案涉及的全部引物均委托生工生物工程(上海)有限公司合成。實施例1表達載體的構(gòu)建所述的海蓬子水通道蛋白基因SbPIPl表達載體pAHC25_SbPIPl通過以下步驟獲得A、制備質(zhì)粒 PUC18-PSN :A、構(gòu)建質(zhì)粒 PUC18-PCN設(shè)計上游引物SEQ No. 5 5，-GCCCTGCAGCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3，(含 PstI 酶切位點)下游引物SEQ No. 65，-GCCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3‘(含 HindIII 酶切位點)以含有 Nos3，序列的 pCAMBIA-2301 (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/ GenBank :AF234316) SEQ No. 4為模板，以引物引物SEQ No. 5和引物SEQ No. 6擴增模板，其中所述的Nos3，序列SEQ No. 1 為已知核酸序列(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/ ；GenBank :AF485783. 1)，1 % 的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進行純化回收，以PUC18為基礎(chǔ)質(zhì)粒(http://www, ncbi. nlm. nih. gov/ ；GenBank :A02710)(圖 2)，采用限制性內(nèi)切酶 HindIII 和 PstI 對 Nos3，片段和 PUC18 分別進行完全雙酶切，的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4DNA連接酶16°C連接過夜(20ul反應(yīng)體系含1XT4DNA連接酶緩沖液，PUC18片段0. 3pmol，Nos3，片段0. 03pmol, 350uT4DNA連接酶)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，P55-56頁，科學(xué)出版社，1992)，轉(zhuǎn)化后得大腸桿菌DH5 α細(xì)胞懸液涂布含 100mg/L氨芐青霉素的平板，對抗氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質(zhì)粒，采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-N。設(shè)計上游引物SEQ No. 75，-GCCGGATCCATGGAAGGAAAGGAGGAAGATGTA-3'(含 BamHI 酶切位點)下游引物SEQ No. 85，-GCCCTGCAGTCACTTGGATTTAAATGGGATTGC-3’ (含 PstI 酶切位點)海蓬子(Salicornia bigelovii Torr.)來自于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所試驗場，取其成株頂端幼嫩葉片提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建一個cDNA文庫，以含有SbPIPl 基因編碼序列SEQ No. 2的海蓬子葉片cDNA文庫為模板，以引物SEQ No. 7和SEQ No. 8擴增SbPIPl基因編碼序列SEQ No. 2，所述的SPIPl基因為已知核酸序列(http://www, ncbi. nlm. nih. rov/ ；GenBank :DQ451602. 1) ；1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進行純化回收，以 PUC18-N為載體，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和I^stI對SbPIPl基因編碼序列和PUC18-N載體分別進行完全雙酶切，的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4DNA連接酶酶16°C 連接過夜(20ul反應(yīng)體系含1XT4DNA連接酶緩沖液，PUC18-N片段0. 3pmol, SbPIPl片段 0. 03pmol，350uT4DNA連接酶)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-SN ；設(shè)計上游引物SEQ No. 95 ‘-GCCGAATTCAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGT-3，(含 EcoRI 和 HindIII 酶切位占)下游引物SEQ No. 105，-GCCGGATCC AAGTAACACCAAACAACA-3，(含 BamHI 酶切位點)Ubiquitin 基因啟動子為已知核酸序列(http //www, ncbi. nlm. nih. rov/ ； GenBank :S94464. 1)，Seq No. 3，以含有Ubiquitin基因啟動子的玉米基因組為模板，以以引物SEQ No. 9引物和引物SEQ No. 10擴增得W^iquitin全長序列的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進行純化回收，以PUC18-SN為載體，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI對 WDiquitin和PUC18-SN分別進行完全雙酶切，的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用 T4DNA連接酶16°C連接過夜(20ul反應(yīng)體系含1 XT4DNA連接酶緩沖液，PUC18-SN片段 0. 3pmol, Ubiquitin片段0. 3pmol，350uT4DNA連接酶)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-PSN。B、制備 pAHC254bPIPl 表達載體采用限制性內(nèi)切酶HindIII對PUC18-PSN質(zhì)粒DNA進行完全酶切，切下 Ubiquitin+SbPIPl+NosS'嵌合基因片段，采用0. 8 %的瓊脂糖電泳，對3. Okb左右的酶切片段進行回收；采用限制性內(nèi)切酶HindIII對pAHC25質(zhì)粒(圖3)DNA進行完全酶切，切除原有表達盒，采用0. 8%的瓊脂糖電泳，對5. 5kb左右的酶切片段進行回收；用T4DNA連接酶對兩個回收片段16°C連接過夜(20ul反應(yīng)體系含1XT4DNA連接酶緩沖液，pAHC25片段 0. 3pmol，Ubiquitin+SbPIPl+Nos3，嵌合基因片段 0. 03pmol，!350uT4DNA 連接酶)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后得大腸桿菌DH5 α細(xì)胞懸液涂布含100mg/L氨芐青霉素的平板，對抗氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質(zhì)粒，采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為pAHC25-SbPIPl，即為海蓬子水通道蛋白基因SbPIPl 的表達載體(圖1)。本實施例的整個構(gòu)建過程參見圖4。實施例2表達載體的轉(zhuǎn)化采用基因槍轉(zhuǎn)基因方法將構(gòu)建的表達載體導(dǎo)入受體小麥寧麥13的幼胚細(xì)胞，通過愈傷組織誘導(dǎo)、植株再生，獲得轉(zhuǎn)基因待選植株(參照周淼平等，小麥基因槍法轉(zhuǎn)化技術(shù)的改進，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999，15(1) :62-64)；所述的受體小麥?zhǔn)侵噶扼w常規(guī)小麥，所述的幼胚是指開花后12-14天的幼胚。對上述轉(zhuǎn)基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株，陽性轉(zhuǎn)基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T4代轉(zhuǎn)基因純合株系；所述的分子檢測為PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))分析方法，PCR分析是指根據(jù)目的基因的序列設(shè)計特異引物，提取待選轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以此為模板對目的基因進行PCR 擴增，能擴增出相應(yīng)基因片段的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)SbPIPl基因的序列設(shè)計的特異引物為正向引物SEQ No. 11 5， -ATGGAAGGAAAGGAGGAAGATGT-3，；反向引物SEQ No. 12 5， -GCAGAGAAGACGGTGTAGACGAG-3，；PCR擴增條件為:94°C 5分鐘；94°C 1分鐘，55°C 1分鐘，72°C 1分鐘20秒，進行35 個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。擴增片段大小為581bp，PCR產(chǎn)物進行1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳。Ttl代部分轉(zhuǎn)基因待選植株的PCR檢測電泳圖見附圖5 ；其中1-7泳道為轉(zhuǎn)基因待選植株，其中6泳道和7泳道為轉(zhuǎn)SbPIP基因的陽性植株；8泳道為未轉(zhuǎn)基因?qū)廂?3對照； 9為陽性質(zhì)粒對照；10為DL2000 Maeker分子量標(biāo)準(zhǔn)
T4代部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測電泳圖見附圖6。其中1-7泳道為T4代轉(zhuǎn)SbPIPl 基因的植株，全部為陽性植株；8泳道為未轉(zhuǎn)基因?qū)廂?3對照；9泳道為陽性質(zhì)粒對照；10 泳道為DL2000 Maeker分子量標(biāo)準(zhǔn)。實施例3耐鹽性篩選在小麥的發(fā)芽期對被測后代(實施例2為獲得的寧麥13轉(zhuǎn)基因小麥)采用在鹽脅迫的條件下進行發(fā)芽試驗，計算相對鹽害指數(shù)，根據(jù)鹽害指數(shù)判斷轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。 具體的操作是選取均勻一致的轉(zhuǎn)基因植株的種子，分別置于含1.0% NaCl溶液的培養(yǎng)皿中，并以蒸餾水處理作為對照，于20°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，調(diào)查發(fā)芽率(以芽長超過種子長度的一半為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))計算相對鹽害指數(shù)，根據(jù)鹽害指數(shù)對耐鹽性評級。鹽害指數(shù)按下列公式計算鹽害指數(shù)(％)=[(對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率]X 100%其中，對照發(fā)芽率是未導(dǎo)入pAHC25_SbPIPl的親本在清水下的發(fā)芽率；處理發(fā)芽率是指T4代轉(zhuǎn)基因純合株系后代在含1. 0% NaCl溶液脅迫條件下的發(fā)芽率。本發(fā)明中的耐鹽性的分級標(biāo)準(zhǔn)是1級鹽害指數(shù)為0-20. 0%,；2 級鹽害指數(shù)為 20. 1 % -40. 0 %3 級鹽害指數(shù)為 40. 1-60. 0%,；4 級鹽害指數(shù)為 60. 1% -80.0%,；5 級鹽害指數(shù)為 80. 1% -100. 0%,；在分級標(biāo)準(zhǔn)中，1級是耐鹽性最強的，隨級數(shù)的增加，小麥的耐鹽性逐漸減弱，鹽敏感性逐漸增強。耐鹽性鑒定結(jié)果見表1，在表 1 中 SPIP1-1，SPIP1-2，SPIP1-3，SPIP1-4，SPIP1-5， SPIP1-6，SPIP1_7為導(dǎo)入SbPIPl基因的7個1\代純合株系。受體對照親本寧麥13的鹽害指數(shù)為43. 33%，屬于不耐鹽類型，7個導(dǎo)入SbPIPl基因的T4代純合株系的鹽害指數(shù)均為 0，都屬于耐鹽類型，表明由于SbPIPl基因的導(dǎo)入，使轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性得到提高。表1寧麥13轉(zhuǎn)SbPIPl基因T4代純合株系的耐鹽性鑒定結(jié)果
轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性評級鹽害指數(shù)耐鹽性評價
權(quán)利要求
1.一種提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于以下步驟a)構(gòu)建一個海蓬子的水通道蛋白基因SbPIPl的表達載體pAHC25-SbPIPl；b)通過基因槍法將海蓬子的SbPIPl基因的表達載體pAHC25-SbPIPl導(dǎo)入受體小麥幼胚細(xì)胞；對所述的小麥幼胚細(xì)胞進行愈傷組織誘導(dǎo)、植株再生，獲得轉(zhuǎn)基因待選植株；c)對轉(zhuǎn)基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株；d)陽性轉(zhuǎn)基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T4代轉(zhuǎn)基因純合株系；e)對T4代轉(zhuǎn)基因純合株系后代進行耐鹽性篩選，獲得耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于所述的海蓬子水通道蛋白基因^PIPl表達載體pAHC251bPIPl通過以下步驟獲得A、制備質(zhì)粒PUC18-PSN設(shè)計上游引物SEQ No. 5和下游引物SEQ No. 6，以含Nos3，序列的質(zhì)粒pCAMBIA-2301 序列SEQ No. 4為模板，以引物SEQ No. 5和SEQ No. 6擴增所述的模板，1 %的瓊脂糖電泳，對 PCR產(chǎn)物進行純化回收，以PUC18為基礎(chǔ)質(zhì)粒，采用限制性內(nèi)切酶HindIII和I^stI對Nos3’ 片段和PUC18分別進行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-N ；設(shè)計上游引物SEQ No. 7和下游引物SEQ No. 8，以含有SbPIPl基因編碼序列的海蓬子葉片cDNA文庫為模板，以引物SEQ No. 7和SEQ No. 8擴增所述cDNA文庫模板，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進行純化回收，以PUC18-N為載體，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和I^stI對 SbPIPl基因編碼序列和PUC18-N載體分別進行完全雙酶切，的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用T4 DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-SN ；設(shè)計上游引物SEQ No. 9和下游引物SEQ No. 10，以含有W^iquitin基因啟動子的玉米基因組為模板，以引物SEQ No. 9和SEQ No. 10擴增所述玉米基因組模板，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進行純化回收，以PUC18-SN為載體，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI對 Ubiquitin和PUC18-SN分別進行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進行回收，用 T4 DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-PSN ；B、制備pAHC254bPIPl表達載體采用限制性內(nèi)切酶HindIII對PUC18-PSN質(zhì)粒DNA進行完全酶切，切下 Ubiquitin+SbPIPl+NosS'嵌合基因片段，采用0. 8 %的瓊脂糖電泳，對3. Okb左右的酶切片段進行回收；采用限制性內(nèi)切酶HindIII對pAHC25質(zhì)粒DNA進行完全酶切，切除原有表達盒，采用0. 8 %的瓊脂糖電泳，對5. 5kb左右的酶切片段進行回收；用T4DNA連接酶對兩個回收片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得海蓬子水通道蛋白基因SbPIPl的表達載體，該質(zhì)粒命名為 pAHC25-SbPIPl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于對轉(zhuǎn)基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株是指設(shè)計上游引物SEQ No. 11和下游引物SEQ No. 12，通過SEQ No. 11和SEQ No. 12對待選植株進行PCR篩選，電泳檢測，能擴增出大小為581bp的擴增片段的植株確定為陽性轉(zhuǎn)基因植株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于對T4代轉(zhuǎn)基因純合株系后代進行耐鹽性篩選是指在小麥的發(fā)芽期對被測后代采用在鹽脅迫的條件下進行發(fā)芽試驗，計算相對鹽害指數(shù)，根據(jù)鹽害指數(shù)判斷轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性； 鹽害指數(shù)=[(對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率)/對照發(fā)芽率]X 100% ； 其中，對照發(fā)芽率是未導(dǎo)入pAHC25-SbPIPl的親本在清水下的發(fā)芽率；處理發(fā)芽率是指T4代轉(zhuǎn)基因純合株系后代在含1. 0% NaCl溶液脅迫條件下的發(fā)芽率；耐鹽性的分級標(biāo)準(zhǔn)由強至弱依次為1、2、3、4、5級，1級的鹽害指數(shù)為0-20.0%， 2級的鹽害指數(shù)為20. -40.0%，3級的鹽害指數(shù)為40. 1_60. 0 %，4級的鹽害指數(shù)為 60. 1% -80.0%，5級的鹽害指數(shù)為80. 1% -100.0%，其中1級為耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高小麥耐鹽性的方法，其特征在于以下步驟構(gòu)建一個海蓬子的水通道蛋白基因SbPIP1的表達載體pAHC25-SbPIP1；通過基因槍法將海蓬子的SbPIP1基因的表達載體pAHC25-SbPIP1導(dǎo)入受體小麥幼胚細(xì)胞；對所述的小麥幼胚細(xì)胞進行愈傷組織誘導(dǎo)、植株再生，獲得轉(zhuǎn)基因待選植株；對轉(zhuǎn)基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株；陽性轉(zhuǎn)基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T4代轉(zhuǎn)基因純合株系；對T4代轉(zhuǎn)基因純合株系后代進行耐鹽性篩選，獲得耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。其優(yōu)點是與常規(guī)的種質(zhì)培育方法相比，具有培育周期短、改良效果明顯、對重要農(nóng)藝性狀影響小的特點。
文檔編號A01H5/00GK102417913SQ201110411230
公開日2012年4月18日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者余桂紅, 周淼平, 孫曉波, 張旭, 蔣蘇, 馬鴻翔 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院