一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeSAPK7及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明設(shè)及一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白 EeSAPK7及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥作為我國(guó)重要的糧食作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位。然而，每 年因干旱、鹽堿等逆境脅迫條件嚴(yán)重影響著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著我國(guó)小麥糧食安全。 利用基因工程技術(shù)從分子水平上深入研究植物與非生物逆境之間的關(guān)系，掲示植物對(duì)逆境 脅迫信號(hào)傳導(dǎo)及基因表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理，克隆抗逆相關(guān)基因?yàn)榕嘤魑锟鼓嫘路N質(zhì)提供候 選抗逆基因資源。
[0003] 薦糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶家族（Sn服S)在植物的許多生理過(guò)程中起著重要的作 用，例如激素信號(hào)傳導(dǎo)、非生物脅迫和植物的生長(zhǎng)發(fā)育等。Sn服蛋白激酶屬于絲氨酸/蘇氨 酸蛋白激酶超級(jí)家族，由于基因序列的相似性和基因結(jié)構(gòu)的不同，被分為=個(gè)亞家族分別 是：Sn服1，Sn服2和Sn服3。Sn服蛋白激酶S個(gè)亞家族都有相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，N-端都有一 段能與其他蛋白相互作用的激酶結(jié)構(gòu)域，并且結(jié)構(gòu)在=個(gè)家族中是高度變化的。
[0004]Sn服2家族基因在功能上表現(xiàn)出一定的差異性，擬南芥中Sn服家族成員中有9個(gè) 基因被高滲脅迫（甘露醇或化Cl)誘導(dǎo)，5個(gè)基因被ABA誘導(dǎo)，但均不受冷脅迫誘導(dǎo)。在水 稻中，鑒定了 10個(gè)Sn服2蛋白激酶家族基因，命名為OsSAPKI~OsSAPKIO;水稻中Sn服基 因，通過(guò)蛋白憐酸化分析表明所有成員都能被高滲脅迫激活，但是只有OsSAPKS、0SSAPK9 和OsSAPKIO運(yùn)S個(gè)基因受ABA誘導(dǎo)表達(dá)。在小麥中，第一個(gè)Sn服2成員是從ABA處理的小 麥胚胎CDNA文庫(kù)中分離得到的PKABAl,PKABAl的表達(dá)除受ABA和干旱脅迫所誘導(dǎo)。此外， 在小麥中還鑒定出多個(gè)Sn服家族成員，如hSn服2. 3JaSn服2.AJaSn服2. 7和hSn服2.8。 化SnRK2. 3基因過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥細(xì)胞膜的穩(wěn)定性及對(duì)干旱、低溫的脅迫耐性； 化Sn服2. 4基因過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱、高鹽的脅迫耐性，同時(shí)不會(huì)造成植物 的生長(zhǎng)矮化現(xiàn)象。化Sn服2. 7基因功能分析顯示，在糖代謝、降低滲透勢(shì)、增強(qiáng)光系統(tǒng)II的 活性W及促進(jìn)植物生根等生理生化過(guò)程中起著重要作用；Taai服2.8基因過(guò)表達(dá)的擬南芥 對(duì)干旱、低溫、高鹽、高溫等均有一定脅迫耐性。
[0005] 綜上所述，Sn服蛋白激酶在調(diào)節(jié)植物的逆境反應(yīng)，提高植物的抗逆性中起著至關(guān) 重要的作用，對(duì)抗逆育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)會(huì)產(chǎn)生巨大推動(dòng)作用和經(jīng)濟(jì)效益。因此，利用抗旱、耐 鹽的野生植物長(zhǎng)穗偃麥草為實(shí)驗(yàn)材料，克隆、分離抗逆相關(guān)SnRK蛋白激酶基因改良和提高 作物的抗逆性具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeSAPK7。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋EeSAPK7的基因。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0010] 本發(fā)明的另一目的提供上述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeSAPK7的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明所提供的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeSAPK7,來(lái)源于長(zhǎng)穗偃麥草，其氨基酸序列 如沈QIDNO. 1所示。
[0012] 本發(fā)明的蛋白激酶由357個(gè)氨基酸殘基組成，是Sn服類(lèi)蛋白激酶。自SEQIDNO. 1 的氨基末端第10-34位氨基酸殘基是ATP結(jié)合域，自SEQIDNO. 1的第119-131位氨基酸 殘基為絲氨酸/蘇氨酸結(jié)合域。 陽(yáng)01引 沈QIDNO. 1
[0014]
[0015] 為了使蛋白EeSAPK7便于純化，可在由SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋 白質(zhì)的氨基末端或簇基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0016] 表1標(biāo)簽的序列
[0017]
[0018] 根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的SEQIDNO.I序列，本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子EeSAPK7可人工合成， 也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的EeSAPK7編碼基因具有如SEQIDNO. 2所示CDNA序列。
[0020] 沈QIDNO. 2
[0022] 含有EeSAPK7基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
[0023] 可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有EeSAPK7基因的重組表達(dá)載體。
[0024] 所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植 物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺巧酸信號(hào)和任何其它參與 mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺巧酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺巧酸加入到mRNA前體的 3'端，如農(nóng)桿菌冠瘦瘤誘導(dǎo)（Ti)質(zhì)?；颍ㄈ缫鲋铣擅窷os基因）、植物基因3'端轉(zhuǎn)錄 的非翻譯區(qū)均具有類(lèi)似功能。 陽(yáng)0巧]使用EeSAPK7構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核巧酸前可加上任何一種 增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花挪菜花葉病毒（CaMV) 35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子 OJbiquitin),它們可單獨(dú)使用或與其它植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu) 建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，運(yùn)些增強(qiáng)子區(qū)域可W 是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，W保證整 個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可W是天然的，也可 W是合成的。翻譯起始區(qū)域可W來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[00%] 為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、 蛋光素酶基因等）、具有抗性的抗生素標(biāo)記物（慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等）或是 抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因（如抗除莽劑基因）等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標(biāo)記基因，直接W逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0027] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐逆植物的方法。
[0028] 本發(fā)明所提供的培育耐逆植物的方法，是將上述任一種含有EeSAPK7基因的重組 表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞中，得到耐逆植物。
[0029] 利用任何一種可W引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的Sn服 蛋白激酶EeSAPK7基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對(duì)干旱和鹽等非生物逆境脅迫耐受力增強(qiáng)的 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有編碼基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、化質(zhì)粒、植 物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞 或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可W是單子葉植物，也可 W是雙子葉植物，如：擬南芥、小麥、長(zhǎng)穗偃麥草、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹(shù)、草坪 草、首宿等。
[0030] 本發(fā)明W抗旱、耐鹽性較強(qiáng)的長(zhǎng)穗偃麥草巧Iytrigia elongate L.)為實(shí)驗(yàn)材料， 得到了抗逆相關(guān)的EeSAPK7蛋白及其編碼基因，并將其導(dǎo)入擬南芥，顯著提高了植物的抗 旱、耐鹽性。本發(fā)明的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)Ω牧?、增?qiáng)擬南芥抗逆性，提高產(chǎn) 量、加速抗逆分子育種進(jìn)程，W及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
[0031] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1為T(mén)l代轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測(cè)。M:Trans2KPlusDNAmarker;1 :陰性對(duì)照； 2-8為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。
[0033] 圖2為EeSAPK7轉(zhuǎn)基因擬南芥培養(yǎng)基根長(zhǎng)表型鑒定。CK為野生型擬南芥；L1-L5 為不同轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。
[0034] 圖3為EeSAPK7轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱性鑒定。CK為野生型擬南芥；1^、1^3、1^4、1^5為 不同轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。
[0035] 圖4為EeSAPK7轉(zhuǎn)基因擬南芥篩盒耐鹽性鑒定。CK為野生型擬南芥；LU13、L4、 L5為不同轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。
【具體實(shí)施方式】
[0036]W下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)