專利名稱：一種油菜csRRM2基因在改良油菜產(chǎn)量性狀方面的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術領域，具體涉及一種改良油菜產(chǎn)量性狀方法。
背景技術：
目前國內(nèi)外利用轉(zhuǎn)基因改良作物經(jīng)濟性狀的技術與方法主要是根據(jù)已知的功能基因與表型性狀的關系，采用組成型表達載體或組織專一性表達載體將目的基因?qū)肽繕酥参铮云讷@得作物特定經(jīng)濟性狀或抗逆性性狀的改良。這一方法利用的基因都是來自天然的具有完整結(jié)構的基因序列或具有完整編碼順序的cDNA。采用天然基因的某一結(jié)構成分改良作物的經(jīng)濟性狀目前少有報道。

我們嘗試采用功能基因的某一結(jié)構域的編碼順序，利用轉(zhuǎn)基因方法將其克隆到表達載體，然后導入農(nóng)作物細胞，以期獲得重要經(jīng)濟性狀發(fā)生改良的轉(zhuǎn)基因再生植株。通過這一方法擴大功能基因轉(zhuǎn)基因的利用范圍，達到常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法難以產(chǎn)生的在生產(chǎn)上可以利用的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種油菜CSRRM2基因及其同源基因在改良油菜產(chǎn)量性狀方面的應用。本發(fā)明利用過表達油菜CSRRM2基因及其同源基因的載體轉(zhuǎn)化油菜，以改良油菜的產(chǎn)量性狀；實施例中，本發(fā)明將過表達油菜cSRRM2基因的載體用于轉(zhuǎn)化油菜品種No. INannongyou,使得油菜品種No. I Nannongyou的產(chǎn)量性狀發(fā)生明顯改善,主要表現(xiàn)為增加果莢數(shù)目及種子大小。本發(fā)明還包括油菜CSRRM2基因的分離、克隆與轉(zhuǎn)基因功能研究等。本發(fā)明還包括利用過表達油菜CSRRM2基因及其同源基因的載體，轉(zhuǎn)化包括大豆，甜菜以及玉米，小麥，高粱等作物，用于產(chǎn)量性狀的改良。(I)油菜csRRM2基因與蛋白結(jié)構組成
根據(jù)本申請人之前獲得專利的水稻csRRM2基因(專利號2004 I 0084319. 3)，利用已發(fā)表登錄的國際數(shù)據(jù)庫中的EST及油菜基因組數(shù)據(jù)，設計PCR引物，從油菜品種No. INannongyou幼苗中克隆到了油菜csRRM2基因,其序列如SEQ. ID NO. I所示,編碼83個氨基酸，其序列如SEQ. ID N02.所示。油菜CSRRM2基因編碼的蛋白結(jié)構見圖I所示。(2)過表達油菜csRRM2基因的表達載體的構建
本發(fā)明實施例中使用的油菜csRRM2基因如SEQ. ID N01.所示。采用pBIN438為表達載體，利用酶切位點沿ol和II將油菜csRRM2基因序列插入到pBIN438載體35S組成型啟動子下游，得到過表達油菜cSRRM2基因的表達載體。其結(jié)構圖如圖2所示。其中，載體pBIN438由植物轉(zhuǎn)化載體pBI121改造所得(可參見1.《西北植物學報》2006年11期“TaNHX_2基因植物表達載體的構建及在擬南芥中的功能分析”俞嘉寧原江鋒楊建雄趙詠梅王喆之張志琪；2.《中國生物工程雜志》2009年02期煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒雙價RNA沉默抗病載體的快速構建潘麗張永光王永錄王寶琴王文秀方玉珍蔣守田張維德董金杰呂建亮謝慶閣)。(3)油菜CSRRM2基因轉(zhuǎn)化實驗
采用油菜品種No. I Nannongyou為轉(zhuǎn)基因受體，構建過表達油菜csRRM2基因的轉(zhuǎn)基因植株。將油菜品種No. I Nannongyou成熟種子消毒后接種在含MS培養(yǎng)基上。待幼苗子葉微張時將子葉去除，留0. 4 I. Ocm的下胚軸，在解剖鏡下剝離出莖尖，保留兩個葉原基。利用農(nóng)桿菌侵染的方法將油菜CSRRM2基因過表達載體導入幼苗，用卡那霉素篩選陽性植株。(4)轉(zhuǎn)化處理試管苗移栽及轉(zhuǎn)化植株后代的分子檢測
將油菜csRRM2基因轉(zhuǎn)化處理的油菜品種No. I Nannongyou試管苗移栽田間，并采用PCR擴增技術檢測候選的抗性植株，再用Southern Blotting技術最終鑒定(圖3所示)，獲 得陽性TO代植株。(5)油菜csRRM2基因的實時定量PCR (RealTimePCR)檢測
油菜csRRM2基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達量比油菜品種No. I Nannongyou植株明顯升聞。見圖4所不。(6)油菜csRRM2基因轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量性狀的調(diào)查與統(tǒng)計
將4個油菜csRRM2基因轉(zhuǎn)基因株系(序號為A-5，A_7，A_22，B-1)和油菜品種No. INannongyou (CK),每個株系各種植20株,行株距為50厘米x 50厘米。在成熟期統(tǒng)計各株系20個單株的千粒重(克)、油份(%)、株高(cm)、莖直徑(mm)、單株果莢數(shù)、果莢長度(cm)、 果莢寬度(_)、單個果莢種子數(shù)、單株種子產(chǎn)量(g)、種子產(chǎn)量增產(chǎn)，計算平均值及SD值，統(tǒng)計結(jié)果如下
|A-5|A-7lA-22|B-1|CK
虧^重(克)4.3±0.2 iTT+0.2 l4±0.2 _4.3±0.1 4.0±0. I
MIjv (%)39.8±1.0 ￥7§±1.8 $9.9±1.5 _40.1±1.6 38. I±1.4
(cm)150.6±6.1 T^T2±10.6 T~56. 3±9.9 _150.7±8.1 136. 3±7.6
Ml[徑(mm)18.3±0.5 TiT^±1.5 T~9.2±1.6 _18.7±2.2 17.0±2. I
1 果莢數(shù)575. 8±52. 5 ~^T8±8. 9 &1. 5±55. 3 _ 686. 0±56. 4 558. 8±62. 2
粟寨長度(cm) 6.5±0.6 677+0. 4 7! 7±0. 5 _7.0±0.3 6. 4±0. I 寬度(mm) 5.2±0.3 KT±0. 2 可 5±0. 3 _5.3±0.1 4. 9±0. 3 軍不果莢種子數(shù) 24.8±1.1 瓦71±1.4 j~8.6±1.5 _25.2±2.4 23. 5±2.3 軍備種子產(chǎn)量(g) 25.5±2.9 石T5±2.9 j~2.6±2.7 _24.6±2.6 18. 5±2.0 兩字產(chǎn)量增產(chǎn) |37.20%|30.00%|20.90%|31.60%|nA
油菜CSRRM2基因轉(zhuǎn)基因植株明顯較油菜品種No. I Nannongyou植株增大，見圖5所示。
根據(jù)上述田間調(diào)查及考種數(shù)據(jù)，與對照相比，油菜CSRRM2基因轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量性狀優(yōu)于
對照油菜品種No. I Nannongyou,有的株系單株增產(chǎn)可達37. 2%。油菜csRRM2基因轉(zhuǎn)基因
增加產(chǎn)量的主要原因是增加果莢數(shù)目及種子大小。(7)油菜CSRRM2基因轉(zhuǎn)基因植株器官及細胞明顯增大
油菜csRRM2基因轉(zhuǎn)基因植株較對照油菜品種No. I Nannongyou，種子，果莢，花粉大小及子葉柄細胞大小明顯增大，見圖6所示。csRRM2基因所表現(xiàn)出來的上述功能，可以進一步用來改良農(nóng)作物或其他經(jīng)濟作物的許多重要經(jīng)濟性狀。因為在雙子葉和單子葉植物中均存在csRRM2基因，并且該基因在雙子葉和單子葉植物中具有很高的保守性。因此，本發(fā)明方法對雙子葉和單子葉作物均有效果，可以改良其它雙子葉和單子葉作物的經(jīng)濟性狀，如增加果實重量，提高谷類作物如小麥，玉米，高粱，大麥的籽粒千粒重，提高大豆和甜菜的產(chǎn)量等，也可用于改變花卉的葉型和花朵形狀，提高觀賞價值，以及改變植物纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量。


圖I為油菜csRRM2基因蛋白結(jié)構。圖2為過表達油菜csRRM2基因的表達載體結(jié)構。
圖3為油菜csRRM2轉(zhuǎn)基因Southern Blotting鑒定結(jié)果。圖4為油菜csRRM2基因的實時定量PCR檢測結(jié)果。圖5為油菜csRRM2轉(zhuǎn)基因植株的株型明顯變大。圖6為油菜csRRM2轉(zhuǎn)基因植株的器官及細胞大小明顯增大。
具體實施例方式I、用帶酶切位點的引物克隆油菜csRRM2基因的cDNA，將其和植物表達載體PBIN438用沿ol和II酶切后連接，將油菜csRRM2基因插入到35s promoter的下游。見圖2。2、根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備
(I)挑取LBA4404單菌落接種至5 ml YEP(鏈霉素30 mg/L，含利福平100 mg/L)的培養(yǎng)基中，28 °C，200 rpm振蕩過夜培養(yǎng)。(2)將2 ml過夜培養(yǎng)菌液加至50ml含有同樣抗生素的YEP培養(yǎng)基中，28°C，220rpm搖菌4 h,使0D600達到0. 5左右。(3)5000 rpm離心5 min,去上清液,加入10 ml的0. 15 mol/L NaCl溶液懸浮細胞，懸浮后冰浴20 min。(4) 4。。，5000 rpm離心 5 min,去上清液,加入 Iml 冰預冷的 20 mmol/L 的 CaCl2 :懸浮細胞，分裝至I. 5 ml EP管(內(nèi)含15%甘油)中，每管200 p I備用。3、根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化
取5 u I的油菜csRRM2基因過表達載體質(zhì)粒DNA加入到己制備的200 u I LBA4404感受態(tài)細胞中，冰浴30 min，加液氮迅速冷凍5 min，37°C水浴鍋融化5 min，加入ImlYEP液體培養(yǎng)基，28°C 150 rpm輕搖2-3h，收集菌體涂布于含有卡那霉素50ml/L、利福平100mg/L和鏈霉素30 mg/L的YEP平板上，28°C培養(yǎng)2天。4、油菜轉(zhuǎn)化材料的制備植物材料的處理及培養(yǎng)
(I)本實驗用油菜子葉下胚軸為受體材料。取油菜品種No. I Nannongyou種子若干,去除破損和空癟的種子，用水沖洗I小時，然后用75%酒精滅菌4分鐘，再用無菌水沖洗3遍，再用0. 1%取(12表面滅菌15 min，用無菌水沖洗3遍，濾紙吸干水分后，置于固體MS培養(yǎng)基(含蔗糖30g/L)上暗培養(yǎng)，種子萌發(fā)后再移至光下培養(yǎng)，8-9天后取出無菌幼苗將子葉柄切下，小心剝掉兩子葉之間小芽，即得到了做為轉(zhuǎn)化材料使用的子葉柄。置于含2mg/L 6-BA和I mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天。(2)挑取鑒定結(jié)果為陽性的農(nóng)桿菌單菌落，接種至含有相應抗生素的YEP培養(yǎng)液中，28°C，200 rpm搖床培養(yǎng)16個小時，使農(nóng)桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，用含蔗糖30g/L的液體1/2MS培養(yǎng)基將其重懸至OD6tltl為0. 4-0. 5。(3)共培養(yǎng)將新切下的油菜子葉柄在菌液中侵染5min，用濾紙迅速吸干多余菌液，將子葉柄接種至含2mg/L 6-BA和I mg/L 2，4_D的MS培養(yǎng)基上，黑暗中共培養(yǎng)I 2天。(4)抗性植株篩選用液體1/2 MS培養(yǎng)基清洗子葉柄，再用濾紙吸干多余液體，將子葉柄插入附加有0. lmg/L NAA,4mg/L 6-BA, 5-8mg/L卡那霉素和500mg/L羧節(jié)青霉素的MS培養(yǎng)基(含蔗糖30g/L)中。14/10小時光周期，25-28°C培養(yǎng)。兩周繼代一次，共繼代3次，看芽的情況可以適當減少篩選次數(shù)。(5)抗性植株移栽將篩選的綠芽接種到附加有0. 5mg/L NAA和0. lmg/L IBA的1/2 MS培養(yǎng)基(含蔗糖10g/L)上，當根長長至2cm以上時煉苗兩天后即可移至土壤中。 5、油菜總DNA的提取
(1)在7ml離心管中加入2. 5 ml的CTAB提取緩沖液，65°C水浴鍋預熱；
(2)稱取0.5g新鮮的油菜葉片，去除葉脈后置于預冷的研缽中(加入0. 04g PVP)，加液氮同時研磨至粉末；
(3)將凍粉迅速轉(zhuǎn)至提取緩沖液中，盡快用玻璃棒混勻，65°C水浴鍋保溫30分鐘，期間輕柔搖動4次，取出離心管自然冷卻到室溫；
(4)取等體積的氯仿/異戊醇(24/1)抽提兩次，混合混勻，每次在室溫下10000rmp離心10分鐘留上清液；
(5)將上清渡轉(zhuǎn)移至一潔凈的離心管，加2/3體積的異丙醇.輕緩顛倒混勻，室溫下放置15分鐘
(6)10000 rmp離心10分鐘，棄上清液
(7)用2ml 70%乙醇洗滌沉淀兩次，室溫下放置風干，溶于600 u I TE緩沖液中
(8)加入終濃度為50u g/ml的RNase. 37°C保溫I小時;
(9)用等體積的氯仿/異戊醇(24/1)抽提兩到三次，溫和混勻，每次在室溫下10000rmp離心10分鐘；
(10)取上清液加入終濃度為02 0 4 mol/L NaCl，2倍體積的無水乙醇，放置I小時，12000 rEp離心10分鐘；
(11)用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，自然干燥后溶于30 50ul TE中備用。
權利要求
1.一種油菜csRRM2基因及其同源基因在改良油菜產(chǎn)量性狀方面的應用，其特征在于利用過表達油菜csRRM2基因及其同源基因的載體轉(zhuǎn)化油菜，以改良油菜的產(chǎn)量性狀；其中，所述油菜csRRM2基因的序列如SEQ. ID NO. I所示。
2.根據(jù)權利要求I所述的應用，其特征在于采用油菜品種No.I Nannongyou為轉(zhuǎn)基因受體，構建過表達油菜csRRM2基因的轉(zhuǎn)基因植株。
3 一種過表達油菜csRRM2基因的表達載體，其特征在于采用pBIN438為表達載體，將油菜csRRM2基因插入到pBIN438載體35S組成型啟動子下游而獲得。
全文摘要
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因技術領域，具體為油菜csRRM2基因在改良油菜產(chǎn)量性狀方面的應用。本發(fā)明利用過表達油菜csRRM2基因及其同源基因的載體轉(zhuǎn)化油菜，用以改良油菜的產(chǎn)量性狀，其中，所述油菜csRRM2基因的序列如SEQ.IDNO.1所示。本發(fā)明采用油菜品種No.1Nannongyou為轉(zhuǎn)基因受體，構建過表達油菜csRRM2基因的轉(zhuǎn)基因植株。csRRM2所表現(xiàn)出來的這種功能可以用來改良農(nóng)作物或經(jīng)濟作物的許多重要經(jīng)濟性狀，如增加果實重量,提高谷類作物如小麥,玉米,高粱,大麥的籽粒千粒重,提高大豆和甜菜的產(chǎn)量等,也可用于改變花卉的葉型和花朵形狀,提高觀賞價值,以及改變植物纖維的品質(zhì)和產(chǎn)量。
文檔編號A01H5/00GK102719452SQ20121022294
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月2日 優(yōu)先權日2012年7月2日
發(fā)明者孫凡, 楊金水, 祈巍巍, 羅小金 申請人:復旦大學