一種控制高粱芒有無基因SbAn-1以及SNP突變位點和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體設及保護控制高梁有芒無芒基因 SbAn-I和該基 因的應用，屬于分子生物學和高梁育種領域。
【背景技術】
[0002] 高梁(Sor曲Um bicoloHL. )Moench)屬于單子葉植物綱禾本科高梁屬，是一年生 高大草本植物，表皮覆蓋蠟質(zhì)，具典型的C4植物特化光合作用器官、高光合效率功能和高產(chǎn) 潛力，具有耐旱、耐潰、耐貧瘡、耐鹽堿，種植面積在世界糧食作物中占第5位(前4位依次為 玉米、小麥、水稻、大麥），主要分布在非洲、亞洲、美洲的干旱和半干旱地區(qū)，是世界上最古 老的栽培作物之一。高梁的主要產(chǎn)物巧粒除用作食品和飼料外，還可W制酒、制淀粉、制醋、 制始糖等。因為穗的各項表型特征都有可能影響到高梁巧粒的產(chǎn)量，所W與穗型相關的研 究在高梁各項研究中占很大比例。芒是高梁上的性狀之一，并且高梁芒位于小花內(nèi)釋頂端 中肋延伸而成，位于巧粒最頂部，接受充足的光能和C〇2,并且防止鳥類的侵害，可間接提高 巧粒的收獲量。
[0003] 全基因組關聯(lián)分析(6611〇1116-'\￥1(1643 3〇(31曰1:;[0]151：11(17,6胖45)是一種對全基因組范 圍內(nèi)的常見遺傳變異(單核巧酸多態(tài)性和拷貝數(shù))總體關聯(lián)分析的方法，它能夠在全基因組 范圍內(nèi)進行整體研究，能夠一次性對疾病進行輪廓性概覽，適用于復雜疾病的研究。在全基 因組層面上，開展大樣本、反復驗證的基因與疾病的關聯(lián)研究，可W全面掲示疾病發(fā)生、發(fā) 展與治療相關的遺傳基礎。與圖位克隆法(map-basedcloning)相比，全基因組關聯(lián)分析具 有W下幾個方面優(yōu)點：DGWAS研究不再需要在研究之前構(gòu)建任何假設;2)可用自然群體，無 需一定是遺傳群體，大大縮短了研究年限;3)能夠一次性通過監(jiān)測成千上萬個SNPs，對全基 因組范圍內(nèi)整體研究；4) G W A S研究的精度大大提高，例如由玉米的作圖精度10 - 3 0 C M (Salvi ,2005)提高到GWAS的精度1500bp(Remington，2001)。隨著基因組測序技術的提高及 測序成本的降低，并結(jié)合生物信息學的高度發(fā)展，GWAS成為挖掘和剖析高梁有無芒基因及 其相關遺傳機制最有效的方法之一。
[0004] 芒是禾本科植物主要性狀之一，基因組內(nèi)發(fā)生何種變化導致芒的有無及長短等的 變化呢？早在1898年，就有人對禾谷類作物的芒進行過研究，發(fā)現(xiàn)其具有氣孔且可W固定 C〇2,相繼禾谷類作物中大麥和水稻的芒基因研究則較多。2011年，化等精細定位水稻芒相 關基因 Awn4.巧Ij第4號染色體一個330kb的區(qū)間范圍內(nèi)；2013年，Luo等克隆到基因 SbAn-I, 并證實該基因不僅控制水稻芒的有無，還影響水稻巧粒的數(shù)量和形狀。2015年孫傳清教授 課題組發(fā)現(xiàn)，控制野生稻長、刺芒的基因 LABAUL0NG AND BARB邸AWN 1)，位于水稻第4染 色體長臂上，編碼一個細胞分裂素激活酶。該基因在芒原基的特異表達提高了芒原基活性 細胞分裂素含量，增強了芒原基細胞分裂活性，最終引起芒的伸長和芒刺形成。高梁芒基因 的精細定位國內(nèi)外均鮮見報道，在2014年奮國偉等精細定位在第3條染色體115肺范圍內(nèi)， 但沒有克隆到基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種控制高梁芒的有無 基因訊An-I功能。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述控制高梁有芒或無芒的訊An-I基因的檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述控制高梁芒的有無基因訊An-I的應用。
[0008] 本發(fā)明目的是通過如下技術方案來實現(xiàn)的：
[0009] 本發(fā)明公開了一種控制高梁芒的有無基因 SbAn-I，WBTx623參考基因組來看，當 無芒時為Sobic.003G417700該基因正常序列，而有芒高梁該基因發(fā)生S個位點的突變，第 一個點72367561，T突變?yōu)镃即TTT(苯丙氨酸）突變?yōu)門TC(苯丙氨酸）為同義突變，另外兩個 位點發(fā)生了非同義突變。非同義突變SNP位點位于高梁基因組3號染色體第72367415位核巧 酸和72367368位核巧酸，該兩個位點核巧酸分別由G突變?yōu)锳，C突變?yōu)門，氨基酸分別都由精 氨酸（Arg/R)突變?yōu)榻M氨酸（His/H)和半脫氨酸（Cys/C)，由引物對Sb03g045130F和 Sb03g045130R從高梁基因組DNA中擴增出來的核巧酸序列，經(jīng)電泳檢測測序后，與區(qū)分高梁 芒的有無。
[0010] 所述引物對的核巧酸序列如下所示：
[00川上游引物；
[001引下游引物：
[0013] 所述的控制高梁芒的有無基因訊An-I鑒定方法，包含W下步驟：
[0014] (1)通過常規(guī)PCR法擴增，獲得高梁有芒無芒基因訊An-I基因序列； (2) 利用多序列比對軟件工具(如MegAl i gn或DNAMAN軟件），將步驟(1)所獲得的序列翻 譯成蛋白質(zhì)序列后進行比對，得到高梁有芒無芒基因 SbAn-I所特異的3處單堿基差異，該差 異位于該基因的外顯子，最終導致功能特異性氨基酸的改變； (3) 對步驟(2)所獲得的序列在不同的高梁自然群體中進行驗證，從而確定高梁芒的有 無基因 SbAn-I的功能。經(jīng)測定有芒樣品236份和無芒高梁樣品182份，有芒和無芒的基因序 列=個位點發(fā)生突變從而區(qū)分高梁種質(zhì)的有芒或無芒，該基因的功能正確率達72% W上。 為了進一步證實該基因 SbAn-I為控制芒的有無基因，利用有芒L361和無芒BTx623的Fi表型 為無芒，雜交后代F2代高梁株系，867株F2單株中，無芒為654株，有芒213株，卡方檢驗表明， F2群體中無芒與有芒單株數(shù)量符合3:1分離模型。從Fi單株表型和F2群體的表型分離情況可 W判定，本研究中雙親芒性受一核質(zhì)單基因控制，且無芒對有芒為顯性。該訊An-I基因在運 些F2群體中所有654株的該基因 S個突變位點SNP為雜合(TC, AG, CT)或未突變(T，G，C)，213 株有芒樣品全部為純合的（C，A，T)。因此，我們確定該基因 SbAn-I即為控制芒的有無的功 能。
[001引進一步的，所述訊An-I的PCR擴增反應體系如下：
[0016] 高梁基因組DNA Iul,上下游引物各Iul JXhq PCR Master Mix 12.5ul，d地2〇 9.5ul 總體積 25ul;
[0017] 反應在BIO-RAD TlOO? lliermal巧cler PCR儀進行擴增，反應流程如下：94°C預 變性3分種;94 °C 30秒、55 °C 30秒、72 °C 50秒，34個循環(huán);72 °C 5分種;4 °C保存。
[0018] 所述高梁芒的有無基因 SbAn-I的應用，包括對高梁種質(zhì)資源的篩選和鑒定，W及 作為分子標記輔助育種。
[0019] 相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的控制高梁有無基因 SbAn-I是通 過全基因組關聯(lián)分析所獲得，該技術能夠一次性檢測到多個核巧酸多態(tài)位點，從而有利于 大批量地挖掘與簡單性狀的基因。選擇基因 WPCR技術為基礎，可W直接用于高梁芒的有無 基因訊An-I及其等位基因的鑒別，從而實現(xiàn)分子標記輔助育種。
【附圖說明】
[0020] 圖1為全基因組關聯(lián)分析CMLM方法獲得高梁芒的有無基因定位的Mahattan圖；
[0021] 圖2為全基因組關聯(lián)分析獲得不同分析方法獲得的QQ-Plot圖；
[0022] 圖3為具有該基因功能特異性SNP的高梁芒有無基因訊An-I的CDS序列比對圖；
[0023] 圖4為無芒BTx623與有芒L361高梁基因組訊An-I氨基酸比對圖。
[0024] 圖5為具有該基因功能特異性SNP的高梁芒有無基因訊An-I的氨基酸比對圖；
[0025] 圖6為高梁芒基因訊An-I分離群體中的測序圖。 實施例1 控制高梁芒的有無基因 SbAn-lWBTx623參考基因組來看，當無芒時為 Sobic.003G417700該基因正常序列，而有芒高梁該基因發(fā)生S個位點的突變，第一個點 72367561，T突變?yōu)镃即TTT(苯丙氨酸）突變?yōu)門TC(苯丙氨酸)為同義突變，另外兩個位點發(fā) 生了非同義突變。非同義突變SNP位點位于高梁基因組3號染色體第72367415位核巧酸和 72367368位核巧酸，該兩個位點核巧酸分別由G突變?yōu)锳，C突變?yōu)門，氨基酸分別都由精氨酸 (Arg/R)突變?yōu)榻M氨酸（His/H)和半脫氨酸（Cys/C)，由引物對Sb03g045130F和 Sb03g045130R從高梁基因組DNA中擴增