基于pgr基因的豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物分子育種領(lǐng)域，尤其涉及一種基于PGR基因的豬繁殖性狀相關(guān)的 分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子標(biāo)記輔助選擇是基因工程在現(xiàn)代家畜育種中的一項(xiàng)重要應(yīng)用，利用與育種性 狀相關(guān)的各種標(biāo)記代替以表型為基礎(chǔ)的選擇，從分子水平上分析個(gè)體的遺傳組成，從而實(shí) 現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇，可克服直接選擇的弊端，提高選擇的準(zhǔn)確性和縮短世代間隔。
[0003] 總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)等豬的繁殖性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，直接關(guān)系到養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng) 濟(jì)效益。
[0004] 孕酮是一種很重要的留體激素，在受孕和和維持妊娠中起關(guān)鍵作用，同時(shí)也是控 制排卵、子宮和乳腺發(fā)育的重要因素。孕酮的生理作用是通過(guò)孕酮受體（PGR)介導(dǎo)的，因 此，孕酮的生理效應(yīng)不僅取決于孕酮本身的分泌和代謝，還與孕酮受體的表達(dá)與功能密切 相關(guān)。人的PGR基因定位于Ilq22_q23,含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。PGR基因多態(tài)性研 究大部分集中在人和綿羊上。目前未見(jiàn)PGR基因與豬繁殖性狀之間關(guān)系的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種基于PGR基因的豬繁殖性 狀相關(guān)的分子標(biāo)記。本發(fā)明還提供了該分子標(biāo)記的檢測(cè)方法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述的基于PGR基因的豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，它為豬PGR基因片段， 所述的豬PGR基因片段含有多態(tài)性位點(diǎn)，所述的多態(tài)性位點(diǎn)為如SEQ ID NO. 1所示序列中 第1319位，所述的多態(tài)性位點(diǎn)具有C/T堿基的變異。
[0007] 序列表中SEQ ID NO. 1所示的序列為豬PGR mRNA序列，其第1319位為多態(tài)性位 點(diǎn)，與豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)緊密相關(guān)，可利用該位點(diǎn)開(kāi)發(fā)與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。
[0008] 本發(fā)明所述的豬PGR基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示；或所述的豬PGR 基因片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。當(dāng)然，本發(fā)明所述的豬PGR基因片段也可以 為包含如SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列的DNA片段。根據(jù)檢測(cè)方法，可以選擇合適長(zhǎng)度的 能夠包含多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段。
[0009] 本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括：
[0010] (1)根據(jù)所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物；
[0011] ⑵以待檢測(cè)豬的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0012] (3)判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中多態(tài)性位點(diǎn)的類(lèi)型。
[0013] 步驟（3)中，可對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序或電泳分析，判斷多態(tài)性位點(diǎn)的堿基類(lèi)型。
[0014] 優(yōu)選的，步驟（1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0. 14所示，下游引物的核 苷酸序列如SEQ ID N0. 15所示。利用該引物，可采用錯(cuò)配PCR-RFLP的方法準(zhǔn)確方便的檢 測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的類(lèi)型。
[0015] 作為另一種可選擇的，步驟（1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記在豬繁殖性狀選擇中的應(yīng)用。
[0017] 具體的，豬可以為小梅山豬、楓涇豬或大白豬。繁殖性狀為總產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0019] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，豬PGR基因第1外顯子存在一個(gè)突變位點(diǎn)（即多態(tài)性位點(diǎn)），該 位點(diǎn)位于如SEQ ID NO. 1所示序列的第1319位，該突變位點(diǎn)與豬的繁殖性狀尤其是總產(chǎn)仔 數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)相關(guān)，且容易檢測(cè)，從而本發(fā)明根據(jù)該突變位點(diǎn)提供了一種基于PGR基因的 豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，并提供了該分子標(biāo)記的檢測(cè)方法及在豬繁殖性狀選擇中的應(yīng) 用，為豬分子育種、研究豬繁殖生理機(jī)制提供基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為實(shí)施例1豬PGR基因SNPs篩選結(jié)果；
[0021] 圖2為實(shí)施例1豬PGR基因C1319T氨基酸序列比對(duì)結(jié)果；
[0022] 圖3為實(shí)施例1錯(cuò)配PCR-RFLP的錯(cuò)配堿基與酶切位點(diǎn)分析結(jié)果；
[0023] 圖4為實(shí)施例1豬PGR基因C1319T的錯(cuò)配PCR-RFLP檢測(cè)部分樣本的電泳圖；
[0024] 圖5為實(shí)施例1突變位點(diǎn)C1319T分型檢測(cè)中AA基因個(gè)體的測(cè)序結(jié)果；
[0025] 圖6為實(shí)施例1突變位點(diǎn)C1319T分型檢測(cè)中BB基因個(gè)體的測(cè)序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià) 形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 2013年采集106頭小梅山豬、42頭楓涇豬和70頭大白豬的耳樣；同時(shí)整理了江蘇 農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院小梅山豬育種中心2004年~2012年期間上述106頭小梅山母豬的生產(chǎn) 檔案，共有698窩仔豬記錄，主要收集產(chǎn)仔年份、胎次、TNB、NBA等指標(biāo)。耳樣（約0. 15g) 用耳號(hào)鉗采集，-20°C凍存。用常規(guī)的酚氯仿抽提法提取豬耳樣的基因組DNA，對(duì)基因組DNA 進(jìn)行0D值測(cè)定，計(jì)算其濃度，并用ddH 20稀釋至終濃度為100ng/ y L，原液-20°C保存，稀釋 液4°C保存。
[0029] 第一步：獲取豬PGR基因外顯子序列。
[0030] 根據(jù)GenBank中公布的人PGR基因全序列（登錄號(hào)：AY525610. 1)和豬PGR mRNA 序列（登錄號(hào)：NM_〇〇1166488. 1，序列如SEQ ID NO. 1所示），比對(duì)兩者的蛋白質(zhì)序列，確定 豬PGR基因外顯子區(qū)域。豬PGR基因共8個(gè)外顯子。
[0031] 第二步：應(yīng)用生物軟件設(shè)計(jì)引物，引物擴(kuò)增覆蓋外顯子區(qū)域。
[0032] 采用Primerf. 0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物，擴(kuò)增第1外顯子區(qū)域。3對(duì)引物分別為： PGR-1. 1、PGR-1. 2、PGR-1. 3。引物基本信息見(jiàn)表 1。
[0033] 表1豬PGR基因引物序列
[0034]
[0035] 注：F代表上游引物，R代表下游引物。
[0036] 第三步：PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序。
[0037] 每個(gè)個(gè)體基因組DNA樣本吸取5 y L進(jìn)行混合，形成DNA池，混合后采用上述3對(duì) 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。
[0038] PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 20 y L，包括：10XBuffer 2. 0 y L、25mM Mg2+2. 2 y L、10mM dNTPs 0? 8 y L、10 y M 上、下游引物各 1 y L、DNA 模板 1 y L (lOOng)、5U ? y L taq 酶 0? 2 y L、 ddH20 11.8yL〇
[0039] PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min ;31個(gè)循環(huán)（94°C變性lmin，58°C~60°C退 火30s，72°C延伸lmin);最后72°C延伸10min，4°C保存產(chǎn)物。具體的退火溫度根據(jù)表1中 的相應(yīng)引物進(jìn)行選擇。
[0040] 第四步：序列比對(duì)，尋找突變位點(diǎn)。
[0041] 測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的序列進(jìn)行比對(duì)，尋找突變位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在引物 PGR-1. 1所擴(kuò)片段（PGR-1. 1擴(kuò)增靶向序列如SEQ ID N0. 3所示）中存在1個(gè)SNP，即位于 第1外顯子的1319位點(diǎn)的C - T的突變（圖1)。
[0042] 第五步：對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸比對(duì)分析和酶切位點(diǎn)分析。
[0043] 利用DNAMAN軟件將SNPs所在的外顯子核苷酸翻譯為氨基酸序列，對(duì)突變前后的 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明C1319T未能引起氨基酸的改變，屬于同義突變（圖2);酶 切位點(diǎn)分析結(jié)果表明，C1319T未能產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)或喪失某個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0044] 第六步：突變位點(diǎn)的分型檢測(cè)。
[0045] 利用PCR-SSCP技術(shù)和錯(cuò)配PCR-RFLP技術(shù)對(duì)小梅山豬、楓涇豬和大白豬三個(gè)豬群 體的PGR基因突變位點(diǎn)C1319T進(jìn)行分型檢測(cè)。
[0046] (1) PCR-