專利名稱：利用植物基因工程技術(shù)培育菊苣優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種利用植物基因工程技術(shù)培育菊苣優(yōu)質(zhì)(含蛋氨酸和半胱氨酸)新種質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
含硫氨基酸在飼料植物中含量較 少，特別是半胱氨酸和蛋氨酸，常成為第一限制性必需氨基酸。培育高含硫氨基酸的飼草品種是當(dāng)前飼草品質(zhì)改良的研究熱點(diǎn)之一。菊苣(Cichorium intybus L.)是菊科菊苣屬多年生草本植物,適應(yīng)性強(qiáng),喜溫暖濕潤氣候,溫度達(dá)5 °C時，能正常生長發(fā)育。抗寒能力強(qiáng)，幼苗能耐_8°C的低溫。對土壤要求不嚴(yán)格，在荒地、坡地均能生長，全國各地都適合種植。利用期長，由于春季返青早，冬季休眠晚，利用期長達(dá)8個月(4 11月)之久，夏秋干旱季節(jié)，大多數(shù)牧草枯黃時，菊苣仍能保持青枝綠葉，可解決養(yǎng)殖業(yè)春秋兩季和青飼料緊缺的矛盾，一次播種，在不收種的情況下可連續(xù)利用多年。菊苣被廣泛用于飼料、蔬菜、制藥和制糖原料，是目前較具開發(fā)前途的經(jīng)濟(jì)作物和首選的養(yǎng)殖業(yè)青飼料，近年來，菊苣在很多地區(qū)大量栽培，己成為一種極受歡迎的高檔保健型蔬菜和新型優(yōu)良飼草。但是菊苣含硫氨基酸特別是蛋氨酸和半胱氨酸含量很低，限制了其更為廣泛的利用。菊苣遺傳背景復(fù)雜，用常規(guī)育種方法培育高蛋白和高含硫氨基酸品種不僅耗時耗財耗力且難度極大，因此，利用一些高含硫氨基酸蛋白基因，通過遺傳工程手段創(chuàng)造菊苣優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)，并提高菊苣蛋白質(zhì)中含硫氨基酸水平具有十分重要的意義。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良菊苣品質(zhì)特別是提高含硫氨基酸含量目前還沒有報道。重組蛋白基因zeolin是將菜豆球蛋白基因phaseiolin通過連接肽連接到玉米種子醇溶蛋白基因Y-Zein的N端構(gòu)成的，該基因富含蛋氨酸和半胱氨酸，為提高了轉(zhuǎn)基因植物中zeolin基因的穩(wěn)定性和增強(qiáng)其表達(dá)，在重組基因前面加上了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白信號(KDEL)。Zeolin重組蛋白基因編碼區(qū)有1578個核苷酸，編碼526個氨基酸序列。其蛋白質(zhì)分子量為58. OkDa0

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種利用植物基因工程技術(shù)培育菊苣優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種利用植物基因工程技術(shù)培育菊苣優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)的方法，包括以下步驟:Al、菊苣無菌實(shí)生苗的獲得；A2、葉片外植體預(yù)培養(yǎng)；A3、轉(zhuǎn)化菌液的準(zhǔn)備用無菌牙簽或接種針挑取含有外源基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種到50 mL含有硫酸鏈霉素(Str，50 mg/L)和卡那霉素(Kan, 50 mg/L)的液體YMB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)16 24h至對數(shù)生長期，將培養(yǎng)物于4000飛000r/min離心10 min，去除上清液，收集菌體，用1/2MS無菌液體培養(yǎng)基重懸沉淀至0D600=0.4Abs，用于侵染轉(zhuǎn)化；或直接用1/2MS無菌液體培養(yǎng)基稀釋菌液用于侵染。所述YMB 培養(yǎng)基0. 5g/L K2HPO4 + O. 2g/L MgSO4 · 7H20 + 0. 5g/L NaCl + lOg/LMannitol +0.4g/LYeast extract,pH7.5 ；A4、外源基因的浸染轉(zhuǎn)化無菌條件下，選取生長狀態(tài)良好的預(yù)培養(yǎng)外植體放入制備好的菌液中，使葉片外植體與菌液充分接觸，并放于震蕩培養(yǎng)箱上震蕩浸染IOmin ;浸染完后取出外植體，用滅菌濾紙吸去葉片表面附著的多余菌液，接種到墊有一層無菌濾紙且添加有乙酰丁香酮(AS，100umol/L)的共培養(yǎng)基上，于黑暗中共培養(yǎng)2_3d到肉眼有可見微菌落；共培養(yǎng)完后，將外植體接種到與預(yù)培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)l-2d ;所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS 基本培養(yǎng)基 +6-BA 2. Omg/L + IBA O. 2mg/L+AS 100 μ mol/L+30g/L 蔗糖+8g/L 瓊脂，ρΗ5· 4 5· 8 ;Α5、抗性芽篩選和再生恢復(fù)培養(yǎng)后，將轉(zhuǎn)化外植體轉(zhuǎn)入含篩選劑潮霉素(Hyg，25mg/L)和抑菌劑頭孢霉素(Cef，500 mg/L)的篩選培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)直到長出抗性芽，當(dāng)抗性芽長到Icm時，轉(zhuǎn)入含篩選劑潮霉素(Hyg，15mg/L)和抑菌劑頭孢霉素(Cef，250 mg/L)的擴(kuò)繁培養(yǎng)基中擴(kuò)繁至芽長到2-3cm，再轉(zhuǎn)入含篩選劑潮霉素(Hyg，10mg/L)和抑菌劑頭 孢霉素(Cef，250 mg/L)的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，直到長成完整的小植株；所述篩選培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基 +2. 0mg/L6-BA + O. 2mg/LIBA+0. O lmg/LTDZ+25mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂；pH5. 8 6. 0 ;擴(kuò)繁培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基 +2. Omg/L 6-BA + 0. 2mg/LIBA+0. 0 lmg/L TDZ+15mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L 鹿糖 +8g/L 瓊脂；pH5. 8 6. 0 ;生根培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+0. lmg/LNAA+10mg/L Hyg+250 mg/L Cef+蔗糖15g/L+8g/L 瓊脂，ρΗ5· 8-6. 0 ；A6、菊苣優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料的鑒定和篩選。所述的方法，步驟Al中，挑選飽滿的菊苣種子，依次進(jìn)行75 %的乙醇表面浸泡30s，升汞浸泡10分鐘，期間不停搖動，倒掉升汞，無菌水反復(fù)沖洗，最后用無菌水浸泡種子12h，倒掉浸泡液，用無菌濾紙吸干表面水分，接種于裝有高壓滅菌的Ms培養(yǎng)基的三角瓶中上，放于溫室中萌發(fā)，得到無菌實(shí)生苗；所述無菌實(shí)生苗培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+ 瓊脂 8g/L, pH 5. 8 6. O。所述的的方法，步驟A2中，選取菊苣無菌苗幼嫩葉片，切成0.5X0. 5cm小塊，將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2-3d，培養(yǎng)到葉片邊緣開始膨大；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +6-BA 2. 0mg/L+IBA 0. 2mg/L+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH 為 5. 8-6. O。具有培育周期短、效率高、成本低、對菊苣本身重要農(nóng)藝性狀影響小等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)將加速我國菊苣品種培育的進(jìn)程。該技術(shù)通過提高菊苣含硫氨基酸含量，降低飼料成本，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)飼料的綠色無公害生產(chǎn)，為畜牧業(yè)發(fā)展和人們生活提供充足的綠色蛋白質(zhì)原料來源，應(yīng)用前景廣闊。通過本發(fā)明的方法，測定數(shù)據(jù)結(jié)果(表I所示)表明在已檢測的12株轉(zhuǎn)zeolin基因菊苣中，有2株材料的含硫氨基酸總含量比對照分別提高了 7. 87%和13. 7%，選取這2株蛋氨酸和胱氨酸總含量顯著高于對照的轉(zhuǎn)基因菊苣植株即為菊苣優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)。


圖I為抗性芽的篩選和再生；
圖2為抗性芽的生根培養(yǎng)；圖3為轉(zhuǎn)zeolin基因菊苣煉苗
圖4為轉(zhuǎn)化菊苣DNA提?。粓D5為轉(zhuǎn)基因菊苣擴(kuò)繁植株RNA提取；圖6為轉(zhuǎn)zeolin基因菊苣的PCR電泳檢測；注M: DL 2000 DNA marker;P:pCB-zeolin (陽性對照的質(zhì)粒);CK:陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣)；I 5轉(zhuǎn)基因菊苣，該圖與擴(kuò)繁的P相同；圖7為轉(zhuǎn)Zeolin基因菊苣擴(kuò)繁植株RT-PCR檢測，注M: DL 2000 DNA marker;P:質(zhì)粒pCB-GFP-zeolin (陽性對照);CK:陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣)；I 4為轉(zhuǎn)基因菊苣擴(kuò)
繁植株；圖8為轉(zhuǎn)zeolin基因菊苣擴(kuò)繁植株Southern blotting檢測，注CK為ddH20, I和2為轉(zhuǎn)化植株；圖9為轉(zhuǎn)zeolin基因菊苣田間表現(xiàn)及篩選。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。I、菊苣無菌實(shí)生苗的獲得。挑選飽滿的菊苣種子，依次進(jìn)行75 %的乙醇表面浸泡30s，升汞浸泡10分鐘，期間不停搖動，倒掉升汞，無菌水反復(fù)沖洗，最后用無菌水浸泡種子12h，倒掉浸泡液，用無菌濾紙吸干表面水分，接種于裝有高壓滅菌的Ms培養(yǎng)基的三角瓶中上，放于溫室中萌發(fā)，得到無菌實(shí)生苗。所述無菌實(shí)生苗培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，pH 5. 8 6. O。2、葉片外植體預(yù)培養(yǎng)。選取菊苣無菌苗幼嫩葉片，切成0. 5X0. 5cm小塊，將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2-3d，培養(yǎng)到葉片邊緣開始膨大。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +6-BA 2. 0mg/L+IBA 0. 2mg/L+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH 為 5. 8-6. O ；3、轉(zhuǎn)化菌液的準(zhǔn)備。用無菌牙簽或接種針挑取含有外源基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落(參考文獻(xiàn)張玉，白史且，李聰?shù)?pCB-zeolin-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建及瞬時表達(dá)[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28 (03) :233-239。)，接種到50 mL含有硫酸鏈霉素(Str,50 mg/L)和卡那霉素(Kan, 50 mg/L)的液體YMB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)16 24h至對數(shù)生長期，將培養(yǎng)物于4000 5000 r/min離心10 min，去除上清液，收集菌體，用1/2MS無菌液體培養(yǎng)基重懸沉淀至0D600=0. 4Abs，用于侵染轉(zhuǎn)化；或直接用1/2MS無菌液體培養(yǎng)基稀釋菌液用于侵染。所述YMB培養(yǎng)基0. 5g/L K2HPO4 + O. 2g/L MgSO4 · 7H20 + O. 5g/LNaCl + lOg/LMannitol + 0.4g/LYeast extract, pH7. 5。4、外源基因的浸染轉(zhuǎn)化。無菌條件下，選取生長狀態(tài)良好的預(yù)培養(yǎng)外植體放入制備好的菌液中，使葉片外植體與菌液充分接觸，并放于震蕩培養(yǎng)箱上震蕩浸染IOmin ；浸染完后取出外植體，用滅菌濾紙吸去葉片表面附著的多余菌液(注意葉片不要在空氣中暴露時間太長，也不能吸得太干)，接種到墊有一層無菌濾紙且添加有乙酰丁香酮(AS，100umol/L)的共培養(yǎng)基上，于黑暗中共培養(yǎng)2-3d到肉眼有可見微菌落；共培養(yǎng)完后，將外植體接種到與預(yù)培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)l-2d。所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基 +6-BA 2. Omg/L + IBA 0. 2mg/L+AS 100 μ mol/L+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，ρΗ5· 4
5· 8ο5、抗性芽篩選和再生?；謴?fù)培養(yǎng)后，將轉(zhuǎn)化外植體轉(zhuǎn)入含篩選劑潮霉素(Hyg，25mg/L)和抑菌劑頭孢霉素(Cef，500 mg/L)的篩選培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)直到長出抗性芽，如圖I所示，從圖中可以看出，轉(zhuǎn)化的外植體經(jīng)過25mg/LHyg抗性篩選2周后，轉(zhuǎn)化體長出了帶有外源基因的抗性芽，4周后統(tǒng)計得出Hyg抗性芽發(fā)生率平均為13. 52%，比常規(guī)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化條件下的2. 95%提高了 3. 58倍。當(dāng)抗性芽長到Icm時，轉(zhuǎn)入含篩選劑潮霉素(Hyg，15mg/U和抑菌劑頭孢霉素(Cef，250 mg/L)的擴(kuò)繁培養(yǎng)基中擴(kuò)繁至芽長到2-3cm，再轉(zhuǎn)入含篩選劑潮霉素(Hyg，10mg/L)和抑菌劑頭孢霉素(Cef，250 mg/L)的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，直到長成完整的小植株，如圖2所示，抗性芽在含適當(dāng)頭孢和潮霉素的生根培養(yǎng)基中生根 長勢良好，統(tǒng)計得出生根率達(dá)到92. 56 %。所述篩選培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基 +2. 0mg/L6-BA + O. 2mg/LIBA+0. O lmg/LTDZ+25mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂；pH5. 8 6. 0 ;擴(kuò)繁培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基 +2. Omg/L 6-BA + 0. 2mg/LIBA+0. 0 lmg/L TDZ+15mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L 鹿糖 +8g/L 瓊脂；pH5. 8 6. 0 ;生根培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+0. lmg/LNAA+10mg/L Hyg+250 mg/L Cef+鹿糖15g/L+8g/L 瓊脂，ρΗ5· 8-6. O。6、菊苣優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料的鑒定和篩選。轉(zhuǎn)基因抗性小植株及未轉(zhuǎn)基因再生植株的對照經(jīng)過煉苗后移栽至溫室花盆，如圖3所示，從圖3可以看出經(jīng)過篩選得出的轉(zhuǎn)基因苗煉苗后植株成活良好，通過統(tǒng)計分析得出煉苗后植株成活率高達(dá)95%以上。對成活植株提取DNA，如圖4所示，進(jìn)行PCR檢測，PCR檢測結(jié)果如圖6所示，初步表明zeolin基因已經(jīng)被導(dǎo)入大部分菊苣基因組中，統(tǒng)計分析表明經(jīng)過潮霉素篩選為陽性的植株，PCR檢測的陽性率為46. 15% ;對PCR檢測為陽性的菊苣材料進(jìn)行Southern雜交檢測，檢測結(jié)果(圖7所示)表明zeolin基因以單拷貝的形式隨機(jī)整合進(jìn)菊苣基因組中；采用TRIzoI法，對以上檢測都為陽性的轉(zhuǎn)基因材料提取RNA(圖5所示)進(jìn)行RT-PCR檢測，檢測結(jié)果(圖8所示)表明轉(zhuǎn)zeolin基因的菊苣材料都擴(kuò)增出與質(zhì)粒大小相同的890bp的預(yù)期條帶，說明陽性轉(zhuǎn)基因菊苣材料將外源目的基因轉(zhuǎn)錄為mRNA，在核酸水平得到了表達(dá)。對穩(wěn)定表達(dá)的陽性轉(zhuǎn)基因植株移栽到田間掛牌標(biāo)記，在蓮座到抽薹期進(jìn)行刈割，烘干，粉碎，氧化水解，測定蛋氨酸和胱氨酸的含量(圖9所示)，測定數(shù)據(jù)結(jié)果(表I所示)表明在已檢測的12株轉(zhuǎn)zeolin基因菊苣中，有2株材料的含硫氨基酸總含量比對照分別提高了 7. 87%和13. 7%，選取這2株蛋氨酸和胱氨酸總含量顯著高于對照的轉(zhuǎn)基因菊苣植株即為菊苣優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)。表I 2株轉(zhuǎn)基因材料含硫氨基酸含量測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種利用植物基因工程技術(shù)培育菊苣優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下步驟:A1、菊苣無菌實(shí)生苗的獲得；A2、葉片外植體預(yù)培養(yǎng)； A3、轉(zhuǎn)化菌液的準(zhǔn)備用無菌牙簽或接種針挑取含有外源基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種到50 mL含有硫酸鏈霉素(Str, 50 mg/L)和卡那霉素(Kan, 50 mg/L)的液體YMB培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)16 24h至對數(shù)生長期，將培養(yǎng)物于4000飛000 r/min離心10 min，去除上清液，收集菌體，用1/2MS無菌液體培養(yǎng)基重懸沉淀至0D600=0.4Abs，用于侵染轉(zhuǎn)化；或直接用1/2MS無菌液體培養(yǎng)基稀釋菌液用于侵染；所述YMB培養(yǎng)基0. 5g/LK2HPO4 + 0. 2g/L MgSO4 *7H20 + 0. 5g/L NaCl + lOg/LMannitol + 0. 4g/LYeast extract,pH7. 5 ； A4、外源基因的浸染轉(zhuǎn)化無菌條件下，選取生長狀態(tài)良好的預(yù)培養(yǎng)外植體放入制備好的菌液中，使葉片外植體與菌液充分接觸，并放于震蕩培養(yǎng)箱上震蕩浸染IOmin ;浸染完后取出外植體，用滅菌濾紙吸去葉片表面附著的多余菌液，接種到墊有一層無菌濾紙且添加有こ酰丁香酮(AS，100umol/L)的共培養(yǎng)基上，于黑暗中共培養(yǎng)2_3d到肉眼有可見微菌落；共培養(yǎng)完后，將外植體接種到與預(yù)培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)l-2d ;所述共培養(yǎng)培 養(yǎng)基為MS 基本培養(yǎng)基 +6-BA 2. Omg/L + IBA 0. 2mg/L+AS 100 u mol/L+30g/L 蔗糖 +8g/L瓊脂，pH5. 4 5. 8 ; A5、抗性芽篩選和再生恢復(fù)培養(yǎng)后,將轉(zhuǎn)化外植體轉(zhuǎn)入含篩選劑潮霉素(Hyg,25mg/L)和抑菌劑頭孢霉素(Cef，500 mg/L)的篩選培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)直到長出抗性芽，當(dāng)抗性芽長到Icm吋，轉(zhuǎn)入含篩選劑潮霉素(Hyg，15mg/L)和抑菌劑頭孢霉素(Cef，250 mg/L)的擴(kuò)繁培養(yǎng)基中擴(kuò)繁至芽長到2-3cm，再轉(zhuǎn)入含篩選劑潮霉素(Hyg，I Omg/L)和抑菌劑頭孢霉素(Cef, 250 mg/L)的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，直到長成完整的小植株； 所述篩選培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+2. 0mg/L6-BA + 0. 2mg/LIBA+0. 01mg/LTDZ+25mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂；pH5. 8 6. 0 ; 擴(kuò)繁培養(yǎng)基MS 基本培養(yǎng)基 +2. 0mg/L 6-BA + 0. 2mg/LIBA+0. Olmg/L TDZ+15mg/LHyg+500 mg/L Cef+30g/L 鹿糖 +8g/L 瓊脂；pH5. 8 6. 0 ; 生根培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+0. lmg/LNAA+10mg/L Hyg+250 mg/L Cef+鹿糖 15g/L+8g/L 瓊脂，pH5. 8-6. 0 ； A6、菊苣優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料的鑒定和篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟Al中，挑選飽滿的菊苣種子，依次進(jìn)行75 %的こ醇表面浸泡30s，升汞浸泡10分鐘，期間不停搖動，倒掉升汞，無菌水反復(fù)沖洗，最后用無菌水浸泡種子12h，倒掉浸泡液，用無菌濾紙吸干表面水分，接種于裝有高壓滅菌的Ms培養(yǎng)基的三角瓶中上，放于溫室中萌發(fā)，得到無菌實(shí)生苗；所述無菌實(shí)生苗培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，pH 5. 8 6. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在干，步驟A2中，選取菊苣無菌苗幼嫩葉片，切成0. 5X0. 5cm小塊，將其接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2-3d，培養(yǎng)到葉片邊緣開始膨大；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+6-BA 2. 0mg/L+IBA 0. 2mg/L+30g/L蔗糖+8g/L瓊月旨，pH 為 5. 8-6.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用植物基因工程技術(shù)培育菊苣優(yōu)質(zhì)新種質(zhì)的方法，包括以下步驟A1、菊苣無菌實(shí)生苗的獲得；A2、葉片外植體預(yù)培養(yǎng)；A3、轉(zhuǎn)化菌液的準(zhǔn)備；A4、外源基因的浸染轉(zhuǎn)化；A5、抗性芽篩選和再生；A6、菊苣優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料的鑒定和篩選。本發(fā)明具有培育周期短、效率高、成本低、對菊苣本身重要農(nóng)藝性狀影響小等優(yōu)點(diǎn),該技術(shù)將加速我國菊苣品種培育的進(jìn)程。該技術(shù)通過提高菊苣含硫氨基酸含量，降低飼料成本，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)飼料的綠色無公害生產(chǎn)，為畜牧業(yè)發(fā)展和人們生活提供充足的綠色蛋白質(zhì)原料來源，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號A01H4/00GK102776233SQ20121028873
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月14日
發(fā)明者張玉, 方鵬飛, 李達(dá)旭, 白史且, 鄧永昌 申請人:四川省草原科學(xué)研究院