專(zhuān)利名稱(chēng)：一種促進(jìn)玻璃化超低溫保存的外源物質(zhì)的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玻璃化超低溫保存領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)玻璃化超低溫保存的外源物質(zhì)的篩選方法。
背景技術(shù)：
種質(zhì)資源(Germplasm resources)是決定生物種性并將其豐富的遺傳信息從親代傳給子代的遺傳物質(zhì)的總稱(chēng)，是物種進(jìn)化、遺傳學(xué)研究和植物育種的物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源保存是我國(guó)社會(huì)、生態(tài)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。
超低溫保存(Cryopreservation)是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)現(xiàn)代種質(zhì)資源離體保存技術(shù)。通常在液氮中保存，被保存材料細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止，處在相對(duì)穩(wěn)定的生物學(xué)狀態(tài)，達(dá)到長(zhǎng)期保存種質(zhì)的目的，超低溫保存是目前唯一不需要連續(xù)繼代的中長(zhǎng)期保存方式。玻璃化法(Vitrification)超低溫保存是將細(xì)胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護(hù)劑組成的玻璃化溶液(Plant Vitrification Solutions, PVS)中，使材料及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下固化成非結(jié)晶的玻璃化態(tài)，并以這種玻璃態(tài)在低溫下保存。玻璃化法因操作簡(jiǎn)單快捷，成本低，適宜保存種類(lèi)廣泛，保存材料遺傳性穩(wěn)定，保存效果好等優(yōu)點(diǎn)，是近十年來(lái)用于優(yōu)良種質(zhì)資源中長(zhǎng)期保存的首選方法。國(guó)內(nèi)外先后對(duì)200多種植物的不同外植體進(jìn)行了超低溫保存技術(shù)研究，但有些植物(如熱帶植物或者含水量高的植物)恢復(fù)培養(yǎng)后成活率不高或根本不能成活，添加一定的外源物質(zhì)有利于提高超低溫保存成活率，但如何從眾多可添加的外源物質(zhì)中篩選出效果較好的幾種，一般離體組織篩選外源物質(zhì)，組織或細(xì)胞超低溫保存后活性檢測(cè)手段不夠直接，并存在一定誤差，而直接觀察恢復(fù)生長(zhǎng)情況又較慢，并且很多進(jìn)行超低溫保存的材料為珍稀瀕危保護(hù)植物，不能用大量材料消耗去篩選有效的外源物質(zhì)建立超低溫保存體系，以上原因大大制約了有效外源物質(zhì)篩選及超低溫保存體系建立的效率。而擬南芥幼苗的玻璃化法超低溫保存研究發(fā)現(xiàn)了一套超低溫保存標(biāo)準(zhǔn)體系，用于篩選外源物質(zhì)及作為研究對(duì)象進(jìn)行深入的超低溫保存機(jī)理研究，可為植物超低溫保存技術(shù)體系的建立及優(yōu)化提供科學(xué)的理論依據(jù)，最終實(shí)現(xiàn)快速高效的優(yōu)良植物種質(zhì)資源中長(zhǎng)期離體保存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有超低溫保存體系的上述不足，提供一種促進(jìn)玻璃化超低溫保存的外源物質(zhì)的篩選方法，為有效外源物質(zhì)的篩選提供了一條新途徑，對(duì)植物種質(zhì)資源保存起到了指導(dǎo)的作用。本發(fā)明首先公開(kāi)了一種促進(jìn)玻璃化超低溫保存的外源物質(zhì)的篩選方法，為以擬南芥幼苗為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將外源物質(zhì)添加到玻璃化溶液中用于擬南芥幼苗的玻璃化超低溫保存，以不添加外源物質(zhì)處理的擬南芥幼苗為對(duì)照，通過(guò)恢復(fù)生長(zhǎng)率的比較評(píng)價(jià)外源物質(zhì)的效果。
較優(yōu)的，所述篩選方法具體步驟如下I)擬南芥幼苗的獲得將擬南芥種子春化處理后，培養(yǎng)O 72h，獲得不同苗齡的擬南芥幼苗；2)將不同苗齡的擬南芥幼苗分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行玻璃化超低溫保存，實(shí)驗(yàn)組的玻璃化溶液中添加外源物質(zhì)，對(duì)照組不添加；3)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組玻璃化超低溫保存后的幼苗解凍、恢復(fù)培養(yǎng)后，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組內(nèi)苗齡相同的擬南芥幼苗的恢復(fù)生長(zhǎng)率。較優(yōu)的，步驟I)所述擬南芥種子是經(jīng)過(guò)消毒的擬南芥種子，所述消毒的方法為用65 75%乙醇消毒10 30s,無(wú)菌水沖洗2 4遍后再用含15 25wt%NaC10及O O. 03wt%Tween20的水溶液消毒5 15min,無(wú)菌水沖洗5 6遍。更優(yōu)的，步驟I)所述擬南芥種子是經(jīng)過(guò)消毒的擬南芥種子，所述消毒的方法為用 70%乙醇消毒15s，無(wú)菌水沖洗4遍后再用含20wt%NaC10及O. 01wt%Tween 20的水溶液消毒IOmin,無(wú)菌水沖洗6遍。較優(yōu)的，步驟I)所述春化條件為O 10°C，春化處理時(shí)間為24 72h。更優(yōu)的，步驟I)所述春化條件為4°C，春化處理時(shí)間為48h。較優(yōu)的，步驟I)所述培養(yǎng)是在MS固體培養(yǎng)基上，每天先光照培養(yǎng)8 12h，光強(qiáng)100 200 μ mo I πΓ2，培養(yǎng)溫度20 27°C ;然后黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20 25°C。更優(yōu)的，步驟I)所述培養(yǎng)是在MS固體培養(yǎng)基上，每天先光照培養(yǎng)8h，光強(qiáng)150 μ molnT2，培養(yǎng)溫度25°C ;然后黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20°C。春化后的種子在MS固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng),按一天(24h)為單位,先進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照后，當(dāng)天剩余的時(shí)間進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，一天結(jié)束后，再進(jìn)行第二天的光照培養(yǎng)，這樣光照培養(yǎng)與黑暗培養(yǎng)交替進(jìn)行。例如先光照培養(yǎng)8h，然后黑暗培養(yǎng)的時(shí)間為16h，如此交替進(jìn)行。較優(yōu)的，步驟I)獲得的擬南芥幼苗的苗齡分別為0、48、51、54、57、60、63、66、69、72h。更優(yōu)的，步驟I)獲得的擬南芥幼苗的苗齡分別為60、63、66、69、72h。最優(yōu)的，步驟I)獲得的擬南芥幼苗的苗齡分別為60h和72h。較優(yōu)的，步驟2)所述玻璃化超低溫保存方法為將擬南芥幼苗放入裝載液中，室溫處理20 30min ;將裝載液吸除后，加入玻璃化溶液(TC處理40 60min ;將置于玻璃化溶液中的擬南芥幼苗放入液氮中保存O. 5 2h。更優(yōu)的，步驟2)所述玻璃化超低溫保存方法為將擬南芥幼苗放入裝載液中，室溫處理20min ;將裝載液吸除后，加入玻璃化溶液0°C處理50min ;將置于玻璃化溶液中的擬南芥幼苗放入液氮中保存Ih。較優(yōu)的，步驟2)所述裝載液為含有2M甘油，O. 4M蔗糖的MS培養(yǎng)液；所述玻璃化溶液為含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v 二甲基亞砜和O. 4M蔗糖的MS培養(yǎng)液。上述玻璃化溶液為對(duì)照組使用的，不包括外源物質(zhì)的玻璃化溶液；實(shí)驗(yàn)組所使用的玻璃化溶液還需要在上述玻璃化溶液的基礎(chǔ)上，加入待篩選的外源物質(zhì)。較優(yōu)的，步驟3)所述解凍方法為將超低溫保存的擬南芥幼苗從液氮中取出，35 40°C水浴解凍60 120s ;將玻璃化溶液吸除，加入洗滌液室溫處理30 50min，每隔5 IOmin換一次洗滌液；所述洗滌液為含有I. O I. 2M蔗糖的MS培養(yǎng)液。更優(yōu)的，步驟3)所述解凍方法為將超低溫保存的擬南芥幼苗從液氮中取出，40° C水浴解凍90s ;將玻璃化溶液吸除，加入洗滌液室溫處理40min，每隔IOmin換一次洗滌液，所述洗滌液為含有I. 2M蔗糖的MS培養(yǎng)液。冷凍管于水浴鍋中解凍時(shí)需要不時(shí)輕輕搖動(dòng)。步驟3)擬南芥幼苗的恢復(fù)培養(yǎng)條件范圍同步驟I)擬南芥種子的培養(yǎng)條件，具體如下較優(yōu)的，步驟3)所述恢復(fù)培養(yǎng)為將洗滌后的幼苗移到MS固體培養(yǎng)基中，每天先光照培養(yǎng)8 12h，光強(qiáng)100 200 μ mo I m_2，培養(yǎng)溫度20 27°C ;然后黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 20 25°C。 更優(yōu)的，步驟3)所述恢復(fù)培養(yǎng)為將洗滌后的幼苗移到MS固體培養(yǎng)基中，每天先光照培養(yǎng)8h，光強(qiáng)150 μ mo I πΓ2，培養(yǎng)溫度25°C ;然后黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20°C。較優(yōu)的，步驟3)在擬南芥幼苗恢復(fù)培養(yǎng)的第15天統(tǒng)計(jì)成活的擬南芥幼苗的數(shù)量，計(jì)算恢復(fù)生長(zhǎng)率，所述恢復(fù)生長(zhǎng)率=成活的幼苗數(shù)量/幼苗總數(shù)量X 100%。本發(fā)明篩選方法的標(biāo)準(zhǔn)為比較苗齡相同的擬南芥幼苗未添加外源物質(zhì)處理(對(duì)照組)和添加外源物質(zhì)處理(實(shí)驗(yàn)組)后，恢復(fù)生長(zhǎng)率的變化，使對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)生長(zhǎng)率變化較大的外源物質(zhì)為有效的外源物質(zhì)。較優(yōu)的，比較60h苗齡的擬南芥幼苗未添加外源物質(zhì)處理(對(duì)照組)和添加外源物質(zhì)處理(實(shí)驗(yàn)組)的恢復(fù)生長(zhǎng)率變化，60h苗齡擬南芥幼苗對(duì)照組的恢復(fù)生長(zhǎng)率小于等于25%，添加外源物質(zhì)處理后，使擬南芥幼苗恢復(fù)生長(zhǎng)率增大到大于等于50%的外源物質(zhì)為有效的外源物質(zhì)。較優(yōu)的，本發(fā)明所使用的擬南芥為擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Arabidopsisthaliana ecotype Col_0)o較優(yōu)的，步驟2)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組內(nèi)，苗齡相同的擬南芥幼苗分別設(shè)3 5個(gè)重復(fù)。本發(fā)明所使用的MS固體培養(yǎng)基為IL培養(yǎng)基中含有1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4, 370mg MgSO4 · 7H20，440mg CaCl2 · 2H20 (以上 5 種成分為大量元素)，37. 3mgNa2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌醇，0. 5mg 煙酸，0. 5mg 鹽酸吡哆醇，0. Img 鹽酸硫胺素，2mg 甘氨酸，O. 83mgKI, 6. 2mg H3BO3, 22. 3mg MnSO4 · 4H20,8. 6mg ZnSO4 · 7H20,0. 25mgNa2MoO4 ·2Η20，0· 025mg CuSO4 ·5Η20，0· 025mg CoCl2 .6H20，30g 蔗糖，IOg 瓊脂粉，余量為水，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5. 8。本發(fā)明所使用的MS培養(yǎng)液為IL培養(yǎng)基中含有1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4, 370mg MgSO4 · 7H20，440mg CaCl2 · 2H20 (以上 5 種成分為大量元素)，37. 3mgNa2EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌醇，0. 5mg 煙酸，0. 5mg 鹽酸吡哆醇，0. Img 鹽酸硫胺素，2mg 甘氨酸，O. 83mgKI, 6. 2mg H3BO3, 22. 3mg MnSO4 · 4H20,8. 6mg ZnSO4 · 7H20,0. 25mgNa2MoO4 ·2Η20，0· 025mg CuSO4 ·5Η20，0· 025mg CoCl2 ·6Η20，余量為水，調(diào)整培養(yǎng)基 pH 為 5. 8。本發(fā)明第二方面還公開(kāi)了抗壞血酸(VC)、脫落酸(ΑΒΑ)、甜菜堿(GB)或還原型谷胱甘肽(GSH)在玻璃化超低溫保存中的應(yīng)用。較優(yōu)的，所述應(yīng)用具體為抗壞血酸(VC)、脫落酸(ΑΒΑ)、甜菜堿(GB)或還原型谷胱甘肽(GSH)作為玻璃化溶液外源物質(zhì)的應(yīng)用。更優(yōu)的，所述抗壞血酸的濃度為ImM、所述脫落酸的濃度為I μ Μ、所述甜菜堿的濃度為10mM、所述還原型谷胱甘肽的濃度為O. 16mM。本發(fā)明篩選方法篩選到的外源物質(zhì)能夠有效提高擬南芥幼 苗的恢復(fù)生長(zhǎng)率，在擬南芥幼苗的玻璃化超低溫保存中，將苗齡60h的擬南芥幼苗的恢復(fù)生長(zhǎng)率提高2倍左右，或者將苗齡72h的擬南芥幼苗的恢復(fù)生長(zhǎng)率從O提聞到O以上，最聞可以提聞到14. 3%。并且本發(fā)明以擬南芥作為研究對(duì)象，篩選得到了具有廣泛超低溫保存效果的外源物質(zhì)，不僅可應(yīng)用于擬南芥的超低溫保存，還可以應(yīng)用于其他植物物種的超低溫保存，例如亞熱帶植物(大苞鞘石斛)或者熱帶植物(百子蓮)，或者還可以應(yīng)用于不同植物外植體(例如胚性愈傷組織、原球莖等)的超低溫保存，應(yīng)用范圍廣?？梢?jiàn)，本發(fā)明的促進(jìn)玻璃化超低溫保存的外源物質(zhì)的篩選方法，結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣，可成批量進(jìn)行篩選，效率高，為外源物質(zhì)的篩選提供了一條有效途徑，為玻璃化超低溫保存技術(shù)的優(yōu)化提供了技術(shù)保證，將對(duì)植物種質(zhì)資源保存起到指導(dǎo)作用。


圖I :對(duì)照組擬南芥不同苗齡幼苗超低溫保存恢復(fù)生長(zhǎng)率變化趨勢(shì)2 :對(duì)照組擬南芥不同苗齡幼苗超低溫保存恢復(fù)生長(zhǎng)照片圖3 :不同外源物質(zhì)對(duì)擬南芥萌發(fā)60h幼苗超低溫保存后恢復(fù)生長(zhǎng)率的影響(CK為未添加外源物質(zhì)的超低溫保存體系)圖4 :不同外源物質(zhì)對(duì)擬南芥萌發(fā)72h幼苗超低溫保存后恢復(fù)生長(zhǎng)率的影響
具體實(shí)施例方式在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式
之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例II.實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)對(duì)象擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Arabidopsis thaliana ecotype Col_0)。實(shí)驗(yàn)試劑I)裝載液含有2M甘油，O. 4M蔗糖的MS培養(yǎng)液；2)玻璃化溶液含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v 二甲基亞砜和O. 4M蔗糖的MS培養(yǎng)液；3)洗滌液添加有I. 2M蔗糖的MS培養(yǎng)液和添加有I. OM蔗糖的MS培養(yǎng)液；4)MS 固體培養(yǎng)基IL 培養(yǎng)基中含有 1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4,370mg MgSO4 · 7H20，440mg CaCl 2 · 2H20，37. 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌酉享,0. 5mg煙酸,0. 5mg鹽酸卩比卩多醇,0. Img鹽酸硫胺素，2mg甘氨酸，O. 83mgKI,6. 2mg H3BO3,22. 3mg MnSO4 · 4H20，8. 6mg ZnSO4 · 7H20，0. 25mg Na2MoO4 · 2H20，0. 025mg CuSO4 · 5H20，0. 025mg CoCl 2 · 6H20, 30g蔗糖，IOg瓊脂粉，余量為水，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5. 8 ;5) MS 培養(yǎng)液1L 培養(yǎng)基中含有 1900mg KNO3,1650mg NH4NO3,170mg KH2PO4, 370mgMgSO4 · 7H20，440mg CaCl2 · 2Η20，37· 3mg Na2-EDTA, 27. 8mg FeSO4 · 7H20, IOOmg 肌醇，0. 5mg煙酸,0. 5mg鹽酸批卩多醇，0. Img鹽酸硫胺素，2mg甘氨酸，O. 83mgKI,6. 2mg H3BO3, 22. 3mgMnSO4 · 4H20，8. 6mg ZnSO4 · 7H20，0. 25mg Na2MoO4 · 2H20，0. 025mg CuSO4 · 5H20，0. 025mgCoCl2 · 6H20，余量為水，調(diào)整培養(yǎng)基pH為5. 8。2.篩選方法I)擬南芥幼苗的獲得將擬南芥種子用70%乙醇消毒15s，無(wú)菌水沖洗4遍后再用含20wt%NaC10和O. 01wt%Tween 20的水溶液消毒lOmin，無(wú)菌水沖洗6遍；然后將消毒后的種子在4°C春化48h,置于MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),培養(yǎng)條件為每天光照培養(yǎng)8h,光強(qiáng)150 μ mo I m_2，培養(yǎng)溫度25°C;然后黑暗培養(yǎng)16h，培養(yǎng)溫度為20°C，將種子培養(yǎng)O 72h(本實(shí)施例具體選取了培養(yǎng)0h、48h、51h、54h、57h、60h、63h、66h、69h、72h)，獲得不同苗齡的擬南芥幼苗。2)將不同苗齡的擬南芥幼苗分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同一苗齡的幼苗設(shè)3個(gè)平行，將50株幼苗放入裝有Iml裝載液的2ml冷凍管中，室溫處理20min ;將裝載液吸除，加入玻璃化溶液，0° C處理50min ;將冷凍管投入液氮中保存lh。實(shí)驗(yàn)組的玻璃化溶液中添加有外源物質(zhì)(I μ M脫落酸Abscisic acid, ABA ；lmMCaCl2 ；10mM KNO3 ;6mM硫辛酸 Lipoic acid ；0. 16mM 還原型谷胱甘肽 GSH ; ImM 抗壞血酸 VC ；IOmM舌甘菜喊Glycine betaine, GB ；6mM聚乙烯卩比咯燒酮PVP ；0. I μ M裡黑素Melatonin,見(jiàn)表I)。3)冷凍管于液氮中保存Ih后，取出冷凍管，快速放入35 40° C水浴鍋中，解凍90s，并不時(shí)輕輕搖動(dòng)；將玻璃化溶液吸除，加入洗滌液，室溫處理30 40min，每隔5 IOmin換一次洗漆液；洗漆后的幼苗移到MS固體培養(yǎng)基中,放入植物培養(yǎng)箱,培養(yǎng)箱各項(xiàng)參數(shù)同種子萌發(fā)條件(每天光照培養(yǎng)12h，光強(qiáng)lOOymol m_2，培養(yǎng)溫度20°C ;然后黑暗培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度為25°C);擬南芥幼苗恢復(fù)培養(yǎng)15天后，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組內(nèi)擬南芥幼苗的恢復(fù)生長(zhǎng)率，并比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組內(nèi)苗齡相同的擬南芥幼苗的恢復(fù)生長(zhǎng)率。對(duì)照組O 72h苗齡的擬南芥幼苗的恢復(fù)生長(zhǎng)率曲線(xiàn)如圖I所示。實(shí)驗(yàn)組60h苗齡和72h苗齡的擬南芥幼苗的恢復(fù)生長(zhǎng)率見(jiàn)表2。表I實(shí)驗(yàn)組玻璃化溶液中添加的外源物質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)玻璃化超低溫保存的外源物質(zhì)的篩選方法，其特征在于，為以擬南芥幼苗為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將外源物質(zhì)添加到玻璃化溶液中用于擬南芥幼苗的玻璃化超低溫保存，以不添加外源物質(zhì)處理的擬南芥幼苗為對(duì)照，通過(guò)恢復(fù)生長(zhǎng)率的比較評(píng)價(jià)外源物質(zhì)的效果。
2.如權(quán)利要求I所述的篩選方法，其特征在于，具體步驟如下 1)擬南芥幼苗的獲得將擬南芥種子春化處理后，培養(yǎng)O 72h，獲得不同苗齡的擬南芥幼苗； 2)將不同苗齡的擬南芥幼苗分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行玻璃化超低溫保存，實(shí)驗(yàn)組的玻璃化溶液中添加外源物質(zhì)，對(duì)照組不添加； 3)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組玻璃化超低溫保存后的幼苗解凍、恢復(fù)培養(yǎng)后，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組內(nèi)苗齡相同的擬南芥幼苗的恢復(fù)生長(zhǎng)率。
3.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟I)所述春化條件為O 10°C，春化處理時(shí)間為24 72h。
4.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟I)所述培養(yǎng)是在MS固體培養(yǎng)基上，每天先光照培養(yǎng)8 12h，光強(qiáng)100 200μπιο1 πΓ2，培養(yǎng)溫度20 27°C ;然后黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20 25°C。
5.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟I)獲得的擬南芥幼苗的苗齡分別為 0、48、51、54、57、60、63、66、69、72h。
6.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟2)所述玻璃化超低溫保存方法為將擬南芥幼苗放入裝載液中，室溫處理20 30min ;將裝載液吸除后，加入玻璃化溶液0°C處理40 60min ;將置于玻璃化溶液中的擬南芥幼苗放入液氮中保存O. 5 2h。
7.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟2)所述裝載液為含有2M甘油，O. 4M蔗糖的MS培養(yǎng)液；所述玻璃化溶液為含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v 二甲基亞砜和O. 4M蔗糖的MS培養(yǎng)液。
8.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟3)所述解凍方法為將超低溫保存的擬南芥幼苗從液氮中取出，35 40°C水浴解凍60 120s ;將玻璃化溶液吸除，加入洗滌液室溫處理30 50min，每隔5 IOmin換一次洗滌液；所述洗滌液為含有I. O I. 2M蔗糖的MS培養(yǎng)液。
9.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟3)所述恢復(fù)培養(yǎng)為將洗滌后的幼苗移到MS固體培養(yǎng)基中，每天先光照培養(yǎng)8 12h，光強(qiáng)100 200ymol m_2，培養(yǎng)溫度20 27°C ;然后黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20 25°C。
10.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，在擬南芥幼苗恢復(fù)培養(yǎng)的第15天統(tǒng)計(jì)成活的擬南芥幼苗的數(shù)量，計(jì)算恢復(fù)生長(zhǎng)率，所述恢復(fù)生長(zhǎng)率=成活的幼苗數(shù)量/幼苗總數(shù)量 X 100%O
11.權(quán)利要求1-10任一權(quán)利要求所述篩選方法篩選獲得的抗壞血酸、脫落酸、甜菜堿、還原型谷胱甘肽之任一在玻璃化超低溫保存中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及玻璃化超低溫保存領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)玻璃化超低溫保存的外源物質(zhì)的篩選方法，為以擬南芥幼苗為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將外源物質(zhì)添加到玻璃化溶液中用于擬南芥幼苗的玻璃化超低溫保存，以不添加外源物質(zhì)處理的擬南芥幼苗為對(duì)照，通過(guò)恢復(fù)生長(zhǎng)率的比較評(píng)價(jià)外源物質(zhì)的效果。本發(fā)明為促進(jìn)玻璃化超低溫保存的外源物質(zhì)的篩選方法，結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣，可成批量進(jìn)行篩選，效率高，為外源物質(zhì)的篩選提供了一條有效途徑，為玻璃化超低溫保存技術(shù)的優(yōu)化提供了技術(shù)保證，將對(duì)植物種質(zhì)資源保存起到指導(dǎo)作用。
文檔編號(hào)A01N3/00GK102823581SQ20121034270
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者申曉輝, 任麗, 張荻 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)