專利名稱：一種向植物葉片注入外源物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種向植物葉片注入外源物的方法，具體而言是一種通過(guò)在多微孔軟 塑料載體的微孔內(nèi)形成正負(fù)壓，高效、簡(jiǎn)便和微損傷地向植物葉片注入小分子成分，或蛋白 質(zhì)，或核酸，或質(zhì)粒，或病毒，或細(xì)菌，或真菌等外源物的方法。本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)及生物技術(shù) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程往往會(huì)受到外源物侵入的影響。人為地將小分子成分、或蛋白 質(zhì)、或核酸、或質(zhì)粒、病毒、細(xì)菌、真菌等外源物引入到植物葉片中，這是研究和利用這些外 源物功能特征的先決條件。但是由于植物葉片本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用常規(guī)的噴施、浸泡、涂 抹等方法很難有效地將一些外源物，特別是大分子外源物轉(zhuǎn)入葉片組織中；同時(shí)由于植物 葉片幼嫩，葉片薄，可接觸面積小等原因，現(xiàn)有的外源物注入方法，如機(jī)械損傷涂抹法(中 國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?200810233643. 5)、針刺注入法(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?200910025033. 0)、基因 槍注入法等，均存在不同程度的效率低下、操作繁瑣、傷害植物等問(wèn)題。已有的文獻(xiàn)(鄧恩 新，王文忠，王智圻.一種簡(jiǎn)易的向植物薄葉片內(nèi)注入溶液的裝置.植物生理學(xué)通訊，1992， 28 296.)曾報(bào)道利用注射器、舌鉗和橡膠墊圈等工具，借助壓力將液體樣品通過(guò)氣孔壓入 葉片內(nèi)，但這類方法極易對(duì)注射孔四周的葉片組織造成損傷，且單純施加正壓難以有效地 將外源物送入葉片細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)。因此，極有必要建立高效和簡(jiǎn)便的向植物葉片注入 外源物的技術(shù)方法，用于研究及利用這些外源物在植物葉片中的功能特征。采用含有外源物液體的多微孔軟塑料載體及注入裝置，均勻地對(duì)葉片施加正壓和 負(fù)壓，可最大限度地減少對(duì)葉片的機(jī)械損傷，更有效地將外源物送入葉片內(nèi)。與本發(fā)明有關(guān) 的注入裝置制作簡(jiǎn)單方便，外源物的檢測(cè)方法極易從相關(guān)科學(xué)書籍和文獻(xiàn)中獲得，用于本 發(fā)明的不同規(guī)格的具有回彈特性的多微孔軟載體也極易從相關(guān)市場(chǎng)獲得或?qū)嶒?yàn)室自己加 工制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，結(jié)合植物葉片的特點(diǎn)，采用具有回彈特性的多 微孔軟聚氯乙烯等軟塑料載體的正負(fù)壓注入法(Positive and NegativePressure Introduction by Using Soft Polyvinyl Chloride withMulti-Micro—Tubules, PNPi-SPCT，PNPi)，實(shí)現(xiàn)了高效、簡(jiǎn)便和微損傷地向植物葉片注入外源物的目標(biāo)。因此，本發(fā)明提供了一種高效、簡(jiǎn)便、微損傷的向植物葉片注入外源物的方法。步 驟包括(1)根據(jù)外源物和葉片的種類和特性，選擇具有一定體積、軟硬程度的具有回彈 特性的多微孔軟塑料載體，一般采用軟聚氯乙烯載體，其外表應(yīng)光滑無(wú)孔，內(nèi)部微孔孔徑約 1-100微米；(2)制備不同形狀和特點(diǎn)的用于固定多微孔軟塑載體的注入裝置；
(3)將多微孔軟塑料載體固定到注入裝置上；(4)將外源物吸附到具有彈性的多微孔軟塑料載體中；(5)將含外源物液體的多微孔軟塑料載體的微孔開口面緊貼植物葉片表面；(6)根據(jù)外源物和葉片的種類和特性，用一定的頻率和力度擠壓注入裝置，通過(guò)擠 壓在多微孔軟塑料載體的微孔內(nèi)形成正負(fù)壓，將含有外源物的液體注入葉片中。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟1中的多微孔軟塑料載體可以直接從市場(chǎng)購(gòu)買，也可以 自己根據(jù)化學(xué)合成步驟合成，或根據(jù)實(shí)際需求向塑料制造商定制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟2中的注入裝置根據(jù)需要可以在鑷式簡(jiǎn)易注入裝置、 剪式簡(jiǎn)易注入裝置和帶護(hù)管的鑷型注入裝置三種不同特點(diǎn)的注入裝置中進(jìn)行選擇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物材料可以是小麥葉片，水稻葉片，玉米葉片，大豆葉片， 煙草葉片等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用注入器將外源物吸附到多微孔的軟塑料載體中，優(yōu) 選用移液器。在另一個(gè)實(shí)施方案中，擠壓頻率、擠壓次數(shù)和擠壓時(shí)間可以根據(jù)葉片的韌度和幼 嫩程度進(jìn)行調(diào)整。


圖1:鑷式簡(jiǎn)易注入裝置1-多微孔軟塑料載體；2-硬塑料板；3-固定螺絲；4-鑷片；圖2:剪式簡(jiǎn)易注入裝置1-多微孔軟塑料載體；2-硬塑料板；3-固定螺絲；4-薄鋼板；5-連接軸；6-手持把；圖3 帶護(hù)套的鑷式注入裝置的制作(一)1-活塞；2-護(hù)套；3-多微孔軟塑料載體；4-橡皮帶；5-固定栓；6-支持板；7-螺栓；8-角度墊片；9-固定夾卡；10-角度墊片；11-螺母；12-螺孔；13-鑷片；14-螺栓滑槽；圖4 帶護(hù)套的鑷式注入裝置的制作(二)1-活塞；2-護(hù)套；3-多微孔軟塑料載體；4-橡皮帶；5-固定栓；6-支持板；7-螺栓；8-螺母；9-固定夾卡；10-墊片；11_螺孔；12-鑷板；13-螺栓滑槽；14-連接螺絲；
具體實(shí)施例方式下面，本發(fā)明將實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但是它不限于這些實(shí)施例的任一個(gè)或類 似實(shí)例。實(shí)施例1 鑷式簡(jiǎn)易注入裝置的制作取一條2mm厚，寬20mm，長(zhǎng)360mm的薄鋼板，用管鉗在中間彎曲成30度，形成鑷形， 并且兩端彎曲一定的鈍角，使兩端平行。兩端分別用螺絲固定150x150mm方形硬塑料板，并 將多微孔軟塑料載體固定在硬塑料板上。通過(guò)用手使用一定的頻率、力度擠壓鋼板中央，將 外源物從微孔軟塑料載體中注入到小麥葉片中。如附圖1。
實(shí)施例2 剪式簡(jiǎn)易注入裝置的制作分別取兩塊2mm厚，寬20mm，長(zhǎng)180mm的薄鋼板，在鋼板中央用連接軸將兩塊鋼板 連接，兩鋼板可以在一定的角度內(nèi)活動(dòng)。每鋼板兩端彎曲一定的鈍角，使兩端平行。一端分 別用螺絲固定150x150mm方形硬塑料板，并將多微孔軟塑料載體固定在硬塑料板上。通過(guò) 用手使用一定的頻率、力度擠壓另一端的手持把將外源物從微孔軟塑料載體中注入到小麥 葉片中。如附圖2。實(shí)施例3 帶護(hù)套的鑷式注入裝置的制作取兩塊2mm厚，寬20mm，長(zhǎng)180mm的薄鋼板，用管鉗將鋼板兩端彎曲成鈍角，并且平 行，形成一副鑷片。鑷片的一端切割成弧形，并且做一個(gè)寬3mm，長(zhǎng)20mm的螺栓滑槽。另取 兩塊2mm厚，寬20mm，長(zhǎng)160mm的薄鋼板，一端彎曲成比鑷片小一些鈍角，另一端切割成30 度角的楔形槽，并連接一條橡皮帶，將護(hù)管固定在楔形槽內(nèi)。將圓形的微孔軟塑料載體放在 護(hù)管內(nèi)，用活塞輕輕的接觸到微孔軟塑料載體，用螺絲將表面光滑的活塞連接到鑷片上，然 后用長(zhǎng)螺母將四片鋼板連接固定。用三叉狀的固定夾卡在護(hù)套支板上，調(diào)節(jié)固定夾的上下 位置使護(hù)管貼在葉片的兩側(cè)。用手使用一定的頻率，力度擠壓鑷片，通過(guò)活塞擠壓多微孔軟 塑料載體將外源物注入到葉片內(nèi)。如附圖3。實(shí)施例4 帶護(hù)套的鑷式注入裝置的制作取兩塊2mm厚，寬20mm，長(zhǎng)180mm的薄鋼板，用管鉗將鋼板一端彎曲成鈍角，形成 一副鑷片。鑷片的一端切割成弧形，并且做一個(gè)寬3mm，長(zhǎng)20mm的螺栓滑槽。另取兩塊2mm 厚，寬20mm，長(zhǎng)160mm的薄鋼板，一端彎曲成比鑷片小一些鈍角，另一端切割成30度角的楔 形槽，并連接一條橡皮帶，將護(hù)管固定在楔形槽內(nèi)。將圓形的微孔軟塑料載體放在護(hù)管內(nèi)， 用活塞輕輕的接觸到微孔軟塑料載體，用螺絲將表面光滑的活塞連接到鑷片上，然后用長(zhǎng) 螺母將四片鋼板連接固定，并通過(guò)中間角度不同的墊片使兩副鋼板形成不同的角度。用三 叉狀的固定夾卡在護(hù)套支板上，調(diào)節(jié)固定夾的上下位置使護(hù)管貼在葉片的兩側(cè)。用手使用 一定的頻率，力度擠壓鑷片，通過(guò)活塞擠壓多微孔軟塑料載體將外源物注入到葉片內(nèi)。如附 圖4。實(shí)施例5 利用簡(jiǎn)易注入器向小麥葉片注入高鹽用去離子水配制0. 5M、IM的NaCl的高鹽溶液，用0. 45um的濾膜過(guò)濾除熱源，置4 度冰箱備用。所用的材料是小麥Taichimg^，小麥種子經(jīng)浸種、催芽后種于口徑IOcm花盆 中，至于室溫(溫度晝15 18°C /夜11 14°C，光照強(qiáng)度6000Lx，光照時(shí)間14h)，當(dāng)幼 苗長(zhǎng)至1葉期作為實(shí)驗(yàn)植物材料。分別用移液器把0. 5ml的去離子水和0. 5M、1M的NaCl 的高鹽溶液吸附到具有彈性的多微孔軟塑料的微孔載體中，將微孔載體放置在小麥葉片兩 側(cè)，用帶無(wú)粉乳膠手套以每分鐘30次擠壓多微孔軟塑料的微孔載體，力度以不損傷葉片為 宜。注入操作完成后，注入對(duì)照去離子水的小麥葉片無(wú)彎曲，注入0. 5M的NaCl高鹽溶液的 小麥葉片微彎曲，注入IM的NaCl高鹽溶液的小麥葉片彎曲度最大。放置M小時(shí)后，觀察 三盆不同處理的小麥葉片恢復(fù)到處理前。結(jié)果表明NaCl已經(jīng)成功注入到小麥葉片內(nèi)。實(shí)施例6 利用鑷型注入器向小麥葉片注入異硫氰酸熒光素用去離子水配制0. 的異硫氰酸熒光素(FITC)溶液，用0. 45um的濾膜過(guò)濾除 熱源和未溶解的熒光素鈉顆粒，置4度冰箱備用。所用的材料是小麥TaiChimg29，小麥種 子經(jīng)浸種、催芽后種于口徑IOcm花盆中，至于室溫(溫度晝15 18°C /夜11 14°C，光照強(qiáng)度6000Lx，光照時(shí)間14h)，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至1葉期作為實(shí)驗(yàn)植物材料。分別用移液器把去 0. 5ml離子水和0. 的異硫氰酸熒光素溶液吸附到具有彈性的多微孔軟塑料的微孔載體 中，將微孔載體固定在硬塑料支持板上，通過(guò)捏片擠壓微孔載體，這樣可以防止污染物的干 擾。操作一向小麥葉片注入去離子水時(shí)用每分鐘30次的頻率擠壓多微孔軟塑料的微孔載 體，擠壓30秒，擠壓力度以不損傷葉片為宜，然后用去離子水沖洗小麥葉片；操作二 向小 麥葉片注入0. 的異硫氰酸熒光素溶液時(shí)用每分鐘30次的頻率擠壓多微孔軟塑料的微 孔載體，擠壓30秒，擠壓力度以不損傷葉片為宜，然后用去離子水沖洗小麥葉片；操作三 將含有0. 的異硫氰酸熒光素溶液的微孔載體輕輕貼附在小麥葉片兩側(cè)一定時(shí)間，然后 用去離子水沖洗小麥葉片。注入操作完成后，冷凍切片后，用共聚焦熒光顯微鏡在吸收光波 長(zhǎng)為495nm，發(fā)散光波長(zhǎng)為525nm觀察小麥葉片。觀察結(jié)果是操作一處理的小麥葉片中無(wú)熒 光點(diǎn)，操作二處理的小麥葉片有大量的熒光點(diǎn)，操作三處理的小麥葉片無(wú)熒光點(diǎn)。結(jié)果表明 異硫氰酸熒光素成功注入到小麥葉片內(nèi)。實(shí)施例7 利用帶護(hù)管的鑷型注入器向小麥葉片注入紅色熒光蛋白用去5mM的PBS緩沖液(pH = 7. 2)配制濃度為lmg/ml的Dsred紅色熒光蛋白的 溶液，用0. 45um的濾膜過(guò)濾除熱源，置4度冰箱備用。所用的材料是小麥TaiChimg29，小麥 種子經(jīng)浸種、催芽后種于口徑IOcm花盆中，至于室溫(溫度晝15 18°C /夜11 14°C， 光照強(qiáng)度6000Lx，光照時(shí)間14h)，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至1葉期作為實(shí)驗(yàn)植物材料。分別用移液器把 0. 5mlPBS緩沖液和lmg/ml的紅色熒光蛋白的蛋白溶液吸附到具有彈性的多微孔軟塑料的 微孔載體中，用鑷子將微孔載體輕輕放置在護(hù)管內(nèi)(在放置過(guò)程中保證載體中的液體不被 擠出)。用角度固定夾輕輕的將護(hù)管固定在小麥葉片的兩側(cè)，然后用手通過(guò)鑷片以每分鐘 25次的頻率擠壓微孔載體，擠壓30秒，力度以不損傷小麥葉片為宜。操作完成后，冷凍切 片，用共聚焦顯微鏡在吸收光波長(zhǎng)563nm，發(fā)散光波長(zhǎng)582nm檢測(cè)觀察。觀察結(jié)果注入PBS 緩沖液的小麥葉片中無(wú)熒光點(diǎn)，注入紅色熒光蛋白的小麥葉片中含有大量的熒光點(diǎn)。結(jié)果 表明紅色熒光蛋白成功注入到小麥葉片內(nèi)。實(shí)施例8 利用帶護(hù)管的鑷型注入器向小麥葉片注入可以表達(dá)紅色熒光蛋白的大 腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)攜有紅色熒光蛋白基因的大腸桿菌至對(duì)數(shù)期，用無(wú)菌的LB培養(yǎng) 基帶護(hù)套的鑷式注入裝置清洗菌體并制成濃度為lxl05CFU/ml菌液。所用的材料是小麥 Taichung29,小麥種子經(jīng)浸種、催芽后種于口徑IOcm花盆中，至于室溫(溫度晝15 18°C / 夜11 14°C，光照強(qiáng)度6000Lx，光照時(shí)間14h)，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至1葉期作為實(shí)驗(yàn)植物材料。分 別用移液器把0. 5ml無(wú)菌的LB培養(yǎng)基和含有攜帶紅色熒光蛋白基因的大腸桿菌的菌液吸 附到具有彈性的多微孔軟塑料的微孔載體中，用鑷子將微孔載體輕輕放置在護(hù)管內(nèi)(在放 置過(guò)程中保證載體中的液體不被擠出)。用角度固定夾輕輕的將護(hù)管固定在小麥葉片的兩 側(cè)，然后用手通過(guò)鑷片以每分鐘20次的頻率擠壓微孔載體，擠壓60秒，力度以不損傷小麥 葉片為宜。操作完成后，冷凍切片，用共聚焦顯微鏡在吸收光波長(zhǎng)563nm，發(fā)散光波長(zhǎng)582nm 檢測(cè)觀察。鏡檢后發(fā)現(xiàn)注入無(wú)菌LB培養(yǎng)基的小麥葉片無(wú)熒光點(diǎn)，注入攜帶紅色熒光蛋白基 因的大腸桿菌的LB培養(yǎng)基的小麥葉片有大量的熒光點(diǎn)。結(jié)果表明大腸桿菌已經(jīng)轉(zhuǎn)入到小 麥葉片中，并且表達(dá)了紅色熒光蛋白。實(shí)施例9 利用帶護(hù)管的鑷型注入器向煙草葉片注入煙草花葉病毒[ 0048] 分別取已經(jīng)感染和未感染煙草花葉病毒的煙草葉片擠壓榨取液汁，并用無(wú)菌的去 離子水稀釋病毒至lOug/mL備用。將易感病的煙草在溫室中培養(yǎng)到5片的心葉期，選取健 康、生長(zhǎng)旺盛葉片作為實(shí)驗(yàn)材料。分別用移液器把0. 5ml未感染煙草花葉病毒葉片液汁和 已感染煙草花葉病毒的葉片液汁吸附到具有彈性的多微孔軟塑料的微孔載體中，用鑷子將 微孔載體輕輕放置在護(hù)管內(nèi)(在放置過(guò)程中保證載體中的液體不被擠出)。用角度固定夾 輕輕的將護(hù)管固定在煙草葉片的兩側(cè)，然后用手通過(guò)鑷片以每分鐘30次的頻率擠壓微孔 載體，擠壓60秒，力度以不損傷小麥葉片為宜。置溫室7天后觀察，注入未感染煙草花葉 病毒葉片液汁的煙草葉片沒(méi)有感染病毒，注入已感染煙草花葉病毒的葉片液汁的煙草葉片 開始是脈明，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)形成淺綠病斑，葉緣向背面卷曲最后葉片厚薄不勻，皺縮扭 曲，呈畸形，并有不規(guī)則的缺刻。結(jié)果表明注入已感染煙草花葉病毒的葉片液汁的煙草葉片 以被煙草花葉病毒感染，證明通過(guò)該方法成功的將煙草花葉病毒注入到煙草葉片中。
權(quán)利要求
1.一種向植物葉片注入外源物的方法，包括1)根據(jù)外源物和葉片的種類和特性，選擇具有一定體積、軟硬程度的具有回彈特性的 多微孔軟塑料載體，一般采用軟聚氯乙烯載體，其外表應(yīng)光滑無(wú)孔，內(nèi)部微孔孔徑約1-100 微米；..2)制備不同形狀和特點(diǎn)的用于固定多微孔軟塑 載體的注入裝置；3)將多微孔軟塑料載體固定到注入裝置上；4)將外源物吸附到具有彈性的多微孔軟塑料載體中；5)將含外源物液體的多微孔軟塑料載體的微孔開口面緊貼植物葉片表面；6)根據(jù)外源物和葉片的種類和特性，用一定的頻率和力度擠壓注入裝置，通過(guò)擠壓在 多微孔軟塑料載體的微孔內(nèi)形成正負(fù)壓，將含有外源物的液體注入葉片中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于根據(jù)外源物和葉片的種類和特性，選擇具 有不同回彈特性軟塑料載體，載體體積、載體軟硬程度以及載體微孔孔徑大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于制備不同形狀和用途的用于固定多微孔塑 料載體的器具。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的具有彈性的多微孔軟塑料為具 有回彈特性的多微孔聚氯乙烯塑料。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將吸附有外源物的彈性多微孔軟塑料的微 孔開口面緊貼植物葉片表面。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于根據(jù)外源物和葉片的種類和特性，選擇多 微孔軟載體的擠壓頻率和力度，將含有外源物的液體注入葉片中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在擠壓多微孔軟載體，通過(guò)形成正負(fù)壓將 外源物注入葉片中。
8.權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的方法，可用于高效、簡(jiǎn)便和微損傷地向植物葉 片注入小分子成分，或蛋白質(zhì)，或核酸，或質(zhì)粒，或病毒，或細(xì)菌等外源物。
9.權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求所述的方法，可用于植物生理學(xué)、植物病理學(xué)和蛋白 質(zhì)與基因功能等方面的研究。
10.權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求所述的方法，可用于大規(guī)模植物生長(zhǎng)發(fā)育干預(yù)或特 殊植物的培養(yǎng)生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效和簡(jiǎn)便的向植物葉片注入外源物的方法。通過(guò)具有彈性的多微孔軟聚氯乙烯等軟塑料器具，采用的正負(fù)壓注入法(Positive andNegative Pressure Introduction by Using Soft Polyvinyl Chloride with Multi-Micro-Tubules，PNPi-SPCT，PNPi)實(shí)現(xiàn)了高效、簡(jiǎn)便和微損傷地向植物葉片注入外源物的目標(biāo)。本發(fā)明在植物生理學(xué)、植物病理學(xué)和蛋白質(zhì)與基因功能等方面的研究中，以及大規(guī)模植物生長(zhǎng)發(fā)育干預(yù)和特殊植物的培養(yǎng)生產(chǎn)中，具有廣泛的適用性。
文檔編號(hào)A01G7/06GK102047816SQ200910209539
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者孔德權(quán), 孟慶石, 張擘, 潘映紅, 胡新明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所