專利名稱：鐵皮石斛人工種子的制作和貯藏方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鐵皮石斛人工種子的制作和貯藏方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛(Dendrobium candicum Wall, ex Lindl.),又名黑節(jié)草，為蘭科多年附生草本植物。鐵皮石斛具有重要的藥用價值，始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，以鮮莖或干燥莖入藥，具益胃生津、滋陰清熱之效；道家醫(yī)學典籍《道藏》將其列為“九大仙草”之首，民間將其奉為“救命仙草”；《中華人民共和國藥典》記載其可用于陰傷津虧，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨痿軟?，F(xiàn)代藥理學分析鐵皮石斛具有增強機體免疫力、抗腫瘤、降血糖、抗氧化等作用，是許多中成藥和保健品的重 要原料。鐵皮石斛對生長環(huán)境要求特殊，加之長期無節(jié)制的采挖，導致其野生資源日益減少，瀕臨枯竭，已被列為中國珍稀瀕危二級保護植物。鐵皮石斛的種子細小，缺乏胚乳，且需與蘭菌共生才能萌發(fā)，因此其自然繁殖率極低，難以滿足大規(guī)模人工栽培的需要。傳統(tǒng)的分株、扦插等繁殖方式繁殖率也較低。利用組織培養(yǎng)技術(shù)雖然能在一定程度上解決快速繁殖的難題，但是依然存在試管苗轉(zhuǎn)接次數(shù)多、生產(chǎn)周期長、成本高、移栽成活率低且貯藏和運輸不便等問題，同樣限制了鐵皮石斛的大規(guī)模生產(chǎn)。人工種子技術(shù)可以將無菌生長的原球莖經(jīng)過包埋之后直接播入土壤，為鐵皮石斛的生產(chǎn)提供了一條新的途徑。與試管苗相比，人工種子減少了生根和馴化移栽的過程，縮短了生產(chǎn)周期，大大降低了生產(chǎn)成本。但是鐵皮石斛人工種子的研究剛剛起步，還存在著發(fā)芽率低、貯藏時間短和田間成苗率低等亟待解決的問題。中國專利申請?zhí)?00910193294. 3，一種鐵皮石斛人工種子的制作方法，提供了一種鐵皮石斛人工種子的制作方法，但其增殖效率較低，生產(chǎn)成本較高，人工種子貯藏壽命短，且發(fā)芽率萌發(fā)率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的主要問題是珍稀藥用植物鐵皮石斛的人工種子制作和貯藏技術(shù)，旨在利用現(xiàn)代生物技術(shù)有效緩解鐵皮石斛野生資源瀕臨枯竭和大規(guī)模人工栽培種苗短缺的局面，充分滿足人類生活中對鐵皮石斛的需求。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案鐵皮石斛人工種子的制作和貯藏方法，包括以下步驟(I)原球莖的誘導將鐵皮石斛成熟但尚未開裂的蒴果在自來水下沖洗l_2h，放入超凈工作臺中，先用75%酒精浸泡O. 5-lmin，無菌水沖洗3-5次，再用O. I %氯化汞溶液浸泡8_10min，無菌水沖洗3-5次，置于無菌濾紙上吸干表面水分，用解剖刀將蒴果切開，將蒴果內(nèi)種子均勻撒播在原球莖誘導培養(yǎng)基上，置于25°C人工氣候箱中，先進行5d黑暗培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，光照強度為20001x，每日光照時間為16h，培養(yǎng)15d后種子萌發(fā)形成綠色的原球莖；原球莖誘導培養(yǎng)基組成為MS+O. 5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10%土豆汁+0. 5%活性炭+0. 7%瓊月旨，pH 5. 8，培養(yǎng)基預先在121°C下高壓滅菌15-20min ；(2)原球莖的液體懸浮培 養(yǎng)增殖將誘導獲得的鐵皮石斛原球莖接種于液體增殖培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，每瓶裝培養(yǎng)基25-30ml，接種原球莖重量為I. 5-2. 0g，將培養(yǎng)瓶置于25°C恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為80-100r/min，光照為自然漫射光，每培養(yǎng)15d更換一次培養(yǎng)液；原球莖液體增殖培養(yǎng)基配方為1/2MS+0. 5mg/L萘乙酸+2. Omg/L 6-芐氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0. 1-0. 5g/L聚乙烯吡咯烷酮，pH 5.8，其中1/2MS為大量元素減半的MS基本
培養(yǎng)基;(3)人工種子的制作以MS+0.5mg/L 萘乙酸+2.5mg/L 6-芐氨基嘌呤+30g/L 蔗糖+0. 3-0. 4wt % 多菌靈+0. 2wt%活性炭+20mg/L脫落酸為人工胚乳，在其中加入3-4wt%海藻酸鈉熬制成半凝膠，經(jīng)121 °C高壓滅菌20min后冷卻備用，在超凈工作臺上，將經(jīng)過30d液體懸浮增殖培養(yǎng)的大小為2-4mm的鐵皮石斛原球莖均勻懸浮于半凝膠中，用內(nèi)直徑為4mm的滴管吸取半凝膠和原球莖滴入已滅菌冷卻的50-150mmol/L硝酸鈣溶液中，保證每滴半凝膠中只含有一顆原球莖，經(jīng)過20-30min離子交換反應，倒去硝酸鈣溶液，用無菌水漂洗3次即可得到人工種子;(4)人工種子的貯藏在超凈工作臺上，將制得的人工種子置于無菌濾紙上吸干表面水分，再將其放入已滅菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4°C冰箱中黑暗保存。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明存在以下有益效果I.本發(fā)明以液體懸浮培養(yǎng)(1/2MS培養(yǎng)基)增殖鐵皮石斛原球莖，增殖效率較現(xiàn)有發(fā)明的固體培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)增殖培養(yǎng)有顯著提高，為人工種子生產(chǎn)提供了大量優(yōu)質(zhì)的人工種胚；2.本發(fā)明以海藻酸鈉和硝酸鈣溶液離子交換固化形成人工種皮，與現(xiàn)有發(fā)明的海藻酸鈉和氯化鈣溶液反應相比，制成的人工種子形狀更規(guī)則、營養(yǎng)物質(zhì)泄漏率較低；3.本發(fā)明在人工胚乳中添加多菌靈，而現(xiàn)有發(fā)明添加的是百菌清，與其相比較人工種子在有菌基質(zhì)中有較高的萌發(fā)率；4.本發(fā)明在人工胚乳中添加脫落酸并將人工種子置于4°C冰箱中保存，貯藏6個月后仍具有較高的萌發(fā)率，而現(xiàn)有發(fā)明未添加脫落酸并進行貯藏發(fā)芽試驗。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，不添加脫落酸的人工種子萌發(fā)率迅速降低，在貯藏5個月后種子萌發(fā)率降為O ;添加20mg/L脫落酸的人工種子萌發(fā)率隨貯藏時間延長降低較慢，貯藏6個月后萌發(fā)率仍可達45%。5.本發(fā)明的原球莖誘導培養(yǎng)基組成為MS+0. 5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10% wt土豆汁+0. 5wt%活性炭+0. 7wt%瓊脂，而現(xiàn)有發(fā)明的種子萌發(fā)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升含椰子汁50-100ml，活性炭10g，蛋白胨l_2g，蔗糖20_30g，瓊脂8_9g，pH值為5. 4-5. 6。本發(fā)明培養(yǎng)基中添加的土豆汁可以自己自作，比用椰子汁和蛋白胨成本低。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實施例一鐵皮石斛人工種子的制作和貯藏方法I.原球莖的誘導將鐵皮石斛成熟但尚未開裂的蒴果在自來水下沖洗2h，放入超凈工作臺中，先用75%酒精浸泡O. 5-lmin，無菌水沖洗3-5次，再用O. I %氯化汞溶液浸泡8_10min，無菌水沖洗3-5次，置于無菌濾紙上吸干表面水分，用解剖刀將蒴果切開，將蒴果內(nèi)種子均勻撒播在原球莖誘導培養(yǎng)基上，置于25°C人工氣候箱中,先進行5d黑暗培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng),光照強度為20001x，每日光照時間為16h，培養(yǎng)15d后種子萌發(fā)形成綠色的原球莖。原球莖誘導培養(yǎng)基組成為MS+0. 5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10wt%土豆汁+0. 5wt%活性炭+0. 7wt%瓊脂，pH 5. 8，培養(yǎng)基預先在121°C下高壓滅菌20min。
2.原球莖的液體懸浮培養(yǎng)增殖將誘導獲得的鐵皮石斛原球莖接種于液體增殖培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，每瓶裝培養(yǎng)基25-30ml，接種原球莖重量為I. 5_2g，將培養(yǎng)瓶置于25°C恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為80r/min,光照為自然漫射光，每培養(yǎng)15d更換一次培養(yǎng)液。原球莖液體增殖培養(yǎng)基配方為1/2MS+0. 5mg/L萘乙酸+2. Omg/L 6-芐氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0. lg/L聚乙烯吡咯烷酮，pH5. 8，其中1/2MS為大量元素減半的MS基本培養(yǎng)基。3.人工種子的制作以MS+0.5mg/L 萘乙酸+2.5mg/L 6_ 芐氨基嘌呤+30g/L 蔗糖+0. 3-0. 4wt % 多菌靈+0. 2wt%活性炭+20mg/L脫落酸為人工胚乳，在其中加入3-4wt%海藻酸鈉熬制成半凝膠，經(jīng)121 °C高壓滅菌20min后冷卻備用，在超凈工作臺上，將經(jīng)過30d液體懸浮增殖培養(yǎng)的大小為2-4mm的鐵皮石斛原球莖均勻懸浮于半凝膠中，用內(nèi)直徑為4mm的滴管吸取半凝膠和原球莖滴入已滅菌冷卻的50-150mmol/L硝酸鈣溶液中，保證每滴半凝膠中只含有一顆原球莖，經(jīng)過20-30min離子交換反應，倒去硝酸鈣溶液，用無菌水漂洗3次即可得到人工種子。4.人工種子的貯藏在超凈工作臺上，將制得的人工種子置于無菌濾紙上吸干表面水分，再將其放入已滅菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4°C冰箱中黑暗保存。實施例二 鐵皮石斛人工種皮制作的正交試驗以MS+0.5mg/L萘乙酸+2.5mg/L 6_芐氨基嘌呤+30g/L蔗糖為人工胚乳，在其中加入2-4%海藻酸鈉熬制成半凝膠，經(jīng)121°C高壓滅菌20min后冷卻備用，在超凈工作臺上，將經(jīng)過30d液體懸浮增殖培養(yǎng)的大小為2-4_的鐵皮石斛原球莖均勻懸浮于半凝膠中，用內(nèi)直徑為4mm的滴管吸取半凝膠和原球莖滴入已滅菌冷卻的50-150mmol/L硝酸鈣溶液中，保證每滴半凝膠中只含有一顆原球莖，經(jīng)過20-30min離子交換反應，倒去硝酸鈣溶液，用無菌水漂洗3次得到人工種子。海藻酸鈉濃度(2wt%、3wt % 和 4wt % )、硝酸|丐濃度(50mmoI /L、IOOmmol/L 和150mmol/L)和離子交換反應時間(20min、25min和30min)組成一個三因素三水平的正交設(shè)計試驗，如表I所示。記錄各個處理人工種子的包埋效果和成形情況。每個處理選擇100粒人工種子，播種于添加有無菌瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿播種20粒。將其置于溫度為25°C、光照強度為20001x的人工氣候箱中培養(yǎng)，每天光照16h。表I鐵皮石斛人工種皮制作的正交試驗
海藻酸鈉濃度人I種旮養(yǎng)物質(zhì)發(fā)申
編牙硝酸鈣濃度(mmol/L) 反應時間(min)
Wt%了·特征泄漏率(%) (%)
125020硬度小，易粘連3497
2210025硬度小，易粘連2597
3215030硬度小，易粘連I894
43%5025橢球形，硬度小995
5310030橢球形，形狀整齊392
6315020橢球形，形狀整齊390
745030橢球形，邊緣不整齊489
8410020硬度高，有拖尾287
9415025硬度高，有拖尾O86營養(yǎng)物質(zhì)泄漏率的統(tǒng)計和計算培養(yǎng)在瓊脂培養(yǎng)基上的人工種子，以開始培養(yǎng)20天后種子附近出現(xiàn)液體計為營養(yǎng)物質(zhì)泄漏，泄漏種子數(shù)/人工種子總數(shù)χιοο%即為營養(yǎng)物質(zhì)泄漏率。萌發(fā)率的統(tǒng)計將人工種子置于瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天后統(tǒng)計萌發(fā)率，以幼芽突破種皮5mm以上計為萌發(fā)。由表I可見，低濃度的海藻酸鈉(2wt% )制作的人工種子硬度小、易粘連，雖然萌發(fā)率較高，但是營養(yǎng)物質(zhì)泄漏率嚴重；高濃度的海藻酸鈉(4wt% )制作的人工種子硬度高、邊緣不整齊、有拖尾現(xiàn)象，雖然營養(yǎng)物質(zhì)泄漏率較低，但萌發(fā)率也較低；3wt%海藻酸鈉與50mmol/L硝酸鈣反應25min制成的人工種子硬度較小，營養(yǎng)物質(zhì)泄漏率較高；3%海藻酸鈉與100和150mmol/L硝酸鈣反應制成的人工種子形狀規(guī)則整齊，營養(yǎng)物質(zhì)泄漏率和萌發(fā)率均處于較優(yōu)水平，是制作鐵皮石斛人工種子較理想的人工種皮配方。實施例三鐵皮石斛人工胚乳中添加多菌靈的有菌萌發(fā)試驗以MS+0. 5mg/L萘乙酸+2. 5mg/L 6_節(jié)氨基嘌呤+30g/L鹿糖+0-0. 5wt %多菌靈為人工胚乳，在其中加入3wt%海藻酸鈉熬制成半凝膠，經(jīng)121°C高壓滅菌20min后冷卻備用，在超凈工作臺上，將經(jīng)過30d液體懸浮增殖培養(yǎng)的大小為2-4mm的鐵皮石斛原球莖均勻懸浮于半凝膠中，用內(nèi)直徑為4mm的滴管吸取半凝膠和原球莖滴入已滅菌冷卻的IOOmmol/L硝酸鈣溶液中，保證每滴半凝膠中只含有一顆原球莖，經(jīng)過25min離子交換反應，倒去硝酸鈣溶液，用無菌水漂洗3次得到人工種子。多菌靈共設(shè)置6個濃度)梯度處理0、
O.1%,0. 2%,O. 3%,O. 4%,O. 5%。從每個濃度處理中選擇100粒人工種子，播種于鋪有3cm腐殖土的培養(yǎng)盤中，播種密度為I粒/cm2，播種深度O. 5cm。將培養(yǎng)盤放置于溫度為25°C的恒溫培養(yǎng)室中，每天噴水一次，20天后統(tǒng)計人工種子的污染率和非污染壞死率，30天后統(tǒng)計人工種子萌發(fā)率。統(tǒng)計 結(jié)果見表2。表2鐵皮石斛人工胚乳中添加多菌靈的有菌萌發(fā)試驗
權(quán)利要求
1.一種鐵皮石斛人工種子的制作和貯藏方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)原球莖的誘導 將鐵皮石斛成熟但尚未開裂的蒴果在自來水下沖洗l-2h，放入超凈工作臺中，先用75%酒精浸泡O. 5-lmin，無菌水沖 洗3-5次，再用O. I %氯化汞溶液浸泡8_10min，無菌水沖洗3-5次，置于無菌濾紙上吸干表面水分，用解剖刀將蒴果切開，將蒴果內(nèi)種子均勻撒播在原球莖誘導培養(yǎng)基上，置于25°C人工氣候箱中,先進行5d黑暗培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng),光照強度為20001x，每日光照時間為16h，培養(yǎng)15d后種子萌發(fā)形成綠色的原球莖；原球莖誘導培養(yǎng)基組成為MS+O. 5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10%上豆汁+0. 5%活性炭+0. 7%瓊脂，pH 5. 8，培養(yǎng)基預先在121°C下高壓滅菌15-20min， (2)原球莖的液體懸浮培養(yǎng)增殖 將誘導獲得的鐵皮石斛原球莖接種于液體增殖培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，每瓶裝培養(yǎng)基25-30ml，接種原球莖重量為I. 5-2. 0g，將培養(yǎng)瓶置于25°C恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為80-100r/min，光照為自然漫射光，每培養(yǎng)15d更換一次培養(yǎng)液； 原球莖液體增殖培養(yǎng)基配方為1/2MS+0. 5mg/L萘乙酸+2. Omg/L 6-芐氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0. 1-0. 5g/L聚乙烯吡咯烷酮，pH 5. 8，其中1/2MS為大量元素減半的MS基本培養(yǎng)基 (3)人工種子的制作 以MS+0. 5mg/L萘乙酸+2. 5mg/L 6-芐氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0. 3-0. 4wt %多菌靈+0. 2wt%活性炭+20mg/L脫落酸為人工胚乳，在其中加入3-4wt%海藻酸鈉熬制成半凝膠，經(jīng)121 °C高壓滅菌20min后冷卻備用，在超凈工作臺上，將經(jīng)過30d液體懸浮增殖培養(yǎng)的大小為2-4mm的鐵皮石斛原球莖均勻懸浮于半凝膠中，用內(nèi)直徑為4mm的滴管吸取半凝膠和原球莖滴入已滅菌冷卻的50-150mmol/L硝酸鈣溶液中，保證每滴半凝膠中只含有一顆原球莖，經(jīng)過20-30min離子交換反應，倒去硝酸鈣溶液，用無菌水漂洗3次即可得到人工種子； (4)人工種子的貯藏 在超凈工作臺上，將制得的人工種子置于無菌濾紙上吸干表面水分，再將其放入已滅菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4°C冰箱中黑暗保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了鐵皮石斛人工種子的制作和貯藏方法，包括以下步驟(1)原球莖的誘導；(2)原球莖的液體懸浮培養(yǎng)增殖；(3)人工種子的制作；(4)人工種子的貯藏；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以液體懸浮培養(yǎng)(1/2MS培養(yǎng)基)增殖鐵皮石斛原球莖，增殖效率較現(xiàn)有發(fā)明的固體培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)增殖培養(yǎng)有顯著提高，為人工種子生產(chǎn)提供了大量優(yōu)質(zhì)的人工種胚；本發(fā)明以海藻酸鈉和硝酸鈣溶液離子交換固化形成人工種皮，與現(xiàn)有發(fā)明的海藻酸鈉和氯化鈣溶液反應相比，制成的人工種子形狀更規(guī)則、營養(yǎng)物質(zhì)泄漏率較低；人工種子貯藏壽命延長，且發(fā)芽率較高。
文檔編號A01H4/00GK102893865SQ20121038270
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者賴佳, 李煥秀, 許軻, 唐懿, 秦耀國, 羅倩, 朱永鵬, 鄭陽霞 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學