專(zhuān)利名稱(chēng)：一種防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥，屬微生物有機(jī)磷肥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
三七(Panax notoginseng (Burk. ) F. H. Chen)是五加科人參屬植物，是我國(guó)特有的名貴中藥材[I]，也是云南省最具特色的生物資源之一。三七具有散瘀止血、消腫定痛、調(diào)節(jié)血糖平衡、抗疲勞、抗衰老、耐缺氧和提高機(jī)體免疫力等多方面的藥理作用和保健功能[2-3]。三七是多年生宿根草本植物，由于三七生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)條件苛刻(要求冬暖夏涼、無(wú)嚴(yán)寒與酷暑，半光半陰、潮濕的特定環(huán)境)，種植區(qū)域受限，僅分布在云南文山市各縣以及廣西與文山交界的幾個(gè)地方[4]，因此與同屬植物人參、西洋參一樣，存在嚴(yán)重 的連作障礙問(wèn)題[5]，即栽過(guò)一茬三七的土地要間隔至少八年甚至幾十年才能再栽三七，如果縮短輪作年限則表現(xiàn)為三七地上部分生長(zhǎng)不良，病害多，產(chǎn)量低，甚至毀園絕收[6]。三七枯萎病(Root rot disease)是三七生產(chǎn)中的毀滅性病害，其造成的損失占三七全部病害損失的70-85%，已成為制約三七產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。三七枯萎病為多種病原菌協(xié)同侵染引起的土傳復(fù)合病害(Complex disease),其病原包括真菌(Alternariapanax, A. tenuis, Cylindrocarpon destructans, C. didynum, Fusarium solani, F.oxysporum, Phytophthora cactorum, Phoma herbarum, Rhizoctonia solani) [7]。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)三七輪作間隔4 5年，發(fā)病率達(dá)30%以上；間隔8年以上，發(fā)病率在10% 15%。因此，連作障礙導(dǎo)致三七適宜種植地塊十分緊張，已呈現(xiàn)出由適宜種植區(qū)域向次適宜區(qū)域轉(zhuǎn)移，不僅增加了“七農(nóng)”的種植成本，還嚴(yán)重影響了三七的產(chǎn)量和質(zhì)量。連作障礙也成為制約三七產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大問(wèn)題。利用開(kāi)墾新地和與非寄主作物輪作或休閑8 10年以上是傳統(tǒng)解決這一問(wèn)題有效的方法。但是近年來(lái)，隨著三七規(guī)?；N植面積的不斷擴(kuò)大，此方法已不能滿足市場(chǎng)需要，而施用化學(xué)農(nóng)藥直接影響三七質(zhì)量和污染環(huán)境。因此，一種安全、有效的防治措施，在此背景下，生物防治被賦予極大的期望。三七作為一種區(qū)域性植物，其根腐復(fù)合病害的生物防治極少被廣泛關(guān)注，但部分研究已經(jīng)表明生防微生物在三七枯萎病防治方面有較好的應(yīng)用前景。用微生物菌劑拌種(苗)處理，在三七生長(zhǎng)前期，對(duì)枯萎病有明顯的控制效果(陳昱君等，2004);從三七根際土壤中分離的三株芽孢桿菌對(duì)三七枯萎病病原菌中的壞損柱孢霉(C. destructans)具有較好的抑菌作用，具備研發(fā)生物農(nóng)藥的潛力(劉立志等，2004)。生防微生物在植物根際良好的定殖、生存及繁殖能力是其發(fā)揮生防效果的前提；良好的根際定殖能力已經(jīng)成為篩選土傳病害拮抗微生物的重要考察參數(shù)。生物有機(jī)磷肥是采用經(jīng)過(guò)高能活化的磷礦物為主要原料，在特效菌種的作用下與有機(jī)質(zhì)共同發(fā)酵處理而得到的；其特點(diǎn)是長(zhǎng)效緩釋、非酸化、非水溶性，后效性顯著，一季使用多季有效；該肥料的使用能優(yōu)化土壤礦物組成和結(jié)構(gòu)，避免化學(xué)肥料對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量及土壤酸化的不良影響，達(dá)到增產(chǎn)、改善品質(zhì)、綠色生態(tài)的效果。本發(fā)明利用一種能高效消除三七枯萎病連作障礙的高效拮抗菌(解淀粉芽孢桿菌)與生物有機(jī)磷肥相結(jié)合，生產(chǎn)出一種既能對(duì)種植三七的土壤土傳病害進(jìn)行生物消毒又能為種植地提供持久養(yǎng)分的藥肥雙效生物有機(jī)肥料。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明相同的公開(kāi)報(bào)道。參考文獻(xiàn)[I]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2010年版).北京化學(xué)工業(yè)出版社，2010: 10-11.[2] Sun S，Wang CZ, Tong R, Li XL, Fishbein A, Wang Q, He TC, Du ff, YuanCS. Effects of steaming the root of Panax notoginseng on chemical compositionand anticancer activities. Food Chemistry, 2010, 118(2): 307-314. [3]甘雨，徐惠波，孫曉波.三七總皂苷的藥理作用研究進(jìn)展.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18 (5): 1251-1252. [4] Guo HB, Cui XM, An N and Cai GP. Sanchi ginseng (Panax notoginseng(Burkill) F. H. Chen) in China:distribution, cultivation and variations.Genetic Resources and Crop Evolution, 2010, 57: 453—460.[5]簡(jiǎn)在友，王文全，孟麗，張子龍.人參屬藥用植物連作障礙研究進(jìn)展.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2008，10 (6) :3-5.[6]張重義，林文雄.藥用植物的化感自毒作用與連作障礙.中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，17 (I) :189-196.[7]繆作清，李世東，劉杏忠，等.三七根腐病病原研究.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).2006， 39: 1371-1378.[8]陳昱君，王勇，劉蕓芝，等.生物菌劑控制三七根腐病的初步研究.中國(guó)中藥雜志.2004，29 (11) :1102-1103.[9]劉立志，王啟方，張克勤，等.三七根腐病拮抗菌的篩選及活性產(chǎn)物的初步分析 云南大學(xué)學(xué)報(bào).2004，6(4) :357-359.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種使用方便，成本低，效果明顯，無(wú)毒、無(wú)害的防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明從云南省曲靖市富源縣藍(lán)莓種植區(qū)藍(lán)莓根際土壤中分離得到菌株KMXY1，對(duì)其鑒定結(jié)果表明該細(xì)菌屬于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),該菌株已經(jīng)保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國(guó).北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)；保藏日期2012年9月21 ;保藏號(hào)=CGMCC NO. 6598。此解淀粉芽孢桿菌菌體特征及菌落特征菌體呈短桿狀，染色均勻，具運(yùn)動(dòng)性，兼性厭氧，可形成內(nèi)生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱，革蘭氏染色陽(yáng)性。在LB培養(yǎng)基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則，在多種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)色素。該拮抗菌與有機(jī)磷肥堆肥混合制成微生物有機(jī)肥料，肥料中含有I X IO10個(gè)/g以上的拮抗微生物數(shù)量，總氮磷鉀養(yǎng)分為6 8 %，有機(jī)質(zhì)含量為40 %。本發(fā)明的防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥經(jīng)過(guò)如下具體步驟得到
(I)、生防菌種子液的制備a.將保藏號(hào)為CGMCC NO. 6598的KMXYl菌株移植到含有LB培養(yǎng)基的試管進(jìn)行一環(huán)活化，29°C培養(yǎng)48小時(shí)，LB培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L, pH7. 0,瓊脂 17g/L ；b.取一環(huán)活化后的菌苔移入用1000ml錐形瓶裝的600ml的由胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L,pH7.0 組成的LB培養(yǎng)液中，在110轉(zhuǎn)/min、29 °C下培養(yǎng)72小時(shí)，獲得發(fā)酵菌液；c.將培發(fā)酵菌液按接種量1:200培的比例接種于種子罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，29-31°C發(fā)酵16-18小時(shí),獲得發(fā)酵用菌種；d.將發(fā)酵用菌種按接種量1:20倍的比例接種于發(fā)酵罐中與b步驟相同的LB培 養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，29-31°C發(fā)酵72-96小時(shí)后，當(dāng)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液中芽孢含量大于或等于85-90%時(shí)，即獲得菌含量為IX IO11個(gè)/g以上的菌液時(shí)，出罐儲(chǔ)存作為生防菌種子液；(2)、生物有機(jī)磷肥基質(zhì)的制備a.分別將水葫蘆渣干燥并粉碎，粉碎細(xì)度< 5cm ;草炭烘干或風(fēng)干后粉碎，粉碎至(0. 45mm ;腐植酸粉碎至彡0. 45mm ;含量20_24%、磷礦粉粉碎至彡400目；b.將a.步驟粉碎后水葫蘆渣、草炭、腐植酸、磷礦粉質(zhì)按質(zhì)量比5 3 1 1的比例混合均勻，堆捂后自然發(fā)酵20-25天，其間當(dāng)溫度升至62°C時(shí)進(jìn)行翻堆以充分發(fā)酵，翻堆后繼續(xù)發(fā)酵，直至物料均為灰黑褐色時(shí)，物料發(fā)酵成熟，即得生物有機(jī)磷肥基質(zhì)；(3)、防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥的制備將(I)步驟的生防菌種子液菌含量為IXlO11個(gè)/g以上時(shí)與步驟(2)的生物有機(jī)磷肥基質(zhì)混合均勻，使混合肥料中含有I XlOltl個(gè)/g以上的拮抗微生物數(shù)量、全氮含量為5 6%，總氮磷鉀養(yǎng)分為6 8%、有機(jī)質(zhì)含量為40%，包裝即為成品。本發(fā)明所用的設(shè)備均為市場(chǎng)銷(xiāo)售的通用設(shè)備。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、成本低，使用方便，效果明顯，無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)環(huán)境造成污染。2、該肥料不僅能對(duì)種植三七土壤中的有害病菌進(jìn)行充分消毒，而且能夠補(bǔ)充三七生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)元素，改良連作障礙土壤的理化性狀和土壤微生物活性，提高三七植株的抗逆性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例所用的設(shè)備均為市場(chǎng)銷(xiāo)售的通用設(shè)備。實(shí)施例1 :1、制備防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥(I)、生防菌種子液的制備a.將保藏號(hào)為CGMCC NO. 6598的KMXYl菌株移植到含有LB培養(yǎng)基的試管進(jìn)行一環(huán)活化，29°C培養(yǎng)48小時(shí)，LB培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L, pH7. 0,瓊脂 17g/L ；b.取一環(huán)活化后的菌苔移入用1000ml錐形瓶裝的600ml的由胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L,pH7.0 組成的LB培養(yǎng)液中，在110轉(zhuǎn)/min、29 °C下培養(yǎng)72小時(shí)，獲得發(fā)酵菌液；c.將培發(fā)酵菌液按接種量1:200培的比例接種于種子罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，29°C或30°C或31°C發(fā)酵16小時(shí)或17小時(shí)或18小時(shí)，獲得發(fā)酵用菌種；d.將發(fā)酵用菌種按接種量1:20倍的比例接種于發(fā)酵罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，或30°C或31°C發(fā)酵72小時(shí)或86小時(shí)或96小時(shí)后，當(dāng)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液中芽孢含量大于或等于85或90%時(shí)，出罐儲(chǔ)存作為生防菌種子液；(2)、生物有機(jī)磷肥基質(zhì)的制備a.分別將水葫蘆渣干燥并粉碎，粉碎細(xì)度< 5cm ;草炭烘干或風(fēng)干后粉碎，粉碎至(0. 45mm ;腐植酸粉碎至彡0. 45mm ;含量20%或24%的磷礦粉粉碎至彡400目；b.將a.步驟粉碎后水葫蘆渣、草炭、腐植酸、磷礦粉質(zhì)按質(zhì)量比5 3 1 1的比例混合均勻，堆捂后自然發(fā)酵20-25天，其間當(dāng)溫度升至62°C時(shí)進(jìn)行翻堆以充分發(fā)酵，翻堆后繼續(xù)發(fā)酵，直至物料均為灰黑褐色時(shí)，物料發(fā)酵成熟，即得生物有機(jī)磷肥基質(zhì)；(3)、防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥的制備將(I)步驟的生防菌種子液菌含量為IXlO11個(gè)/g以上時(shí)與步驟(2)的生物有機(jī)磷肥基質(zhì)混合均勻，使混合肥料中含有I XlOltl個(gè)/g以上的拮抗微生物數(shù)量、全氮含量為5%或6%,總氮磷鉀養(yǎng)分為6%或7%或8%、有機(jī)質(zhì)含量為40%,包裝即為成品。2、防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥的應(yīng)用2009-2011年在云南省文山州進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，供試農(nóng)田土壤理化性狀基本相同，肥力中等。采用隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)連作土壤、本肥料施用連作土壤和新地(尚未種植過(guò)三七)3個(gè)處理，每處理各重復(fù)3次，各小區(qū)面積均為200m2。2009年11月，對(duì)即將施用本肥料實(shí)施例做底肥一次性施入土壤，用量為16000kg/hm2，然后均勻翻耕；連作和新作地處理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方法施用復(fù)合肥400kg/hm2，2010年I月15日移栽一年生三七苗植株，栽植密度為35萬(wàn)棵/hm2，其余田間管理措施同當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)。在2010年12月進(jìn)行田間調(diào)查，考察三七的生長(zhǎng)和病害發(fā)生等狀況，收獲測(cè)產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表。防枯萎病微生物有機(jī)磷肥對(duì)三七枯萎病菌的田間試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥，其特征在于該微生物有機(jī)磷肥經(jīng)如下步驟制(1)、生防菌種子液的制備a.將保藏號(hào)為CGMCCNO. 6598的KMXYl菌株移植到含有LB培養(yǎng)基的試管進(jìn)行一環(huán)活化，29°C培養(yǎng)48小時(shí)，LB培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 5g/L, ρΗ7· O,瓊脂 17g/L ；b.取一環(huán)活化后的菌苔移入用IOOOml錐形瓶裝的600ml的由胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化鈉(NaCl) 5g/L，ρΗ7· O 組成的 LB培養(yǎng)液中，在110轉(zhuǎn)/min、29 °C下培養(yǎng)72小時(shí)，獲得發(fā)酵菌液；c.將培發(fā)酵菌液按接種量1:200培的比例接種于種子罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，29-31°C發(fā)酵16-18小時(shí),獲得發(fā)酵用菌種；d.將發(fā)酵用菌種按接種量1:20倍的比例接種于發(fā)酵罐中與b步驟相同的LB培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，29-31°C發(fā)酵72-96小時(shí)后，當(dāng)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液中芽孢含量大于或等于85-90% 時(shí)，即獲得菌含量為I X IO11個(gè)/g以上的菌液時(shí)，出罐儲(chǔ)存作為生防菌種子液；(2)、生物有機(jī)磷肥基質(zhì)的制備a.分別將水葫蘆渣干燥并粉碎，粉碎細(xì)度<5cm;草炭烘干或風(fēng)干后粉碎，粉碎至 (O. 45mm ;腐植酸粉碎至彡O. 45mm ;含量20_24%、磷礦粉粉碎至彡400目；b.將a.步驟粉碎后水葫蘆渣、草炭、腐植酸、磷礦粉質(zhì)按質(zhì)量比53 1 1的比例混合均勻，堆捂后自然發(fā)酵20-25天，其間當(dāng)溫度升至62°C時(shí)進(jìn)行翻堆以充分發(fā)酵，翻堆后繼續(xù)發(fā)酵，直至物料均為灰黑褐色時(shí)，物料發(fā)酵成熟，即得生物有機(jī)磷肥基質(zhì)；(3)、防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥的制備將(I)步驟的生防菌種子液菌含量為IXlO11個(gè)/g以上時(shí)與步驟(2)的生物有機(jī)磷肥基質(zhì)混合均勻，使混合肥料中含有I XlOltl個(gè)/g以上的拮抗微生物數(shù)量、全氮含量為5 6%，總氮磷鉀養(yǎng)分為6 8%、有機(jī)質(zhì)含量為40%，包裝即為成品。
全文摘要
防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥，屬微生物有機(jī)磷肥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明用解淀粉芽孢桿菌，通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)制備生防菌種子液；將粉碎的水葫蘆渣草炭腐植酸含量20-24%、細(xì)度400-450目的磷礦粉以 5311比例混合發(fā)酵得生物磷肥基質(zhì)；再將生防菌種子液與生物磷肥基質(zhì)混勻，制成防治三七枯萎病的微生物有機(jī)磷肥，肥料中含有1×1010個(gè)/g以上的拮抗微生物數(shù)量、全氮含量為5～6％，總氮磷鉀養(yǎng)分為6～8％、有機(jī)質(zhì)含量為40％。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于成本低，使用方便，效果明顯，無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)環(huán)境造成污染；能對(duì)種植三七土壤中的有害病菌進(jìn)行充分消毒，并補(bǔ)充三七生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)元素，改良連作障礙土壤的理化性狀和微生物活性，提高三七植株的抗逆性。
文檔編號(hào)C05F11/08GK103011918SQ201210410170
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者余磊, 趙建榮 申請(qǐng)人:昆明學(xué)院