專利名稱：一種防治西瓜枯萎病的真菌菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及瓜類土傳病害的生物防治技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種防治西瓜枯萎病的真菌菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌a oxysporum f.sp.引起的一種常見土傳病害，該病在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，我國臺灣、廣東、浙江、福建、江蘇、湖北、四川、重慶等地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生。該病可造成植株大面積萎蔫死亡，一般田塊發(fā)病率為10% 30%，重病田發(fā)病率高達(dá)80%以上，甚至全部死亡，導(dǎo)致西瓜產(chǎn)量嚴(yán)重下降，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。西瓜枯萎病是目前西瓜連作生產(chǎn)中最常見的病害，影響最大，防治最困難。其發(fā)生程度與土壤性質(zhì)、耕作、灌排水、施肥、育苗方式、苗床管理、用藥種類與用量、品種、種子檢疫和氣候有關(guān)。目前，常見防治措施有:物理防治、化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治、生物防治、生態(tài)防治、綜合防治等。物理方法一般費(fèi)工費(fèi)力，成本太高；而化學(xué)方法由于化學(xué)農(nóng)藥毒性大、污染環(huán)境，長期大量使用容易誘導(dǎo)病菌的抗藥性，稍有不當(dāng)，西瓜中殘留大量農(nóng)藥，影響人體健康，不符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展?；瘜W(xué)藥劑對西瓜連作障礙土壤進(jìn)行熏蒸，同樣會(huì)殘留于土壤造成污染，同時(shí)熏蒸也殺死了土壤中的有益微生物，因此也不是很好的方法。實(shí)行西瓜與其它作物輪作或連作障礙土休閑等農(nóng)業(yè)防治措施，理論上可行，但是，由于我國人多地少，土地資源極度緊張，加上種植西瓜的比較經(jīng)濟(jì)效益很高，果農(nóng)為了增加收入，一般不會(huì)輪作，更不會(huì)讓土地休閑。選育抗病西瓜品種，往往需要10多年的時(shí)間，且有時(shí)雖然能抗西瓜枯萎病，但抗病西瓜可能又失去其它優(yōu)良品質(zhì)(如高產(chǎn)、含糖量等)；嫁接抗病西瓜苗，雖能暫時(shí)抗病，但是，西瓜品質(zhì)風(fēng)味會(huì)發(fā)生改變，且連續(xù)嫁接幾年后，原來抗病的嫁接苗也變得不抗病了。因此，從保護(hù)生態(tài)環(huán)境、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、增加農(nóng)民收入、保障食品安全的角度來說，微生物防治技術(shù)無毒無害，不污染環(huán)境，不產(chǎn)生抗藥性，是綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)所需的關(guān)鍵技術(shù)，現(xiàn)已成為近年來農(nóng)作物土傳病害防治技術(shù)研究的熱點(diǎn)，應(yīng)用微生物技術(shù)防治作物土傳病害，解決連作障礙是最理想的 方法，是未來的發(fā)展方向。隨著對作物連作障礙發(fā)生機(jī)制的深入研究，通過改善作物根際微生態(tài)環(huán)境來促進(jìn)作物生長，以及從作物根際微環(huán)境中篩選具有良好促生和抗菌作用的有益菌群，日益為人們所重視。采用微生物防治作物土傳病害已經(jīng)研究了幾十年，人們陸續(xù)報(bào)道了細(xì)菌中的枯草芽孢桿菌、放射土壤桿菌、熒光假單胞桿菌、節(jié)桿菌、多粘芽抱桿菌、木霉屬真菌、青霉菌屬等；目前，市場上已有很多利用拮抗菌防治植物土傳病害的微生物菌劑、菌肥等產(chǎn)品，也有一些利用生物菌肥之類的產(chǎn)品進(jìn)行西瓜枯萎病生物防治的試驗(yàn)報(bào)道，雖然這些微生物制劑在實(shí)驗(yàn)室和溫室條件下有較好的效果，但是也存在多方面的局限性:首先，這些研究中報(bào)道的單一拮抗菌易受環(huán)境(氣候、土壤)條件的影響效果很不穩(wěn)定；其次，這些研制中的微生物制劑大都是液型的，在運(yùn)輸、貯藏和質(zhì)量保障等方面均不方便；此外，現(xiàn)有的研究中對微生物制劑的制備方法及其應(yīng)用配套技術(shù)尚未開展系統(tǒng)的研究，導(dǎo)致微生物技術(shù)產(chǎn)品防治西瓜枯萎病的實(shí)際應(yīng)用成本高、效果不穩(wěn)定，因此，微生物防治西瓜枯萎病技術(shù)尚難以在實(shí)踐生產(chǎn)中廣泛推廣應(yīng)用。因此，本發(fā)明針對西瓜連作導(dǎo)致的枯萎病頻發(fā)問題，借助作物根際土壤中豐富的微生物資源，篩選和改造了適合當(dāng)?shù)貤l件的優(yōu)良拮抗菌株，并充分利用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的大量農(nóng)業(yè)廢棄物資源，就地取材(麩皮、菇渣、酒糟、豬糞、草炭)開發(fā)了多種類型的固體菌劑，優(yōu)化完善了菌劑制備的條件與工藝，初步實(shí)現(xiàn)了微生物防治西瓜土傳病害的產(chǎn)業(yè)化，該技術(shù)的推廣應(yīng)用必將促進(jìn)以西瓜為代表的高效農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，針對物理、化學(xué)等防治方法所存在的缺陷，提出一種能有效防治西瓜枯萎病的真菌菌劑；本發(fā)明的另一目的是提出該菌劑簡易、低成本的制備方法；本發(fā)明的再一目的是提出該菌劑簡單、有效的應(yīng)用方法。一種深綠木霉Qfypocrea atrovirdis)菌株2-22的篩選與鑒定:
一、2010年，從浙江嘉興、金華、蕭山、溫嶺等西瓜種植基地的西瓜枯萎病發(fā)病區(qū)挑選健康西瓜植株，共采集到21個(gè)根際土樣，利用馬丁氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、分離，共分離到真菌270余株；然后進(jìn)行平板拮抗試驗(yàn)，從中得到對西瓜枯萎病菌有較好拮抗效果的初篩真菌15株；通過盆栽、小區(qū)試驗(yàn)，從浙江嘉興采集的土樣中進(jìn)一步篩選得到對西瓜枯萎病菌具有穩(wěn)定拮抗效果的復(fù)篩菌株2-22 ；
二、菌株2-22的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及基因測序:
1.菌落形態(tài)、顯微形態(tài)及培養(yǎng)特征:
菌株2-22在PDA培養(yǎng)基上菌落生長較快，黑暗條件下，25°C培養(yǎng)3天菌落直徑為40-50mm;在培養(yǎng)基上最初產(chǎn)生白色絮狀菌絲，繼而產(chǎn)生淺綠色孢子隨時(shí)間增長孢子變?yōu)樯罹G色，菌落背面呈白色或淡灰色整個(gè)菌落布滿白色氣生菌絲，其邊緣為淺綠或深綠色的產(chǎn)孢區(qū)域；通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲體呈透明狀有隔膜，分枝繁茂，直徑2-10 μ m,孢子梗分枝、不規(guī)則，對生或互生，并有多極分枝而呈現(xiàn)松柏狀，分支末端為小梗，分生孢子呈橢圓形或卵圓形，可產(chǎn)生大量的分生孢子，排列成2-4個(gè)明顯的同心輪紋，形成平展的薄層或墊狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)孢簇直徑為1-2 mm,可匯合，不產(chǎn)生擴(kuò)散性色素，也沒有明顯的氣味；菌落呈綠色，平鋪，絮狀，背面無色素；尖端生分生孢子團(tuán)，含孢子4 12個(gè)；分生孢子無色，大小為2.5 4.5X2 4um;
2、菌株2-22的rRNA基因序列測定:
包括18S rRNA片段，ITSU5.8S rRNA、ITS2的全序列及28S區(qū)序列片斷(測序引物:YX^aL) Hypocrea atroviridis (深綠木霉 / 肉座菌)Trichoderma atroviride KarstenAGGGCCTGGTCTTAGCTATAAGGCATTATACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAATACTTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGTTGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCCTCGGGGCTCTCTGGTGAATCATGATAACTAGTCGAATCGACAGGCCTTGTGCCGGCGATGGCTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTCTTGTCCAAACATGGTGGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATCGGAATGAGTACAATTT AAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGCGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGCTCAAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGATGTTACATTTTTGACGCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCCGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGCCAGCGAGTACTCCCTTGGCCGGAAGGCCTGGGTAATCTTGTTAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTACCTGCCCTTAAAAACCCCCC
三、菌株2-22的鑒定與保藏:
該菌株由中國科學(xué)院微生物研究所根據(jù)該菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和基因測序進(jìn)行分類j 鑒定為深綠木霉辦pocrea atroviridis / Trichoderma atroviridis。Hypocrea atroviridis已于2013年I月11日在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號:CGMCC N0.7128。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。

—種防治西瓜枯萎病的真菌菌劑:該菌劑以深綠木霉atroviridis)M株2-22 CGMCC N0.7128為菌種，馬丁氏固體培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為搖瓶菌種培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基；經(jīng)斜面、搖瓶菌種及發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)后制備成液體真菌菌劑；或?qū)⒃撘后w菌劑以滅菌麩皮、草炭、菇渣、豬糞或酒糟為吸附劑進(jìn)一步制備成固體真菌菌劑而獲得。一種防治西瓜枯萎病真菌菌劑的制備方法，該方法按以下步驟進(jìn)行:
(1)各級培養(yǎng)基的配制與吸附載體的準(zhǔn)備，其中:
a)以馬丁氏固體培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，備用；
b)以馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為搖瓶菌種培養(yǎng)基，備用；
c)以馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基，備用；
d)吸附載體的準(zhǔn)備:將吸附載體麩皮、草炭、菇渣、豬糞或酒糟分別調(diào)節(jié)含水率為40 50%、30 40%、40 50%、30 40%、40 50%后，在121°C條件下高溫滅菌2小時(shí)，并冷卻至室溫后，備用;
(2)斜面菌種培養(yǎng):將深綠木霉airoririi/id菌株2_22CGMCC N0.7128接種于步驟(I)斜面培養(yǎng)基上，在28— 32 0C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3— 4天，取出后直接應(yīng)用或放入冰箱中冷臧，保存；
(3)搖瓶菌種擴(kuò)繁:在無菌操作下，取一鏟斜面菌種接入60ml步驟(I)馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，于28—32°C，120—220轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)40— 64小時(shí)，取出直接應(yīng)用或放入冰箱中冷減，保存；(4)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng):將步驟(I)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，在罐內(nèi)溫度121°C，經(jīng)30分鐘蒸汽高溫滅菌；在保持罐體壓力0.02 - 0.18 MPa條件下，冷卻至28— 32°C，在火焰保護(hù)下通過接種閥門將步驟(3)搖瓶菌種按3 —10%的接種量迅速接入發(fā)酵罐內(nèi)；在攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速120— 220轉(zhuǎn)/分，溫度28— 32°C，通氣量4m3/h，罐壓0.02 — 0.18 MPa, pH自然條件下，培養(yǎng)40—64小時(shí)至發(fā)酵液菌絲體鮮重為0.5g/ml時(shí)止，裝瓶，即為液體真菌菌劑；
(5)固體菌劑的制備:將液體真菌菌劑與步驟(l)d)準(zhǔn)備的吸附載體麩皮、草炭、菇渣、豬糞或酒糟，按體積1: 20比例拌勻、吸附，在28°C，50%相對空氣濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2—7天，至檢測載體中2-22的活菌量達(dá)0.2億cfu/g以上、含水率控制在30%以下時(shí)，裝袋、封口，即為固體真菌菌劑。本發(fā)明的有益效果是:
一、本發(fā)明首次采用深綠木霉辦pocreaatroviridis菌株2_22為菌種,經(jīng)發(fā)酵制備成液體或固體菌劑后，為西瓜枯萎病的防治提供了一種新的有效途徑；
二、本菌劑通過防治西瓜枯萎病的小區(qū)試驗(yàn)后表明，能使西瓜枯萎病發(fā)病率明顯下降，大大減輕西瓜產(chǎn)量損失，本菌劑防病效果可達(dá)40%以上，西瓜連續(xù)種植二茬后，本菌劑仍能保持良好的防病效果(見實(shí)施例6)。三、使用本菌劑后可以推遲西瓜枯萎病的發(fā)病時(shí)間，降低發(fā)病程度，可減少農(nóng)藥的使用量，既減輕經(jīng)濟(jì)損失，又可減少對環(huán)境的污染；
四、本發(fā)明菌劑所采用的土豆、麩皮、菇渣、草炭、豬糞、酒糟等原料來源豐富，發(fā)酵工藝較簡單，生產(chǎn)成本較低廉，該菌劑有效保質(zhì)期在半年以上。



圖1不同處理對土壤中西瓜枯萎病菌數(shù)量的影響。
具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例對本發(fā)明作更詳細(xì)的說明，但以下實(shí)施例僅是說明性的，本發(fā)明內(nèi)容并不受這些實(shí)施例的限制。對以下實(shí)施例所涉材料的說明:
西瓜枯萎病菌-尖孢鐮刀菌:(由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所菌種保藏庫保存并提供)
蛋白胨:生化制劑，國產(chǎn)；
Yeast extract (酵母浸膏):生化試劑，國產(chǎn)；
Casein hydrolysate (洛蛋白水解物):生化試劑，國產(chǎn)；
瓊脂:生化試劑，國產(chǎn)；
K2HPO4:分析純，國產(chǎn)；
葡萄糖:分析純，國產(chǎn)；
MgSO4 7H20:分析純，國產(chǎn)；
孟加拉紅(Rose Bengal):分析純,國產(chǎn)；
鏈霉素:分析純，國產(chǎn)。實(shí)施例1:(真菌分離純化)
真菌按以下方法步驟分離純化:I培養(yǎng)基
馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基=KH2PO4 1.0g，葡萄糖 10.0g，MgSO4.7H20 0.5g，蛋白胨 5.0g，瓊脂15-20g，水1000ml ;此培養(yǎng)液1000ml加1%孟加拉紅水溶液3.3ml ；112.6°C滅菌30分鐘；臨用時(shí)每IOOml培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液0.3ml (30ppm)；
2試驗(yàn)步驟
2.1培養(yǎng)基制備:配制馬丁氏培養(yǎng)基，制備真菌斜面；
2.2 土壤稀釋液的制備
(1)稱取IOg土壤，加入IOOml帶有玻璃珠的無菌水于500ml三角瓶中，振蕩15分鐘，即 10—1 ；
(2)吸取土懸液10ml，加入90ml無菌水于500ml三角瓶中，即10_2；
(3)從(2)中吸取10ml，加入90ml無菌水于500ml三角瓶中，即10_3；
2.3真菌分離
(4)從(I)(2) (3)中分別吸取0.lml，加入到馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基平板中進(jìn)行涂布培養(yǎng)(28-30 V、3-5天)，各3個(gè)重復(fù)；
(5)選擇20-200菌落數(shù)的培養(yǎng)皿，挑取菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)(28-30°C，3-5天)；
2.4多個(gè)土樣
(6)共21個(gè)土樣，每·個(gè)土樣重復(fù)上述2.1 2.3步驟；
2.5結(jié)果:分離到真菌270多株。實(shí)施例2:(分離真菌對西瓜枯萎病菌-尖孢鐮刀菌平板拮抗試驗(yàn))
1.培養(yǎng)基
1.1固體培養(yǎng)基:
尖孢鐮刀菌培養(yǎng)基配制=MgSO4 7H200.3g，K2HP042.0g,酵母浸膏4.0g,洛蛋白水解物
8.0g,鹿糖 10.0g,瓊脂 18g,蒸懼水 IOOOml ；
馬丁氏培養(yǎng)基配制:同實(shí)施例1中2.1
1.2液體培養(yǎng)基:
尖孢鐮刀菌液體搖瓶培養(yǎng)基；尖孢鐮刀菌培養(yǎng)基不加瓊脂即可；
2、試驗(yàn)步驟
2.1培養(yǎng)基制備:
配制尖孢鐮刀菌培養(yǎng)基(固體、液體)，制備病原菌西瓜尖孢鐮刀菌斜面；
配制馬丁氏培養(yǎng)基(固體)，制備真菌斜面；
2.2平板拮抗試驗(yàn)
2.2.1菌種活化
西瓜尖孢鐮刀菌和真菌(實(shí)施例1分離菌)進(jìn)行菌種活化；
2.2.2制備西瓜尖孢鐮刀菌平板:活化尖孢鐮刀菌接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，28-30°C, 200轉(zhuǎn)/分，隔天以西瓜尖孢鐮刀菌培養(yǎng)基倒平板，凝固后每個(gè)平板中加入0.1ml尖孢鐮刀菌發(fā)酵液(發(fā)酵約40小時(shí))，涂布，28-30°C培養(yǎng)過夜，備用；
2.2.3準(zhǔn)備分離真菌斜面
活化分離真菌接入斜面進(jìn)行培養(yǎng)，28-300C，培養(yǎng)3-5天，備用；
2.2.4平板拮抗試驗(yàn):用滅菌接種鏟挖一塊帶分離真菌的瓊脂塊放入尖孢鐮刀菌平板，每個(gè)平板放5株不同拮抗真菌，3個(gè)重復(fù)；24h左右觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，主要考察抑菌圈有無及大??；
3、結(jié)果:通過平板拮抗試驗(yàn)得到拮抗效果較好的真菌共15株，其中菌株2-22對西瓜枯萎病菌的抑制效果相對最好。實(shí)施例3:(菌株2-22菌劑的制備方法I)
按以下步驟進(jìn)行:
(1)各級培養(yǎng)基的配制與吸附載體的準(zhǔn)備，其中:
a)以馬丁氏固體培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基(該基配方同實(shí)施例1)；
b)以馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為搖瓶菌種培養(yǎng)基；
馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基(PDA液體培養(yǎng)基):20%馬鈴薯浸出液IOOOml+蔗糖20g ;其中，20%馬鈴薯浸出液的制備為:稱取去皮馬鈴薯塊200g，加水IOOOml煮至馬鈴薯塊能被玻棒戳破為止，過濾，補(bǔ)足原來的水量；
c)以馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基:同搖瓶菌種培養(yǎng)基；
d)吸附載體的準(zhǔn)備:將吸附載體麩皮的含水率調(diào)節(jié)為4(Γ50%，然后在121°C的滅菌器中，聞溫滅囷2小時(shí)，待 冷卻至室溫后，備用；
(2)斜面菌種培養(yǎng):將深綠木霉菌株2-22接種于步驟(I)斜面培養(yǎng)基上，在28—32°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3— 4天，取出后直接應(yīng)用或放入4 - 7 °C冰箱中冷藏，保存；
(3)搖瓶菌種擴(kuò)繁:在無菌操作下，取一鏟斜面菌種接入60ml步驟(I)馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，于28— 32°C，120轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)40小時(shí)，取出直接應(yīng)用或放入4°C 一 7°C冰箱中冷臧，保存；
(4)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng):將步驟(I)c)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，在罐內(nèi)溫度121 °C，經(jīng)30分鐘蒸汽高溫滅菌；在保持罐體壓力0.02 MPa條件下，冷卻至28— 32°C，在火焰保護(hù)下通過接種閥門將步驟(3)搖瓶菌種按3%的接種量迅速接入發(fā)酵罐內(nèi)；在攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分，溫度28— 32°C，通氣量4m3/h，罐壓0.18 MPa, pH自然條件下，培養(yǎng)64小時(shí)至發(fā)酵液菌絲體鮮重為0.5g/ml時(shí)止，裝瓶，即為液體真菌菌劑；
(5)固體菌劑的制備:將液體真菌菌劑與步驟(l)d)準(zhǔn)備的吸附載體麩皮，按體積1:20比例拌勻、吸附，在28°C，50%相對空氣濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4天，至檢測載體麩皮中2-22的活菌量達(dá)0.2億cfu/g以上、含水率控制在30%以下時(shí)，裝袋、封口，即為固體真菌菌劑。實(shí)施例4:(菌株2-22菌劑制備方法2 )
在本例中，步驟(I) d)吸附載體的準(zhǔn)備中，將吸附載體草炭的含水率調(diào)節(jié)為3(Γ40% ;步驟(3)的搖瓶菌種擴(kuò)繁中:于28— 32°C，150轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)45小時(shí)；步驟(4)的生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)中:在保持罐體壓力0.06MPa條件下，按5%接種量迅速接入發(fā)酵罐內(nèi)；在轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，通氣量4m3/h，罐壓0.14MPa，培養(yǎng)60小時(shí)，裝瓶，即為液體真菌菌劑；在步驟
(5)固體菌劑的制備中:將液體真菌菌劑與吸附載體草炭，按體積1: 20比例拌勻、吸附，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3— 5天，至檢測載體草炭中2-22的活菌量達(dá)0.2億cfu/g以上、含水率控制在30%以下時(shí)，裝袋、封口，即為固體真菌菌劑；其余步驟、工藝同實(shí)施例3。實(shí)施例5:(菌株2-22菌劑制備方法3 )
在本例中，步驟(I)d)吸附載體的準(zhǔn)備中，將吸附載體菇渣的含水率調(diào)節(jié)為4(Γ50% ;步驟(3)的搖瓶菌種擴(kuò)繁中:于28— 32°C，180轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)50小時(shí)；步驟(4)的生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)中:在保持罐體壓力0.1OMPa條件下，按6.5%接種量迅速接入發(fā)酵罐內(nèi)；在轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分，通氣量4m3/h，罐壓0.lOMPa，培養(yǎng)50小時(shí)，裝瓶，即為液體真菌菌劑；在步驟(5)固體菌劑的制備中:將液體真菌菌劑與吸附載體菇渣，按體積1: 20比例拌勻、吸附，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4一6天，至檢測載體菇渣中2-22的活菌量達(dá)0.2億cfu/g以上、含水率控制在30%以下時(shí)，裝袋、封口，即為固體真菌菌劑；其余步驟、工藝同實(shí)施例3。實(shí)施例6:(菌株2-22菌劑制備方法4)
在本例中，步驟(I) d)吸附載體的準(zhǔn)備中，將吸附載體豬糞的含水率調(diào)節(jié)為3(Γ40% ;步驟(3)的搖瓶菌種擴(kuò)繁中:于28— 32°C，200轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)60小時(shí)；步驟(4)的生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)中:在保持罐體壓力0.14MPa條件下，按8%接種量迅速接入發(fā)酵罐內(nèi)；在轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分，通氣量4m3/h，罐壓0.06MPa，培養(yǎng)45小時(shí)，裝瓶，即為液體真菌菌劑；在步驟
(5)固體菌劑的制備中:將液體真菌菌劑與吸附載體豬糞，按體積1: 20比例拌勻、吸附，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5— 7天，至檢測載體豬糞中2-22的活菌量達(dá)0.2億cfu/g以上、含水率控制在30%以下時(shí)，裝袋、封口，即為固體真菌菌劑；其余步驟、工藝同實(shí)施例3。實(shí)施例7:(菌株2-22菌劑制備方法5 )
在本例中，步驟(l)d)吸附載體的準(zhǔn)備中，將吸附載體酒糟的含水率調(diào)節(jié)為4(Γ50% ;步驟(3)的搖瓶菌種擴(kuò)繁中:于28— 32°C，220轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)64小時(shí)；步驟(4)的生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)中:在保持罐體壓力0.18MPa條件下，按10%接種量迅速接入發(fā)酵罐內(nèi)；在轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分，通氣量4m3/h，罐壓0.02MPa，培養(yǎng)40小時(shí)，裝瓶，即為液體真菌菌劑；在步驟
(5)固體菌劑的制備中:將液體真菌菌劑與吸附載體酒糟，按體積1: 20比例拌勻、吸附，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5— 7天，至檢測載體酒糟中2-22的活菌量達(dá)0.2億cfu/g以上、含水率控制在30%以下時(shí)，裝袋、封口，即為固體真菌菌劑；其余步驟、工藝同實(shí)施例3。實(shí)施例8:(菌株2-22菌劑的應(yīng)用方法)
上述防治西瓜枯萎病真菌菌劑2-22的應(yīng)用方法是:
(1)在西瓜苗移栽前I星期，將液體真菌菌劑2-22按每株5ml菌劑量澆在育苗盤的根部基質(zhì)中；
(2)移栽時(shí)，將育苗基質(zhì)連同幼苗整體移植土壤中，待西瓜幼苗盆栽或地栽成活后，將固體真菌菌劑(按照實(shí)施例3、4、5、6、7制備，2-22的活菌量達(dá)0.2億cfu/g以上)按每株20g的用量撒于根部土壤的表層，并澆灌適量水；
(3)在西瓜苗移栽前I星期至本發(fā)明菌劑使用后的西瓜整茬的種植期間，要避免在植株根部使用其它消毒劑、殺菌劑及抗生素等真菌消殺類藥物。實(shí)施例9:(菌株2-22菌劑對西瓜尖孢鐮刀菌(枯萎病)的田間生防效果對比試驗(yàn))
1.PDA液體培養(yǎng)基和枯萎病病原菌液體培養(yǎng)基準(zhǔn)備 PDA液體培養(yǎng)基:同實(shí)施例3
2.菌株2-22發(fā)酵液的準(zhǔn)備
菌株2-22的活化，然后每株接液體搖瓶培養(yǎng)，28 30°C，200轉(zhuǎn)/分鐘，約培養(yǎng)40小時(shí)后，備用;
3.試驗(yàn)地點(diǎn)與處理 設(shè)計(jì)試驗(yàn)地點(diǎn)選擇在嘉興市東進(jìn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)內(nèi)。試驗(yàn)土壤為連續(xù)種植西瓜三年以上的連作土壤，試驗(yàn)種植的西瓜品種為嘉麗。西瓜枯萎病生防菌劑2-22由浙江省農(nóng)科院環(huán)境資源與土壤肥料研究所提供，普通商品有機(jī)肥由浙江蕭山匯仁復(fù)合有機(jī)肥公司生產(chǎn)。試驗(yàn)設(shè)處理(I)常規(guī)施肥(對照，CK);處理(2)普通有機(jī)肥20kg/小區(qū)；處理(3)按實(shí)施例3制備的麩皮生防菌劑2-22 20g固體菌劑/株；處理(4)按實(shí)施例4制備的草炭生防菌劑2-2220g固體菌劑/株；處理(5)按實(shí)施例5制備的菇渣生防菌劑2-22 20g固體菌劑/株；處理(6)按實(shí)施例6制備的豬糞生防菌劑2-22 20g固體菌劑/株；處理(7)按實(shí)施例7制備的酒糟生防菌劑2-22 20g固體菌劑/株；小區(qū)試驗(yàn)在聯(lián)動(dòng)大棚中進(jìn)行，每個(gè)處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)面積33.0m2 (田圭長16.5mX寬2.0m),不同小區(qū)間隔50cm。西瓜連續(xù)種植兩茬，春茬西瓜3月5日播種，4月6日移栽，5月7日開始授粉。秋茬8月2號播種，8月下旬移栽。4.試驗(yàn)方法
4.1育苗基質(zhì)準(zhǔn)備:將草炭、蛭石、珍珠巖按照6: 2: 2的比例混勻，然后用自來水調(diào)節(jié)含水率至60%，備用；
在育苗穴盤(規(guī)格90X60)中裝入四分之三高左右的4.1制備基質(zhì)，用手輕壓，播種后再鋪上一層薄薄的基質(zhì)，并用塑料膜蓋住穴盤，防止水分蒸發(fā)，備用；
4.2育苗:利用穴盤基質(zhì)育苗，育苗數(shù)量按照各處理所需幼苗數(shù)的2倍分別進(jìn)行準(zhǔn)備，其中處理(I)與處理(2)育苗時(shí)，在育苗基質(zhì)中添加營養(yǎng)土質(zhì)量2%的普通商品有機(jī)肥；基質(zhì)營養(yǎng)土拌勻裝盆后，挑選飽滿一致的種子播種于穴盤中，每孔I粒種子，保持基質(zhì)含水率為50%左右，維持育苗棚內(nèi)最低溫度不低于10°C。出苗后，掀掉塑料膜，培養(yǎng)至兩子葉平展，備用；苗移栽入盆前I周，于處理(3)、(4)、(5)、(6)、(7)基質(zhì)育苗盆的每穴中加入5ml菌株2-22發(fā)酵液，處理I 與處理2的對照苗中不加入2-22發(fā)酵液。4.3整地與施肥:大田翻地整地后，將化肥和普通有機(jī)肥散施畦面，再翻入土里，大田基肥統(tǒng)一按每畝施用復(fù)合肥30kg、硫酸鉀15kg和鈣鎂磷肥25kg，普通有機(jī)肥作為基肥一次性全部施入土壤中，待幼苗移栽成活后，按照20g/株的用量一次性施入各固體生防菌劑2-22，其他措施與當(dāng)?shù)匚鞴铣Ｒ?guī)生產(chǎn)操作方法一致。4.4幼苗移栽:挑選健壯的長勢一致的西瓜幼苗，連同育苗基質(zhì)一起移入大田土壤中，每小區(qū)定植48株。4.5田間管理:在整個(gè)西瓜生長期內(nèi)施肥時(shí)間、施肥品種、施肥量、中耕除草、澆水次數(shù)及每次澆水量各小區(qū)均一致，試驗(yàn)期間，一律不得使用土壤消毒劑之類的化學(xué)與生物制劑，其他病蟲害防治所用藥物及操作均完全一致，
4.6考查記載與測試:田間觀察西瓜各生育期的長勢及葉片顏色等情況，記載各小區(qū)枯萎病發(fā)病情況及西瓜產(chǎn)量，測定各處理土壤中西瓜枯萎病菌-尖孢鐮刀菌數(shù)量。5、結(jié)果
表1、固體發(fā)酵菌劑對西瓜枯萎病的防治效果(春茬)
權(quán)利要求
1.深綠木霉C/^ocrea airoFirit/is)菌株 2-22 CGMCC No. 7128。
2.一種防治西瓜枯萎病的真菌菌劑其特征在于該菌劑以深綠木霉(Mypocreaatroviridis)菌株2_22 CGMCC No. 7128為菌種，馬丁氏固體培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基,馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為搖瓶菌種培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)基；經(jīng)斜面、搖瓶菌種及發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)后制備成液體真菌菌劑；或?qū)⒃撘后w菌劑以滅菌麩皮、草炭、菇渣、豬糞或酒糟為吸附劑進(jìn)一步制備成固體真菌菌劑而獲得。
3.一種防治西瓜枯萎病真菌菌劑的制備方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行 (1)各級培養(yǎng)基的配制與吸附載體的準(zhǔn)備，其中 a)以馬丁氏固體培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，備用； b)以馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為搖瓶菌種培養(yǎng)基，備用； c)以馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基為生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基，備用； d)吸附載體的準(zhǔn)備將吸附載體麩皮、草炭、菇渣、豬糞或酒糟分別調(diào)節(jié)含水率為40 50%、30 40%、40 50%、30 40%、40 50%后，在121°C條件下高溫滅菌2小時(shí)，并冷卻至室溫后，備用; (2)斜面菌種培養(yǎng)將深綠木霉airoririi/id菌株2_22CGMCC No. 7128接種于步驟(I)斜面培養(yǎng)基上，在28— 32 0C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3— 4天，取出后直接應(yīng)用或放入冰箱中冷臧，保存； (3)搖瓶菌種擴(kuò)繁在無菌操作下，取一鏟斜面菌種接入60ml步驟(I)馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，于28—32°C，120—220轉(zhuǎn)/分的搖床中，培養(yǎng)40— 64小時(shí)，取出直接應(yīng)用或放入冰箱中冷減，保存； (4)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)將步驟(I)生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐中，在罐內(nèi)溫度121°C，經(jīng)30分鐘蒸汽高溫滅菌；在保持罐體壓力O. 02 - O. 18 MPa條件下，冷卻至28— 32°C，在火焰保護(hù)下通過接種閥門將步驟(3)搖瓶菌種按3 —10%的接種量迅速接入發(fā)酵罐內(nèi)；在攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速120— 220轉(zhuǎn)/分，溫度28— 32°C，通氣量4m3/h，罐壓O. 02 — O. 18 MPa, pH自然條件下，培養(yǎng)40—64小時(shí)至發(fā)酵液菌絲體鮮重為O. 5g/ml時(shí)止，裝瓶，即為液體真菌菌劑； (5)固體菌劑的制備將液體真菌菌劑與步驟(l)d)準(zhǔn)備的吸附載體麩皮、草炭、菇渣、豬糞或酒糟，按體積I : 20比例拌勻、吸附，在28°C，50%相對空氣濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2—7天，至檢測載體中2-22的活菌量達(dá)O. 2億cfu/g以上、含水率控制在30%以下時(shí)，裝袋、封口，即為固體真菌菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治西瓜枯萎病的真菌菌劑及其制備方法，屬于瓜類土傳病害的生物防治技術(shù)領(lǐng)域。方法包括各級培養(yǎng)基的配制與吸附載體的準(zhǔn)備；斜面菌種培養(yǎng)；搖瓶菌種擴(kuò)繁；生產(chǎn)發(fā)酵罐培養(yǎng)；固體菌劑的制備等步驟。本發(fā)明以深綠木霉(Hypocreaatroviridis)菌株2-22CGMCCNo.7128為菌種，經(jīng)發(fā)酵制備成液體和/或固體菌劑后，可推遲西瓜枯萎病的發(fā)病時(shí)間，降低發(fā)病率40％以上，西瓜連續(xù)種植二茬后，仍能保持良好的防病效果。本菌劑原料豐富、工藝簡單，成本較低廉，保質(zhì)期在半年以上，可在西瓜種植地區(qū)推廣應(yīng)用。
文檔編號A01P3/00GK103255064SQ20131012001
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者洪春來, 王衛(wèi)平, 薛智勇, 朱鳳香, 姚燕來, 陳曉旸 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院