專利名稱：重組桿狀病毒感染家蠶的一種新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組病毒感染技術(shù)，尤其涉及一種重組病毒感染家蠶的方法。
背景技術(shù)：
昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(BacuLovirus Expression Vector System,簡稱BEVS)是利用攜帶有外源目的基因的重組昆蟲桿狀病毒作載體在昆蟲體內(nèi)或昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞進行表達生產(chǎn)的一個重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)。由于該系統(tǒng)具有可以利用昆蟲個體或其培養(yǎng)細(xì)胞進行大規(guī)模的高效表達生產(chǎn)等優(yōu)點而成為目前最有效的真核表達系統(tǒng)之一。目前BEVS主要包括歐美國家正在廣泛應(yīng)用的苜猜銀紋夜蛾核型多角體病毒iAutographa californicanucleopolyhedrosis virus,簡稱AcNPV)和在中國、日本應(yīng)用較多的的家蠶核型多角體病鶯 iBombyx mori nucleopolyhedrosis virus,簡稱BmNPV)兩類表達系統(tǒng)(Smith et al., 1983; Maeda et al.，1984，1985)。家蠶BmNPV表達系統(tǒng)由于可以利用我國飼養(yǎng)量最大的經(jīng)濟昆蟲一家蠶作為表達載體，從而具有成本低、適合規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點，非常具有我國特色(呂鴻聲，1998)。然而，目前的感染技術(shù)都是采用將重組病毒直接注射入家蠶體內(nèi)的方法進行感染表達，在實際操作過程中由于需要逐條家蠶進行注射，花費時間長，操作繁瑣，而且由于家蠶在注射過程中由于蟲體蠕動等原因，造成病毒液流出體外，最終導(dǎo)致感染失敗，因此目前傳統(tǒng)的經(jīng)皮注射方法缺陷明顯，工作效率低下。為了提高桿狀病毒表達系統(tǒng)的工作效率，有必要開發(fā)出更加高效的感染方式。通過反復(fù)試驗，我們發(fā)現(xiàn)將病毒液涂于家蠶幼蟲體表，也能實現(xiàn)病毒進入蟲體，最終導(dǎo)致病毒的感染，達到與經(jīng)皮注射感染一樣的效果O

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組桿狀病毒經(jīng)皮感染家蠶的新方法。為了達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
本發(fā)明重組家蠶桿狀病毒經(jīng)皮感染家蠶的方法是將家蠶幼蟲集中于飼養(yǎng)框內(nèi)；以100頭家蠶幼蟲噴射5ml重組家蠶桿狀病毒液為標(biāo)準(zhǔn)，將含有IO6 Pfu的重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表；噴射后I小時內(nèi)不飼喂桑葉，待大部分病毒液干燥后，按照常規(guī)方法飼養(yǎng)家蠶幼蟲，直至家蠶幼蟲出現(xiàn)病毒感染癥狀。進一步地，本發(fā)明所述家蠶幼蟲為3齡或4齡。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是
(I)本發(fā)明方法實施的結(jié)果表明，通過將重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表，也能使病毒進入家蠶體內(nèi)；由于家蠶與其他昆蟲一樣，有一個開放式的血液循環(huán)系統(tǒng)，一旦病毒進入血液，病毒就能夠很快感染，并向周圍組織擴散，最終實現(xiàn)全身感染。(2)家蠶-桿狀病毒表達系統(tǒng)有可能成為我國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化中的一個有力工具，本發(fā)明較好地解決了重組病毒感染操作繁瑣、效率低下的問題，簡化了病毒感染方法，大大提高了桿狀病毒表達系統(tǒng)的工作效率。


(I)圖I是家蠶幼蟲的血液樣品在熒光倒置顯微鏡下觀察的照片，其中，圖I (a)為無感染的家蠶幼蟲的血液樣品；圖I (b)為被重組家蠶桿狀病毒感染后的家蠶幼蟲的血液樣品，且出現(xiàn)綠色熒光 。(2)圖2是無感染家蠶幼蟲與被重組家蠶桿狀病毒感染的家蠶幼蟲的癥狀對照圖，其中，圖2 (a)為無感染家蠶幼蟲；圖2 (b)為被重組家蠶桿狀病毒感染的家蠶幼蟲。
具體實施例方式以下進一步詳細(xì)介紹本發(fā)明方法
I.材料重組家蠶桿狀病毒采用目前已經(jīng)非常成熟的技術(shù)構(gòu)建，具體方法可以參見國內(nèi)外發(fā)表的論文，如2006年發(fā)表在《蠶業(yè)科學(xué)》的“利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子構(gòu)建適用于家蠶的Bac-to-Bac快速基因表達系統(tǒng)”一文，32 (2):183_188。利用上述家蠶的Bac-to-Bac技術(shù)構(gòu)建一個表達報告基因綠色熒光蛋白EGFP的重組家蠶桿狀病毒，利用該病毒，使用本發(fā)明方法經(jīng)皮感染家蠶幼蟲。在以下實施例中，使用家蠶雜交種，品種名稱為秋豐X白玉，家蠶幼蟲以桑葉飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為23 25°C。在以下實施例中，重組家蠶桿狀病毒經(jīng)皮感染家蠶的方法如下
將家蠶3齡或4齡幼蟲集中于飼養(yǎng)框內(nèi)；以100頭家蠶噴射5ml病毒液為標(biāo)準(zhǔn)，用小型噴霧器將含有IO6 pfu (病毒感染單位)的重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表，并在噴射后I小時內(nèi)不飼喂桑葉；之后在大部分或全部病毒液體干燥后，按照常規(guī)方法飼養(yǎng)家蠶，直至家蠶幼蟲出現(xiàn)圖2 (b)所示的病毒感染癥狀。感染效果測定在將重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表72-96小時后，取家蠶幼蟲的少量血液置于載玻片上，在熒光倒置顯微鏡下觀察是否出現(xiàn)病毒感染產(chǎn)生的綠色熒光如圖I (b)所示，如果有，則說明該家蠶幼蟲已被重組家蠶桿狀病毒感染。在重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表后的120小時左右，進一步觀察家蠶幼蟲的發(fā)病癥狀。結(jié)果分析在將重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表后的96小時左右，在熒光倒置顯微鏡下觀察觀察家蠶幼蟲的血液時，即可發(fā)現(xiàn)有明顯的綠色熒光參見圖I(b)；而未感染病毒的家蠶幼蟲的血液樣品則不會產(chǎn)生突光參見圖I (a)。在重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表后的120小時左右，即可發(fā)現(xiàn)家蠶幼蟲出現(xiàn)典型的病毒感染癥狀，如食欲減退，體表發(fā)亮，體節(jié)腫脹，狂躁爬行等對照圖2(a)和圖2 (b)，進一步說明家蠶幼蟲已被病毒感染，重組蛋白-綠色熒光蛋白獲得了表達。
權(quán)利要求
1.一種重組家蠶桿狀病毒經(jīng)皮感染家蠶的方法，其特征在于將家蠶幼蟲集中于飼養(yǎng)框內(nèi)；以100頭家蠶幼蟲噴射5ml重組家蠶桿狀病毒液為標(biāo)準(zhǔn)，將含有IO6 Pfu的重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表；噴射后I小時內(nèi)不飼喂桑葉，待大部分病毒液干燥后，按照常規(guī)方法飼養(yǎng)家蠶幼蟲，直至家蠶幼蟲出現(xiàn)病毒感染癥狀。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組家蠶桿狀病毒經(jīng)皮感染家蠶的方法，其特征在于所述家蠶幼蟲為3齡或4齡。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組家蠶桿狀病毒經(jīng)皮感染家蠶的方法將家蠶幼蟲集中于飼養(yǎng)框內(nèi)；以100頭家蠶幼蟲噴射5ml重組家蠶桿狀病毒液為標(biāo)準(zhǔn)，將含有106pfu的重組家蠶桿狀病毒液噴射于家蠶幼蟲的體表；噴射后1小時內(nèi)不飼喂桑葉，待大部分病毒液干燥后，按照常規(guī)方法飼養(yǎng)家蠶幼蟲，直至家蠶幼蟲出現(xiàn)病毒感染癥狀。本發(fā)明方法的優(yōu)點在于改變了傳統(tǒng)直接使用經(jīng)皮感染的接種方式，簡化了接種操作，節(jié)省了接種時間，提高了昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的工作效率。
文檔編號A01K67/04GK102885011SQ20121042039
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者楊銳, 沈運旺, 吳小鋒 申請人:浙江大學(xué)