用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的引物、試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種能夠快速鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的多重引物，所述多重引物分別根據(jù)如SEQ ID NO:11?12所示的序列中的至少一條以及SEQ ID NO:13?15所示的序列中的至少一條設(shè)計。本發(fā)明還提供一種用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的方法以及試劑盒，其使用所述多重引物。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有具有高度的特異性和準確性，在棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒生物農(nóng)藥的生產(chǎn)中提高產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)控效率具有重要意義。
【專利說明】
用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體 病毒的引物、試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾 核型多角體病毒的多重引物、試劑盒和方法，更具體地，涉及使用多重引物PCR鑒別棉鈴蟲 核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的多重引物、試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉鈴蟲（Helicoverpa armigera(Hiibner))屬于鱗翅目夜蛾科，是我國的一種主要 經(jīng)濟作物害蟲，它嚴重為害棉花、玉米、土豆、西紅柿和小麥等60多種經(jīng)濟作物，并且長期的 化學(xué)農(nóng)藥防治已造成了它嚴重的抗藥性。因此，使用生物農(nóng)藥防治棉鈴蟲勢在必行。能夠感 染棉鈴蟲的桿狀病毒主要有棉鈴蟲核型多角體病毒（Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus，HaNPV)、和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcNPV)，兩者隸屬桿狀病毒科核型多角體病毒屬，是 棉鈴蟲的天然病原體，具有較強的專化性，害蟲不易對其產(chǎn)生抗性;其后效作用明顯，當(dāng)環(huán) 境條件適合時，患病蟲體內(nèi)擴增的病毒釋放到棉鈴蟲種群中可以造成病毒病的流行。雖然 兩者均能感染棉鈴蟲，但是其防治效果具有較大差別。HaNPV，即棉鈴蟲核型多角體病毒，在 長期的進化中對中國棉鈴蟲具有更強的種群和侵染優(yōu)勢。把HaNPV制成生物農(nóng)藥用于防治 棉鈴蟲，效果非常顯著。目前，HaNPV原藥和制劑已取得農(nóng)藥登記許可，并在國內(nèi)外均已得到 了廣泛應(yīng)用。
[0003] 但是，在以棉鈴蟲為宿主的病毒生物農(nóng)藥生產(chǎn)過程中，棉鈴蟲核型多角體病毒和 苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒容易產(chǎn)生交叉污染，因此，如何快速準確地鑒別核型多角體 病毒對于產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控具有重要意義。
[0004] 目前，棉鈴蟲核型多角體病毒的常規(guī)鑒別方法，主要采用生物測定或者限制性內(nèi) 切酶圖譜鑒定。生物測定法通常采用待測病毒飼喂棉鈴蟲幼蟲，如果接種后統(tǒng)計棉鈴蟲的 死亡率達到80%以上，而同樣方法測試對照組甜菜夜蛾或斜紋夜蛾，則死亡率小于20%，以 此確定測試病毒為棉鈴蟲核型多角體病毒。但是，生物測定的方法通常需要十天才能完成， 存在周期過長、操作步驟復(fù)雜和準確性差的缺點。而限制性內(nèi)切酶圖譜鑒定法，可鑒別不同 寄主來源或者同種寄主NPV不同地區(qū)的分離株，但仍存在周期長、操作步驟復(fù)雜和鑒定準確 性不高的問題。而在生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中需要大量的檢測工作，因此，上述兩種方法已經(jīng) 不能滿足常規(guī)檢測。目前亟需建立一種簡便快捷、靈敏度高、重復(fù)性好的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠快速鑒別棉鈴蟲核型 多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的試劑盒和方法，本發(fā)明的試劑盒和方法采用 多重PCR法，其具有簡便快捷、靈敏度高、重復(fù)性好、低成本、通量高等優(yōu)點。并且本發(fā)明提供 的試劑盒和方法能夠一次同時檢測同一宿主的多種病毒，這也為棉鈴蟲核型多角體病毒的 鑒別提供了新的檢測手段。
[0006] 針對上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] -方面，本發(fā)明提供一種用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多 角體病毒的多重引物，其中，所述多重引物至少包括以下引物對：
[0008] 根據(jù)SEQ ID NO:11-12所示的序列中的至少一條設(shè)計的引物對以及根據(jù)SEQ ID NO: 13-15所示的序列中的至少一條設(shè)計的引物對。
[0009] 優(yōu)選地，所述多重引物中至少包括根據(jù)SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:14所示的序列 設(shè)計的引物對。
[0010]其中，所述SEQ ID N0:11示出為棉鈴蟲核型多角體病毒的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS序 列），其NCBI ID為AF271059.2_cds_AAG53834.1_90，該CDS序列大小為 1134bp，共編碼378個 氨基酸。
[0011] 其中，所述SEQ ID N0:12示出為棉鈴蟲核型多角體病毒的CDS序列，其NCBI ID為 AF271059.2_cds_AAG53876.1_133，該 CDS 序列大小為 2034bp，共編碼678個氨基酸。
[0012]其中，所述SEQ ID N0:13示出為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的編碼蛋白基因 Ac-helicase，其NCBI ID為KM667940.l_cds_AIU56967.l_94,該基因大小為3666bp，共編碼 1222個氨基酸。
[0013] 其中，所述SEQ ID N0:14示出為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的編碼蛋白基因 Ac-IE-1，其NCBI ID為KM667940.1_cds_AIU56990.1_142,該基因大小為 1749bp，共編碼583 個氨基酸。
[0014] 其中，所述SEQ ID N0:15示出為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的編碼蛋白基因 Ac-gp64，其NCBI ID為KM667940 · l_cds_AIU56980 · 1_123，該基因大小為2073bp，共編碼691 個氨基酸。
[0015] 優(yōu)選地，所述多重引物包括根據(jù)如SEQ ID N0:11-15所示的序列設(shè)計的五對特異 性引物。
[0016] 優(yōu)選地，所述多重引物包括如SEQ ID N0:1和2、SEQ ID N0:3和4、SEQ ID N0:5和 6、SEQ ID N0:7和8以及SEQ ID N0:9和10所示的引物對中的至少兩對。
[0017] 優(yōu)選地，所述多重引物包括如SEQ ID NO: H0所示的五對引物。
[0018] 再一方面，本發(fā)明提供一種用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型 多角體病毒的方法，所述方法為多重PCR方法，其使用本發(fā)明的多重引物。
[0019] 具體地，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0020] 1)提取待測樣品的DNA，作為DNA模板；
[0021 ] 2)使用本發(fā)明的多重引物和聚合酶鏈式反應(yīng)試劑，在PCR擴增儀上進行多重PCR; [0022 ] 3)對擴增得到的產(chǎn)物進行電泳鑒別。
[0023 ]優(yōu)選地，本發(fā)明所述的方法可以為一步法多重PCR方法。
[0024] 在一個優(yōu)選的實施方案中，該PCR的反應(yīng)條件如下：
[0025] 在95°C預(yù)變性10min后，擴增30個循環(huán)（循環(huán)條件：95°C30秒，56°C30秒，72°C1分 鐘），最后延伸5分鐘。
[0026] 對擴增得到的PCR產(chǎn)物進行濃度1 %的瓊脂糖凝膠電泳。
[0027] 優(yōu)選地，在步驟2)中，所述聚合酶鏈式反應(yīng)試劑包括PCR緩沖液、dNTP、Taq酶和本 申請的多重引物組合物。
[0028] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型 多角體病毒的試劑盒，所述試劑盒包括:用于提取待測樣品DNA的試劑;及用于多重PCR的試 劑。
[0029] 優(yōu)選地，所述多重PCR試劑包括本發(fā)明的多重引物和聚合酶鏈式反應(yīng)的常規(guī)試劑。
[0030] 再一方面，本發(fā)明提供一種用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型 多角體病毒的試劑盒在鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒中的 應(yīng)用。
[0031 ]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點：
[0032] 1)本發(fā)明提供的PCR鑒別方法具有高度的特異性和準確性。
[0033] 2)常規(guī)的病毒鑒別方法如生物測定法需要10天時間，酶切鑒定需要3-5天的時間， 而本申請的PCR法只需數(shù)小時。
[0034] 3)本發(fā)明采用的一步法多重PCR檢測方法，將PCR緩沖液、Taq酶、dNTP、引物組合物 預(yù)混成Ha&Ac one-step PCR Mix，將多種酶配比混合，使反應(yīng)液配制更為簡單方便，縮短操 作時間，同時避免了操作污染。
[0035] 4)本發(fā)明的方法操作簡便、敏感性好、方便快捷。
[0036] 5)本發(fā)明的用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒多 重PCR檢測試劑盒，在棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒生物農(nóng)藥的 生產(chǎn)中提高產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)控效率具有重要意義。
【附圖說明】
[0037] 以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：
【附圖說明】
[0038]
[0039] 圖1為使用本發(fā)明的多重引物進行PCR的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，從該結(jié)果中我們可 以判斷得知，待測樣品中既含有鈴蟲核型多角體病毒(他即￥，695匕？，972匕？），又含有苜蓿銀 紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV，312bp，1126bp，1222bp)。
[0040] 圖2為使用傳統(tǒng)的限制性酶切反應(yīng)鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核 型多角體病毒的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0041] 本發(fā)明所使用的棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒樣品來 自中國科學(xué)院動物研究所。
[0042] 實施例1DNA模板制備
[0043] 1)分別取經(jīng)純化的棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒試樣 lg，并且根據(jù)以下步驟分別制備兩種病毒的DNA模板
[0044] 2)在所述試樣中分別加入堿解液(0.15M NaCl，0.1M Na2C03,0.5M EDTA，pH8.0) 750微升，在37°C，1小時；
[0045] 3)加入0 · IN的HC1調(diào)pH至8 · 0，加入SDS至終濃度為0 · 5 %，加入蛋白酶K( 20mg/ml) 至終濃度0 · 25mg/ml，37 °C 2h，65 °C 2h;
[0046] 4)加入等量氯仿異戊醇混合物(氯仿：異戊醇=24:1)抽提1次，12000rpm/min，離 心5min;
[0047] 5)輕輕吸取上層水相，置于新的離心管中，加入等量氯仿，12000rpm/min，離心 5min；
[0048] 6)取上層水相轉(zhuǎn)入新管中，加入2倍體積無水乙醇混勻后，lOOOOrpm/min離心 lOmin；
[0049] 7)棄去上清液，沉淀用70%乙醇洗滌，10000rpm/min離心10min;
[0050] 8)再次去掉上清液，讓沉淀的DNA在室溫下干燥；
[0051 ] 9)加入100微升水溶解DNA，從而獲得試樣DNA。
[0052] 實施例2引物設(shè)計合成
[0053]本申請中，分別以棉鈴蟲核型多角體病毒的兩個蛋白編碼序列（NCBI ID: AF271059.2_cds_AAG53834.l_90和NCBI ID:AF271059.2_cds_AAG53876.1_133)、苜蓿銀紋 夜蛾核型多角體病毒基因組中的Ac-helicase基因 （NCBI ID:KM667940 . l_cds_ AIU56967.1_94)、Ac-IE-l基因 （NCBI ID:KM667940.1_cds_AIU56990.1_142)和Ac-gp64基 因 （NCBI ID :KM667940. l_cds_AIU56980.1_123)設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，以實現(xiàn)同時 對以棉鈴蟲為宿主的兩種桿狀病毒的檢測。
[0054]引物對（由北京天一輝遠生物科技有限公司合成），PAGE級純化，詳細序列見表1。 [0055] 表1PCR引物序列
[0057] 實施例3棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的鑒別
[0058] 3.1-步法PCR預(yù)混體系（Ha&Ac one-step PCR Mix^
[0059] PCR預(yù)混體系為50μ1，含：
[0061] * :北京全式金生物技術(shù)有限公司
[0062] 3.2PCR 反應(yīng)程序:
[0063] 在 95°C 預(yù)變性 lOmin 后，擴增 30 個循環(huán)（循環(huán)條件：95°C30s，56°C30s，72°Clmin)， 最后延伸5min。
[0064] 3.3PCR產(chǎn)物的電泳檢測:
[0065] 將PCR產(chǎn)物在1.0 %的瓊脂糖凝膠上進行電泳，100V，40min，在紫外光下檢測。
[0066] 3.4病毒鑒別
[0067]由于棉鈴蟲核型多角體病毒DNA經(jīng)PCR會擴增出兩條帶，片段大小為695bp和972bp (表 2)。
[0068]而苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒DNA經(jīng)PCR會擴增出三條帶，片段大小分別為 303bp，1126bp和1222bp(表2)。并且使用瓊脂糖凝膠電泳時可見兩者有明顯區(qū)別（如圖1所 示)。
[0069]因此，在實際操作中：
[0070] 1)如果待測樣品的電泳圖譜中出現(xiàn)了五種大小不同的擴增條帶，證明樣品中同時 包括棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒；
[0071] 2)如果待測樣品的電泳圖譜中出現(xiàn)了312匕？，1126匕？，1222匕?三種擴增條帶，證明 待測樣品為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒；
[0072] 3)如果待測樣品的電泳圖譜中出現(xiàn)了695bp，972bp二種擴增條帶，證明待測樣品 為棉鈴蟲核型多角體病毒。
[0073]表2用于鑒定棉鈴蟲病毒和苜蓿銀紋夜蛾病毒的序列
[0075] HaNPV G^SHeliocoverpa armigera nucleopolyhedrovirus G4，NCBI序列號 AF271059.2
[0076] AcNPV E2*2，Autographa californica nucleopolyhedrovirus strain E2，NCBI 序列號 KM667940.1
[0077] 對比例1使用限制性酶切反應(yīng)鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多 角體病毒
[0078]采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，使用限制性酶EcoRV酶切，鑒別棉鈴蟲核型多角 體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，得到的結(jié)果如圖2所示，由此可知采用傳統(tǒng)的限制 性酶切反應(yīng)鑒別病毒，反應(yīng)步驟繁瑣，條帶多，給鑒定工作帶來麻煩。
[0079]綜合分析：
[0080]以上結(jié)果證明了該多重引物PCR鑒別檢測方法的特異性和準確性。常規(guī)的病毒鑒 別方法如生物測定法需要10天時間，酶切鑒定需要3-5天的時間，而多重PCR法只需數(shù)小時， 而且其具有良好的特異性和敏感性。
[0081 ] 本發(fā)明采用的一步法多重PCR檢測方法，將PCR buffer，Taq酶，dNTP，引物組合物 預(yù)混成Ha&Ac one-step PCR Mix，將多種酶配比混合，使反應(yīng)液配制更為簡單方便，縮短操 作時間，同時避免了操作污染。
[0082]因此本方法建立了針對棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒 的快速檢測方法。該方法操作簡便、敏感性好、方便快捷，適合用于開發(fā)鑒別棉鈴蟲核型多 角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒多重PCR檢測試劑盒，在棉鈴蟲核型多角體病毒 和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒生物農(nóng)藥的生產(chǎn)中提高產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)控效率具有重要意 義。
【主權(quán)項】
1. 一種用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的多重引物， 其中，所述多重引物至少包括以下引物對： 根據(jù)SEQ ID NO:11-12所示的序列中的至少一條設(shè)計的引物對以及根據(jù)SEQ ID NO: 13-15所示的序列中的至少一條設(shè)計的引物對。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重引物，其中，所述多重引物至少包括分別根據(jù)SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 14所示的序列設(shè)計的引物對。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多重引物，其中，所述多重引物包括根據(jù)如SEQ ID NO: 11-15所示的序列分別設(shè)計的五對特異性引物對。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的多重引物，其中，所述多重引物包括如SEQ ID NO: 1 和2、SEQ ID N0:3和4、SEQ ID N0:5和6、SEQ ID N0:7和8以及SEQ ID N0:9和 10所示的引 物對中的至少兩對。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的多重引物，其中，所述多重引物如SEQ ID NO: 1-10 所示。6. -種用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的多重PCR方 法，其中使用如權(quán)利要求1-5中任一項所述的多重引物； 優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟： 1) 提取待測樣品的DNA，作為DNA模板； 2) 使用如權(quán)利要求1-5中任一項所述的多重引物和聚合酶鏈式反應(yīng)試劑，在PCR擴增儀 上進行多重PCR; 3) 對擴增得到的產(chǎn)物進行電泳鑒別； 優(yōu)選地，所述的多重PCR方法可以為一步法多重PCR方法。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述多重PCR的反應(yīng)條件如下： 在95 °C預(yù)變性IOmin后，擴增30個循環(huán)，循環(huán)條件為95 °C 30秒，56 °C 30秒，72 °C 1分鐘，最 后延伸5分鐘； 優(yōu)選地，對擴增得到的產(chǎn)物進行濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳。8. -種用于鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒的試劑盒，所 述試劑盒包括： 用于提取待測樣品DNA的試劑； 及用于多重PCR的試劑，其中，所述多重PCR試劑包括如權(quán)利要求1 -5中任一項所述的多 重引物。9. 如權(quán)利要求1-5中任一項所述的多重引物、如權(quán)利要求6或7所述的方法或如權(quán)利要 求8所述的試劑盒在鑒別棉鈴蟲核型多角體病毒和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒中的應(yīng) 用。
【文檔編號】C12N15/11GK105950782SQ201610341944
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】張寰, 秦啟聯(lián), 張繼紅, 李瑄, 王紅托, 程清泉, 方分分, 周桂靈, 苗麟
【申請人】河南省濟源白云實業(yè)有限公司, 中國科學(xué)院動物研究所