重組載體、利用該載體制備的重組桿狀病毒以及該病毒在瘧疾疫苗制備中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種經(jīng)改造的桿狀病毒載體即重組載體，利用該載體制備的含目的基因(約氏瘧原蟲表面蛋白PyS48基因)的重組桿狀病毒，該重組桿狀病毒的制備方法，該重組桿狀病毒表達(dá)的融合蛋白，以及該重組桿狀病毒和該融合蛋白在痕疾疫苗制備中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]由媒介蚊蟲傳播的瘧疾是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的感染性疾病。據(jù)2011年WH0《2011年世界瘧疾報告》指出，2010年，在全球106個瘧疾流行國家及地區(qū)共發(fā)現(xiàn)約2.16億病歷，其中86%的瘧疾病歷是5歲以下兒童。瘧疾疫苗的研制和開發(fā)是控制瘧疾傳播的重要策略之一，且隨著越來越多的瘧原蟲耐藥株被發(fā)現(xiàn)，瘧疾疫苗的研制顯的尤為重要，不少瘧疾疫苗已進(jìn)入臨床試驗，現(xiàn)階段，多時期多價疫苗的研制成為瘧疾疫苗研究的熱點。
[0003]約氏瘧原蟲表面蛋白Pys48是其有性生殖階段配子體時期的表面蛋白，其結(jié)構(gòu)高度保守，含有兩段P48-45超家族序列，和其他瘧原蟲的P48蛋白同源性高，常被用作實驗室建立模型為其他瘧疾的研究提供參考。
[0004]目前世界上常用大腸桿菌和酵母表達(dá)蛋白制備疫苗，而用大腸桿菌表達(dá)的蛋白大多數(shù)無免疫原性和保護(hù)性，酵母表達(dá)制備疫苗效果也不是很理想。哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(CHO)等表達(dá)系統(tǒng)雖然效果好，但因表達(dá)量低，同時需大量培養(yǎng)基和牛血清蛋白，成本高，不適合生產(chǎn)需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組桿狀病毒載體，利用該載體構(gòu)建表面展示約氏瘧原蟲Pys48抗原的重組桿狀病毒，通過簡單地分離純化病毒粒子，制備抗體具有良好的抗體效價，能夠為P48痕疾疫苗的研究提供參考。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
[0007]一種重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM,該重組載體由一段重組序列插入到pFastBacDual載體中構(gòu)建而成,所述重組序列為根據(jù)CMV、Ph、SP、TM已知序列,在SP和TM核苷酸序列間加入EcoR I酶切位點和Xho I酶切位點，CMV-F前加入KpnI酶切位點，TM-R后加入HindIII酶切位點形成，所述重組序列全長為923bp JBSEQ ID NO:1所示。
[0008]具體地,所述重組序列插入到pFastBacDual載體的KpnI酶切位點和HindIII酶切位點之間。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步提供利用上述重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM構(gòu)建的重組桿狀病毒BmPys48，該重組桿狀病毒由約氏瘧原蟲Pys48抗原基因插入到重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM并通過轉(zhuǎn)座與穿梭載體Bacmid的基因組進(jìn)行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA，然后將重組桿狀病毒基因組DNA轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，在家蠶細(xì)胞內(nèi)包裝得到表面展示有約氏瘧原蟲Pys48抗原的重組桿狀病毒。
[0010]具體地，所述約氏瘧原蟲Pys48抗原基因插入到重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoR I酶切位點和Xho I酶切位點之間。
[0011]具體地，所述家蠶細(xì)胞為家蠶BmN細(xì)胞。
[0012]穿梭載體Bacmid (即Baculovirus plasmid)為帶有桿狀病毒基因組的質(zhì)粒,可在細(xì)菌和昆蟲細(xì)胞之間穿梭，是Bac-to-bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的成員之一，該系統(tǒng)還包括供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒及大腸桿菌，為現(xiàn)有技術(shù)。
[0013]載體pFastBacDual是Bac_to_bac表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒,可以插入外源基因并在輔助質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶作用下，將外源基因插入到Bacmid中。載體pFastBacDual已經(jīng)商品化;CMV啟動子為哺乳動物啟動子，將其插入桿狀病毒后，桿狀病毒可以在哺乳動物里表達(dá)外源基因。
[0014]上述重組桿狀病毒BmPys48的制備方法，包括以下步驟:
[0015](I)通過PCR擴增的方法得到約氏瘧原蟲Pys48抗原基因，然后將約氏瘧原蟲Pys48抗原基因連接到重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM的EcoRI酶切位點和Xho I酶切位點之間，得到重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys48-TM ；
[0016](2)將重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒PFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys48-TM轉(zhuǎn)化含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，避光培養(yǎng)40_48h后挑取白斑，白斑繼續(xù)培養(yǎng)24-48h后抽提重組桿狀病毒基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定；
[0017](3)取步驟(2)鑒定正確的重組桿狀病毒基因組DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，發(fā)病后獲得一代病毒懸液，提取病毒基因組再次進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的即為表面展示約氏瘧原蟲Pys48抗原的重組桿狀病毒BmPys48。
[0018]上述重組桿狀病毒BmPys48所表達(dá)的融合蛋白SP-Pys48_TM，由約氏瘧原蟲Pys48蛋白的N端接gp64分泌性信號肽(SP)、C端接gp64跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)構(gòu)成,其氨基酸序列如 SEQ ID NO:9 所示。
[0019]本發(fā)明進(jìn)一步提供上述重組桿狀病毒BmPys48在瘧疾疫苗制備中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述重組桿狀病毒BmPys48表達(dá)的融合蛋白SP_Pys48_TM在瘧疾疫苗制備中的應(yīng)用。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點和有益效果:
[0022](I)本發(fā)明通過分析約氏瘧原蟲Pys48基因，發(fā)現(xiàn)其編碼455個氨基酸，其兩端為疏水區(qū)，中間段為親水區(qū)，為膜錨定蛋白，同時BLAST分析表明，其含有兩段P48-45超家族片段，且其與其他瘧疾的P48蛋白有很高的同源性，因此可以作為一種模型用于其他瘧疾的研究。本發(fā)明首次利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建成功了重組病毒BmPys48，并檢測出其在家蠶細(xì)胞中能很好的表達(dá)目的蛋白，用于疫苗的制備。通過本發(fā)明，可以為其他人瘧的P48瘧疾疫苗的研制提供很好的參考。
[0023](2)本發(fā)明將約氏瘧原蟲Pys48蛋白基因與家蠶桿狀病毒囊膜蛋白gp64基因融合，家蠶桿狀病毒囊膜蛋白gp64含有兩個高度疏水區(qū):N-末端的分泌性信號肽(SP)和C-末端的跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，與跨膜結(jié)構(gòu)域相連的是親水性結(jié)構(gòu)域，可以把病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜內(nèi)的糖蛋白連接在一起，從而使本發(fā)明實現(xiàn)了目的Pys48蛋白在病毒衣殼上的表面展示。
[0024](3)本發(fā)明構(gòu)建的表面展示約氏瘧原蟲Pys48蛋白的重組桿狀病毒，可以利用家蠶BmN細(xì)胞作為生物反應(yīng)器，通過家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)約氏瘧原蟲Pys48蛋白，其可以制備疫苗，為其他瘧疾的研究提供參考。家蠶生物反應(yīng)器作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低，產(chǎn)量高，所生產(chǎn)的疫苗應(yīng)用價值大。
[0025](4)目前Pys48疫苗尚無利用桿狀病毒表面展示技術(shù)生產(chǎn)，家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是真核表達(dá)，具有翻譯后修飾功能，能使表達(dá)的蛋白其結(jié)構(gòu)更接近于其天然構(gòu)象，通過簡單的分離純化病毒粒子，免疫Balb/c小鼠，獲得的抗體具有良好的抗體效價。
【附圖說明】
[0026]圖1所示的是載體pFastBacDual的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027]圖2所示的是重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFstBacDual-CMV-Ph-SP-Pys48_TM的構(gòu)建圖，其中CMV:哺乳動物啟動子；Ph:多角體啟動子；SP:gp64基因的信號肽序列；Pys48蛋白:約氏瘧原蟲動合子時期表面蛋白；TM:gp64基因的跨膜區(qū)序列；Kpn 1、EcoR 1、Xho 1、Hind III:酶切位點。
[0028]圖3所示的是重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM電泳鑒定圖，其中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 =CMV-Ph-SP-TM基因PCR擴增產(chǎn)物，箭頭位置為目的序列，923bp ；2:重組載體雙酶切產(chǎn)物。
[0029]圖4所示的是重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys48_TM的PCR鑒定電泳圖，其中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:Pys48目的基因PCR擴增產(chǎn)物；2:Pys48目的基因雙酶切產(chǎn)物。
[0030]圖5所示的是重組桿狀病毒基因組BmPys48的PCR產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果，其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:Pys48-F和Pys48_R為引物擴增的片段；2:Pys48_F和M13-R為引物擴增的片段；3:Pys48-R和M13-F為引物擴增的片段；4:M13_F和M13-R為引物擴增的片段。
[0031]圖6所示的是重組桿狀病毒BmPys48的Pys48蛋白Western Blot檢測結(jié)果(Pys48蛋白鼠抗檢測)，M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:陰性對照；2:細(xì)胞表達(dá)Pys48蛋白。
[0032]圖7所示的是間接ELISA測定抗體的效價結(jié)果，其中上面的線為含Pys48抗體的血清，下面的線為陰性對照，陰性對照為注射等量空病毒粒子取的血清。
[0033]序列表信息:
[0034]SEQ ID NO:1:CMV-Ph-SP-TM 序列；
[0035]SEQ ID NO:2:上游引物 CMV-F ；
[0036]SEQ ID NO:3:下游引物 TM-R ；
[0037]SEQ ID NO:4:Pys48 基因；
[0038]SEQ ID NO:5:上游引物 Pys48_F ；
[0039]SEQ ID NO:6:下游引物 Pys48-R ；
[0040]SEQ ID NO:7:上游引物 M13-F ；
[0041]SEQ ID NO:8:下游引物 M13-R ；
[0042]SEQ ID NO:9:重組桿狀病毒BmPys48表達(dá)的融合蛋白SP-Pys48_TM。
【具體實施方式】
[0043]以下具體說明都是例示性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明所使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0044]本發(fā)明通過PCR擴增獲得約氏瘧原蟲Pys48蛋白的編碼基因序列，得到Pys48基因，同時擴增CMV-Ph-SP-TM基因，將CMV-Ph-SP-TM基因和pFastBacDual載體通過KpnI和HindIII雙酶切后連在一起，構(gòu)建成重組載體pFastBacDual-CMV-Ph-SP-TM，將此重組載體和Pys48基因通過EcoR I, Xho I雙酶切，連接在一起，獲得重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒(命SSpFastBacDual-CMV-Ph-SP-Pys48-TM)，重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA (重組質(zhì)粒命名為Bacmid-Pys48),將其通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)裝配形成表面展示約氏痕原蟲Pys48蛋白的重組桿狀病毒(命名為BmPys48)，并復(fù)制擴增，用第三代BmPys48接種家蠶BmN細(xì)胞，經(jīng)3?5天后收集病毒液，離心、分離純化，制