專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)組織培養(yǎng)持續(xù)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域；具體涉及一種通過(guò)組織培養(yǎng)持續(xù)獲得植物次生代謝產(chǎn)物等有效成分的方法及實(shí)現(xiàn)這一方法的裝置。
背景技術(shù)：
次生代謝產(chǎn)物是由次生代謝產(chǎn)生的一類(lèi)細(xì)胞生命活動(dòng)或植物生長(zhǎng)發(fā)育正常運(yùn)行的非必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的特異性?？煞譃楸奖仡?lèi)、醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、單寧類(lèi)、萜類(lèi)、留體及其甙、生物堿七大類(lèi)。藥用植物中次生代謝產(chǎn)物是其發(fā)揮藥用作用的關(guān)鍵成分。植物次生代謝產(chǎn)物是植物對(duì)環(huán)境的一種適應(yīng)，是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中植物與生物和非生物因素相互作用的結(jié)果。在對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)、植物與植物之間的相互競(jìng)爭(zhēng)和協(xié)同進(jìn)化、植物對(duì)昆蟲(chóng)的危害、草食性動(dòng)物的采食及病原微生物的侵襲等過(guò)程的防御中起著重要作用。植物特別是藥用植物中含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，有的代謝產(chǎn)物對(duì)人體疾病具有顯著的療效，因此植物的次生代謝產(chǎn)物受到了非常高的重視。一般情況下，植物次生代謝產(chǎn)物是從種植或自然分布的植物體中提取得到，而對(duì)于某種次生代謝產(chǎn)物的大量需求往往會(huì)導(dǎo)致某種植物的利用采摘過(guò)度，如紫杉醇的利用導(dǎo)致紅豆杉的瀕危就是一個(gè)很好的例子。因此，人們開(kāi)始采用植物組織培養(yǎng)的方法來(lái)進(jìn)行特定植物的培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。但傳統(tǒng)植物組織培養(yǎng)的方法具有低通量和高人工消耗的缺點(diǎn)，反應(yīng)器的應(yīng)用是一個(gè)比較好的解決方案。傳統(tǒng)的反應(yīng)器培養(yǎng)只是針對(duì)植物細(xì)胞的培養(yǎng)，而植物次生代謝途徑是高度分支的途徑，這些途徑在植物體內(nèi)或細(xì)胞中并不全部開(kāi)放，而是定位于某一器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中并受到獨(dú)立的調(diào)控。它們是細(xì)胞生命活動(dòng)或植物生長(zhǎng)發(fā)育正常運(yùn)行的非必需的小分子化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的特異性，因此特定植物組織器官的培養(yǎng)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的獲得是必須的。植物次生代謝產(chǎn)物積累到一定的濃度后往往會(huì)抑制其進(jìn)一步的產(chǎn)生，因此及時(shí)的移去生長(zhǎng)環(huán)境中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，使其控制在一定的濃度范圍內(nèi)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的持續(xù)生成具有非常重要的作用。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中需要一種大批量持續(xù)獲得培養(yǎng)植物器官和組織的途徑，進(jìn)一步可以通過(guò)調(diào)控外在的環(huán)境等因子來(lái)使得植物產(chǎn)生并提高產(chǎn)量，并通過(guò)一定的方法控制次生代謝產(chǎn)物的濃度。本發(fā)明即提供了此種方法并公開(kāi)了實(shí)現(xiàn)上述方法的裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種通過(guò)植物組織培養(yǎng)方法大批量、持續(xù)的獲得次生代謝產(chǎn)物的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種實(shí)現(xiàn)上述通過(guò)組織培養(yǎng)方法獲得次生代謝產(chǎn)物的方法的裝置。 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):通過(guò)植物組織培養(yǎng)方法對(duì)植物進(jìn)行組織器官水平的培養(yǎng)獲得批量的植物材料，而后通過(guò)創(chuàng)造合適的培養(yǎng)條件、逆境脅迫環(huán)境或添加誘導(dǎo)因子使植物材料產(chǎn)生所需的大量次生代謝產(chǎn)物，而后通過(guò)對(duì)植物體及培養(yǎng)液來(lái)進(jìn)行提取從而獲得所需要的次生代謝產(chǎn)物。本發(fā)明的通過(guò)植物組織培養(yǎng)方法獲得次生代謝產(chǎn)物的方法更具體的包括下述步驟:
(1)植物體批量獲得，也即植物體批量擴(kuò)繁:將植物體處理后接種入本發(fā)明所述的裝置中進(jìn)行培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定后，進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)，根據(jù)需要進(jìn)行下一步的操作；
(2)植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生及誘導(dǎo):將獲得的植物體在一定的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生或進(jìn)行誘導(dǎo)以獲得需要的次生代謝產(chǎn)物；
(3)植物次生代謝產(chǎn)物的收集和提取:根據(jù)次生代謝產(chǎn)物存在的部位，以及次生代謝產(chǎn)物的特性進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的收集提取操作以獲得所需；
所述(I)中植物體的處理方法為一般植物組織培養(yǎng)方法中將滅菌后或無(wú)菌狀態(tài)的外植體接種至固體培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)反應(yīng)器裝置中。根據(jù)不同的植物及培養(yǎng)目的接種不同的外植體類(lèi)型。所述培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置是利用間歇浸沒(méi)原理設(shè)計(jì)的植物生物反應(yīng)器變型。所述植物生物反應(yīng)器裝置的培養(yǎng)因素主要有:
培養(yǎng)基:根據(jù)植物種類(lèi)的不同進(jìn)行不同培養(yǎng)基的確定及激素種類(lèi)及濃度的選擇，包含現(xiàn)有的培養(yǎng)基類(lèi)型及通過(guò)改良后的培養(yǎng)基類(lèi)型；
培養(yǎng)基PH:用于培養(yǎng)擴(kuò)繁的pH為植物適宜生長(zhǎng)的范圍為5.(Γ7.0，優(yōu)選5.5飛.5 ；浸沒(méi)頻率:根據(jù)植物種類(lèi)不同調(diào)整不同的浸沒(méi)頻率，lmin/24tT24h/24h，優(yōu)選3min/18h 30min/3h ；
接種密度:1個(gè)/LlOO個(gè)/L ，優(yōu)選10個(gè)/LlOO個(gè)/L?？梢岳每刹鹦兜亩鄬优囵B(yǎng)網(wǎng)架來(lái)進(jìn)行植物體的多層培養(yǎng)，來(lái)提高培養(yǎng)密度，并且可以提高空間利用效率。培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度100(T500001ux，優(yōu)選1500 2000 lux，光照時(shí)間5 20 h/d，優(yōu)選8 18 h/d，培養(yǎng)溫度25±1°C ；
培養(yǎng)時(shí)間:培養(yǎng)時(shí)間依據(jù)不同植物生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)確定，一般生長(zhǎng)時(shí)間為l(T90d,優(yōu)選2(T40d。以植物體長(zhǎng)滿培養(yǎng)容器為宜，期間營(yíng)養(yǎng)液的消耗可以通過(guò)裝置中方便拆卸組裝的儲(chǔ)液罐結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行更新或補(bǔ)充。所述規(guī)?；囵B(yǎng)是通過(guò)裝置可拆卸的多層培養(yǎng)支架來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述步驟(2)中一定的培養(yǎng)條件包括創(chuàng)造合適的培養(yǎng)條件、逆境脅迫環(huán)境或添加誘導(dǎo)因子。所述合適培養(yǎng)條件是針對(duì)不同的植物種類(lèi)設(shè)定不同的適合其生長(zhǎng)的因素，通過(guò)培養(yǎng)后即可獲得大量植物體特定部位的組織，從而從植物體中或從其分泌物中獲得所需次生代謝產(chǎn)物；
所述逆境脅迫環(huán)境指高溫、低溫、強(qiáng)光照、弱光照、機(jī)械刺激和輻射等環(huán)境因子等，通過(guò)逆境脅迫環(huán)境誘導(dǎo)使植物體內(nèi)產(chǎn)生新的次生代謝產(chǎn)物或提高原有次生代謝產(chǎn)物的含量，或誘導(dǎo)使次生代謝產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外或提高分泌效率；環(huán)境因子如合適的培養(yǎng)條件及逆境脅迫環(huán)境等的改變可以通過(guò)裝置外置的環(huán)境控制裝備來(lái)實(shí)現(xiàn)，如控溫裝置可以提高培養(yǎng)環(huán)境溫度、外置光照裝置可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境的光照強(qiáng)度等來(lái)誘導(dǎo)前述步驟(I)中大量的植物體產(chǎn)生所需的次生代謝產(chǎn)物；所述誘導(dǎo)因子指鹽分含量、化學(xué)物質(zhì)、植物激素、前體物質(zhì)等，通過(guò)誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)使植物體內(nèi)產(chǎn)生新的次生代謝產(chǎn)物或提高原有次生代謝產(chǎn)物的含量，或誘導(dǎo)使次生代謝產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外或提高分泌效率；誘導(dǎo)因子的改變可以通過(guò)裝置中方便拆卸組裝的儲(chǔ)液罐結(jié)構(gòu)，在更換培養(yǎng)液的同時(shí)將誘導(dǎo)因子如鹽、誘導(dǎo)前體物質(zhì)或具有毒害作用的化學(xué)物質(zhì)等添加到培養(yǎng)液中來(lái)實(shí)現(xiàn)，在添加后通過(guò)培養(yǎng)使前期得到的大量植物體在誘導(dǎo)因子的作用下產(chǎn)生所需的次生代謝產(chǎn)物。所述步驟(3)中次生代謝產(chǎn)物存在的部位包括:一是存在植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物；二是植物體分泌到細(xì)胞外的次生代謝產(chǎn)物；三是存在植物體內(nèi)同時(shí)亦可分泌到胞外的次生代謝產(chǎn)物；
所述次生代謝產(chǎn)物的收集根據(jù)其所存在的部位采取不同的操作:當(dāng)次生代謝產(chǎn)物存在植物體內(nèi)時(shí)，將誘導(dǎo)后的多層培養(yǎng)支架上的植物體根據(jù)需要收獲部分植物體收集用于后續(xù)的提取操作，剩余的部分可以繼續(xù)培養(yǎng)以持續(xù)的獲得所需的植物體；
當(dāng)次生代謝產(chǎn)物分泌到植物細(xì)胞外時(shí)，此時(shí)次生代謝產(chǎn)物被沖刷到培養(yǎng)液中，此時(shí)只需要將裝置下部?jī)?chǔ)液罐中的培養(yǎng)液收集來(lái)進(jìn)行提取操作；通過(guò)上部的植物體的持續(xù)培養(yǎng)同時(shí)控制培養(yǎng)的數(shù)量，從培養(yǎng)液中就可以持續(xù)的提取所需的次生代謝產(chǎn)物；
當(dāng)次生代謝產(chǎn)物同時(shí)存在于植物體內(nèi)及分泌到細(xì)胞外時(shí)，可結(jié)合上述兩種方法來(lái)進(jìn)行操作，既可從植物體內(nèi)提取又可從培養(yǎng)液中收集所需的次生代謝產(chǎn)物；
所述次生代謝產(chǎn)物的提 取所采用的具體方法根據(jù)次生代謝產(chǎn)物的形式采用不同的方法，如沉淀、萃取、層析過(guò)濾、吸附層析等。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供實(shí)現(xiàn)通過(guò)組織培養(yǎng)方法持續(xù)的獲得次生代謝產(chǎn)物的方法的培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置，該裝置包括空氣除菌器，第一連接管，反應(yīng)器罐體蓋子，反應(yīng)器培養(yǎng)罐體，第二連接管，儲(chǔ)液罐，儲(chǔ)液罐蓋子，多層培養(yǎng)網(wǎng)架，充氣泵，時(shí)控器，輔助裝置。所述空氣除菌器通過(guò)第一連接管安裝在反應(yīng)器罐體蓋子；多層培養(yǎng)網(wǎng)架放置入反應(yīng)器培養(yǎng)罐體內(nèi)進(jìn)行分層培養(yǎng)，所述多層培養(yǎng)網(wǎng)架，為可以拆卸組裝的分層培養(yǎng)網(wǎng)架；第二連接管與反應(yīng)器培養(yǎng)罐體相連，其長(zhǎng)度可接觸到儲(chǔ)液罐的底部，所述儲(chǔ)液罐上端還設(shè)有儲(chǔ)液罐蓋子；還包括有與反應(yīng)器培養(yǎng)罐體相連的充氣泵和時(shí)控器；
所述空氣除菌器用于過(guò)濾空氣，使培養(yǎng)反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)出的空氣處于無(wú)菌狀態(tài)；所述第一連接管，為可耐高溫高壓滅菌材料，用于連接反應(yīng)器罐體蓋子、反應(yīng)器培養(yǎng)罐體和空氣除菌器；所述反應(yīng)器罐體蓋子，具有螺紋或其他方式與反應(yīng)器罐體連接，且反應(yīng)器罐體的上部可通過(guò)第一連接管與空氣除菌器連接，實(shí)現(xiàn)罐體中氣壓的排放。反應(yīng)器罐體蓋子為可耐高溫高壓(121°C，30 min)滅菌材料，且材料為可透光材料，以利于培養(yǎng)時(shí)光的通過(guò)，從而使植物培養(yǎng)時(shí)光照的供給。所述反應(yīng)器培養(yǎng)罐體，為培養(yǎng)植物組織的部分，罐體中部設(shè)置擋板，擋板中間位置具有向下突出的小口，用于連接第二連接管，且該突出的小口與擋板連接位置具有過(guò)濾網(wǎng)，防止培養(yǎng)的外植體掉入；反應(yīng)器培養(yǎng)罐體的下部具有螺紋或者其他方式可與儲(chǔ)液罐密封連接；反應(yīng)器培養(yǎng)罐體的外部，擋板下部和連接上部的中間位置具有橫向突出的進(jìn)氣口，可通過(guò)第一連接管與空氣除菌器相連接，實(shí)現(xiàn)無(wú)菌空氣進(jìn)入反應(yīng)器的目的；反應(yīng)器培養(yǎng)罐體的材質(zhì)可耐高溫高壓(121 °C，30 min)滅菌材料，且材料為可透光材料，從而保證植物培養(yǎng)時(shí)光照的供給。所述第二連接管可連接到反應(yīng)器培養(yǎng)罐體，長(zhǎng)度為可接觸到儲(chǔ)液罐的底部位置，以便使培養(yǎng)液在氣壓的作用下，從第二連接管到達(dá)培養(yǎng)罐體進(jìn)行植物的浸沒(méi)，并在氣壓消失時(shí)使培養(yǎng)液可通過(guò)其回到儲(chǔ)液罐體中。所述分層培養(yǎng)網(wǎng)架為可以拆卸組裝的分層培養(yǎng)網(wǎng)架，根據(jù)培養(yǎng)植物品種的不同，可放置入反應(yīng)器培養(yǎng)罐體內(nèi)進(jìn)行分層培養(yǎng)，提高單位反應(yīng)器的培養(yǎng)效率，所述多層培養(yǎng)網(wǎng)架為可耐高溫高壓(121°C，30 min)滅菌材料，網(wǎng)孔大小0.5mnT3cm左右以支撐植物體材料并使培養(yǎng)液順利通過(guò)為準(zhǔn)，網(wǎng)架之間利用可組裝拆卸支柱支撐，可根據(jù)培養(yǎng)目的調(diào)整網(wǎng)架的層數(shù)，網(wǎng)架層數(shù)為2 10層，優(yōu)選3 8層；網(wǎng)架間距為0.25 25.0cm，優(yōu)選3.(TlOcm.所述儲(chǔ)液罐蓋子，具有與儲(chǔ)液罐相配合的螺紋或其他方式可與儲(chǔ)液罐密封結(jié)合，在反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程的換液步驟中用于單獨(dú)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行滅菌時(shí)應(yīng)用。所述儲(chǔ)液罐，用于儲(chǔ)存培養(yǎng)液，上部具有螺紋或其他方式可與反應(yīng)器培養(yǎng)罐體下部密封結(jié)合,儲(chǔ)液罐罐體材質(zhì)可耐高溫高壓(121°C )滅菌材料。上述部件為裝置的主體部分，裝置主體直徑為5飛Ocm，優(yōu)選l(T30cm。裝置主體高度l(T50cm，優(yōu)選2(T40cm。所述充氣泵，用于提供工作時(shí)的氣壓動(dòng)力，所述的空氣泵的氣壓壓力需配合儲(chǔ)液罐中液體的量，以使培養(yǎng)液在2min內(nèi)泵到培養(yǎng)室中為宜。所述時(shí)控器，通過(guò)控制電流的通斷來(lái)控制充氣泵的工作，通過(guò)控制電流的通斷頻率來(lái)實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器的浸沒(méi)頻率。所述輔助裝置包括:加熱裝置，用以提供培養(yǎng)液的溫度控制；光照裝置，以提供植物培養(yǎng)時(shí)的光照；co2輸入裝置，可結(jié)合氣泵通氣時(shí)調(diào)整通入反應(yīng)器的空氣組分，使植物生長(zhǎng)更加健壯；傳感探針，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液中的PH及各種成分的變化以指導(dǎo)具體的操作。除此之外，輔助裝置還可以提供不同的逆境脅迫來(lái)達(dá)到不同的培養(yǎng)目的。本發(fā)明的原理是:
一般的用于植物培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是利用發(fā)酵罐等通過(guò)進(jìn)行細(xì)胞水平的培養(yǎng)來(lái)獲得，但多數(shù)的次生代謝產(chǎn)物需要在組織器官水平才能夠生成。本發(fā)明上部采用的是可拆卸的分層培養(yǎng)進(jìn)行植物組織器官的培養(yǎng)，可以方便的分階段進(jìn)行培養(yǎng)物的采收來(lái)進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的提取操作，并且多層培養(yǎng)網(wǎng)架的設(shè)計(jì)可以同時(shí)培養(yǎng)足夠數(shù)量的植物體，從而提供足夠的提高植物體分泌到培養(yǎng)液中的有用物質(zhì)的濃度，便于次生代謝產(chǎn)物的富集及后續(xù)的提取濃縮收集。本發(fā)明下部采用分體式的設(shè)計(jì)，下部的儲(chǔ)液罐可以方便的拆卸，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，一些胞外分泌的次生代謝產(chǎn)物會(huì)分泌到培養(yǎng)液中，通過(guò)培養(yǎng)液的收集可以獲得所需的物質(zhì)，并且更換上新鮮培養(yǎng)基后經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后可以持續(xù)的獲得培養(yǎng)液中的次生代謝產(chǎn)物。并且由于培養(yǎng)液更換方便，可以在培養(yǎng)液中添加某種前體物質(zhì)以及脅迫因子等來(lái)通過(guò)代謝通路的調(diào)控進(jìn)行所需代謝產(chǎn)物的富集操作。加熱、輔助光照及輔助CO2等裝置可以提供植物體生長(zhǎng)的必要條件，可以提高植物體生長(zhǎng)的狀態(tài)，并且可以通過(guò)調(diào)整提供此生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的必要逆境環(huán)境。本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
(1)節(jié)省成本。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方式相比，采用本發(fā)明的裝置及方法進(jìn)行大規(guī)模植物組織培養(yǎng)可以節(jié)省大量的不能重復(fù)利用的物料(如瓊脂等)的消耗，并且培養(yǎng)容器體積的增加以及接種過(guò)程的簡(jiǎn)化和培養(yǎng)過(guò)程的自動(dòng)化程度的提高使人力的消耗也大大減少。因此具有降低植物組織培養(yǎng)成本的作用。(2)可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模快繁，提高單位產(chǎn)出量。本發(fā)明與傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)室可以很好的配合進(jìn)行大規(guī)模快繁。并且通過(guò)對(duì)組織培養(yǎng)微環(huán)境的調(diào)整可以大大提高擴(kuò)繁效率，并且可以使植物處于最佳的生長(zhǎng)發(fā)育代謝狀態(tài)，提高組培苗的質(zhì)量和品質(zhì)。并且本發(fā)明所述的裝置可根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模進(jìn)行放大。并且配備了分層培養(yǎng)網(wǎng)架，可根據(jù)需要對(duì)培養(yǎng)的植物組織進(jìn)行分層培養(yǎng)。這樣就提高了單位產(chǎn)出量。(3)方便高效的次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。通過(guò)提高培養(yǎng)的密度可以產(chǎn)出更多的含有代謝產(chǎn)物的植物體，另外通過(guò)對(duì)培養(yǎng)一段時(shí)間后的培養(yǎng)液的收集可以從中提取分泌到細(xì)胞外的次生代謝產(chǎn)物，且可以通過(guò)調(diào)整營(yíng)養(yǎng)液的構(gòu)成來(lái)調(diào)控所需物質(zhì)的生成。通過(guò)培養(yǎng)液的更換減少次生代謝產(chǎn)物濃度對(duì)其繼續(xù)產(chǎn)生的抑制，從而提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明:
圖1是通過(guò)組織培養(yǎng)持續(xù)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法的操作流程 圖2是培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置分解圖。
具體實(shí)施例方式為了行文的簡(jiǎn)便，以下涉及上下左右與附圖中的方位是一致的。實(shí)施例1
如圖1、2所示，一種通過(guò)植物組織培養(yǎng)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法所涉及的裝置各部分進(jìn)行裝置的組裝。反應(yīng)器罐體蓋子3，具有螺紋，與反應(yīng)器罐體4連接，儲(chǔ)液罐8上部具有螺紋與反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4的下部密封結(jié)合，儲(chǔ)液罐蓋子7具有與儲(chǔ)液罐8相配合的螺紋可與儲(chǔ)液罐8密封結(jié)合。裝置主體直徑為20cm，裝置主體高度30cm ;多層培養(yǎng)網(wǎng)架6為可耐高溫高壓(12rC,30min)滅菌材料，網(wǎng)孔大小0.5cm左右以支撐植物體材料并使培養(yǎng)液順利通過(guò)為準(zhǔn)。多層培養(yǎng)網(wǎng)架6的各層網(wǎng)架利用可組裝拆卸支柱支撐，可根據(jù)培養(yǎng)目的調(diào)整網(wǎng)架的層數(shù)，圖2中的網(wǎng)架層數(shù)為3層；網(wǎng)架間距為5cm。利用裝置實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體操作步驟如下:
(1)植物體批量獲得，也即植物體批量擴(kuò)繁:
在儲(chǔ)液罐8中注入一定量的培養(yǎng)液后，按照?qǐng)D2中所示的各個(gè)部件順次相連接后，將其在121°C下高溫高壓蒸汽滅菌20min。取出冷卻備用。將滅菌好的反應(yīng)器主體部分于無(wú)菌條件下，將反應(yīng)器培養(yǎng)罐體蓋子3打開(kāi)后，接種入需要規(guī)模擴(kuò)繁的外植體，后密封即完成接種；將時(shí)控器10根據(jù)需要設(shè)定不同的通斷頻率后連接充氣泵9，然后再與反應(yīng)器主體部分反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4連接即可。將連接好的培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置接通電源后置于普通組織培養(yǎng)室中進(jìn)行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程如圖1所示。當(dāng)充氣泵9處于工作狀態(tài)時(shí)，氣體由與反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4中部橫向突出的進(jìn)氣小嘴連接的空氣除菌器2進(jìn)行除菌處理，然后通過(guò)第一連接管I進(jìn)入儲(chǔ)液罐8 ;儲(chǔ)液罐8中的培養(yǎng)液在氣壓的作用下通過(guò)第二連接管5進(jìn)入反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4內(nèi)，使反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4中的的植物組織器官浸沒(méi)在培養(yǎng)液中。反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4中的氣體則通過(guò)反應(yīng)器培養(yǎng)罐體蓋子3中間出口位置連接的第一連接管2和空氣除菌器I被排出。當(dāng)充氣泵9停止工作時(shí)，反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4內(nèi)的培養(yǎng)液在自身重力的作用下，通過(guò)反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4中部擋板向下突出的小嘴和第二連接管5回流至儲(chǔ)液罐8中；由于反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4中部的擋板中心向下突出的小嘴位置設(shè)置了過(guò)濾網(wǎng)，因此，反應(yīng)器培養(yǎng)罐4內(nèi)的植物組織器官不會(huì)隨著培養(yǎng)液回流至儲(chǔ)液罐8中。此時(shí)，整個(gè)反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4內(nèi)形成負(fù)壓，外界的氣體經(jīng)過(guò)與反應(yīng)器培養(yǎng)罐體蓋子3向上突出的小嘴連接的空氣除菌器I的過(guò)濾除菌處理后沿著第一連接管2進(jìn)入反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4內(nèi)。這樣，反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4內(nèi)的植物組織器官就完成了一個(gè)被間歇浸沒(méi)的循環(huán)?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)時(shí)控器10來(lái)調(diào)節(jié)上述循環(huán)的時(shí)間。當(dāng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)液中成分會(huì)有一定的消耗，根據(jù)培養(yǎng)需要可對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行更換來(lái)保證植物的生長(zhǎng)。更換培養(yǎng)液的步驟為:首先將新鮮的培養(yǎng)液注入備用的儲(chǔ)液罐8中，利用儲(chǔ)液罐蓋子7密封后，121°C下高溫高壓滅菌20min，冷卻備用。然后將其與正在培養(yǎng)植物的反應(yīng)器主體部分紫外滅菌后，于無(wú)菌條件下將裝有新鮮培養(yǎng)液的儲(chǔ)液罐8替換裝有營(yíng)養(yǎng)耗盡的培養(yǎng)液的儲(chǔ)液罐8，如圖2所示，右邊的儲(chǔ)液罐8就是用于替換左邊的儲(chǔ)液罐8。完成更換培養(yǎng)液過(guò)程。具體的培養(yǎng)因素按照不同的植物進(jìn)行不同的設(shè)定。進(jìn)行規(guī)模化培養(yǎng)，根據(jù)需要進(jìn)行下一步的操作；
(2)植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生及誘導(dǎo):利用環(huán)境因子或誘導(dǎo)因子進(jìn)行植物體的誘導(dǎo)，從而進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)。環(huán)境因子如合適的培養(yǎng)條件及逆境脅迫環(huán)境等的改變可以通過(guò)裝置外置的環(huán)境控制裝備來(lái)實(shí)現(xiàn)，如控溫裝 置可以提高培養(yǎng)環(huán)境溫度、外置光照裝置可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境的光照強(qiáng)度等來(lái)誘導(dǎo)前述步驟(I)中大量的植物體產(chǎn)生所需的次生代謝產(chǎn)物；
誘導(dǎo)因子的改變可以通過(guò)裝置中方便拆卸組裝的儲(chǔ)液罐結(jié)構(gòu)，在更換培養(yǎng)液的同時(shí)將誘導(dǎo)因子如鹽、誘導(dǎo)前體物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)等添加到培養(yǎng)液中來(lái)實(shí)現(xiàn)，在添加后通過(guò)培養(yǎng)使前期得到的大量植物體在誘導(dǎo)因子的作用下產(chǎn)生所需的次生代謝產(chǎn)物。(3)植物次生代謝產(chǎn)物的收集和提取:根據(jù)次生代謝產(chǎn)物存在的部位，以及次生代謝產(chǎn)物的特性進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的收集提取操作以獲得所需；當(dāng)次生代謝產(chǎn)物存在植物體內(nèi)時(shí)，將誘導(dǎo)后的多層培養(yǎng)網(wǎng)架上的植物體根據(jù)需要收獲部分植物體收集用于后續(xù)的提取操作，剩余的部分可以繼續(xù)培養(yǎng)以持續(xù)的獲得所需的植物體；
當(dāng)次生代謝產(chǎn)物分泌到植物細(xì)胞外時(shí)，此時(shí)次生代謝產(chǎn)物被沖刷到培養(yǎng)液中，此時(shí)只需要將裝置下部?jī)?chǔ)液罐中的培養(yǎng)液收集來(lái)進(jìn)行提取操作；通過(guò)上部的植物體的持續(xù)培養(yǎng)同時(shí)控制培養(yǎng)的數(shù)量，從培養(yǎng)液中就可以持續(xù)的提取所需的次生代謝產(chǎn)物；
當(dāng)次生代謝產(chǎn)物同時(shí)存在于植物體內(nèi)及分泌到細(xì)胞外時(shí)，可結(jié)合上述兩種方法來(lái)進(jìn)行操作，既可從植物體內(nèi)提取又可從培養(yǎng)液中收集所需的次生代謝產(chǎn)物。實(shí)施例2
依據(jù)圖2所示一種通過(guò)植物組織培養(yǎng)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法所涉及的裝置各部分進(jìn)行裝置的組裝，反應(yīng)器罐體蓋子3，具有卡槽方式與反應(yīng)器罐體4連接，儲(chǔ)液罐8上部具有卡槽方式可與反應(yīng)器培養(yǎng)罐體4下部密封結(jié)合，儲(chǔ)液罐蓋子7具有卡槽方式可與儲(chǔ)液罐8密封結(jié)合；
裝置主體直徑為30 cm。裝置主體高度40cm ；
所述多層培養(yǎng)網(wǎng)架為可耐高溫高壓(121°C，30 min)滅菌材料，網(wǎng)孔大小Imm左右以支撐植物體材料并使培養(yǎng)液順利通過(guò)為準(zhǔn)，網(wǎng)架之間利用可組裝拆卸支柱支撐，網(wǎng)架層數(shù)為5層；網(wǎng)架間距為4cm ；
其余具體操作步驟與實(shí)施例1一致。實(shí)施例3
依據(jù)圖2所示一種通過(guò)植物組織培養(yǎng)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法所涉及的裝置各部分進(jìn)行裝置的組裝，同實(shí)施例1中所述，所不同的是網(wǎng)架層數(shù)為2層；網(wǎng)架間距為10cm。實(shí)施例4
依據(jù)圖2所示一種通過(guò)植物組織培養(yǎng)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法所涉及的裝置各部分進(jìn)行裝置的組裝，同實(shí)施例1中所述，所不同的是網(wǎng)架層數(shù)為10層；網(wǎng)架間距為2cm。實(shí)施例5
根據(jù)實(shí)施例1中所述的裝置，通過(guò)植物組織培養(yǎng)進(jìn)行半夏中麻黃堿的獲得的方法，具體操作步驟如下:
(I)半夏種苗的批量獲得:` 所述培養(yǎng)參數(shù)主要有:將半夏叢生芽接種入實(shí)施例1中所述的裝置中，接種密度:60個(gè)/L，分開(kāi)接種3層，每層20個(gè)，調(diào)整好培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。其中:培養(yǎng)基配方為:Ms+1.5 mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30 g/L蔗糖；培養(yǎng)基pH:5.8 ;浸沒(méi)頻率:5min/12h。培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度2000 lux，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)溫度25±1°C，培養(yǎng)時(shí)間:40d后植物體長(zhǎng)滿培養(yǎng)容器。(2)植物次生代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo):在培養(yǎng)液不必更換的條件下，將獲得的足量的植物體及裝置通過(guò)外加輔助設(shè)備控制環(huán)境溫度達(dá)到35 °C，處理時(shí)間15 d后待半夏倒苗后即可得到所要提取次生代謝產(chǎn)物的半夏塊莖。利用可拆卸的多層培養(yǎng)網(wǎng)架的特點(diǎn)，取出部分半夏塊莖進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的提取，剩余部分通過(guò)更換新鮮的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)以獲得更多的提取材料，所述繼續(xù)培養(yǎng)的參數(shù)同步驟(I)中所述。(3)植物次生代謝產(chǎn)物的收集和提取:將半夏塊莖取出后，通過(guò)研磨，超聲提取、真空干燥等步驟得到麻黃堿提取物，通過(guò)HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，得到所獲得的半夏塊莖中麻黃堿的含量可達(dá)到160.30ug/g。實(shí)施例6
根據(jù)實(shí)施例3中所述的裝置，通過(guò)植物組織培養(yǎng)進(jìn)行半夏中麻黃堿的獲得的方法，具體操作步驟同實(shí)施例5所述，最后得到的半夏塊莖中麻黃堿的含量達(dá)190.70 ug/g。實(shí)施例7
根據(jù)實(shí)施例4中所述的裝置，通過(guò)植物組織培養(yǎng)進(jìn)行半夏中麻黃堿的獲得的方法，具體操作步驟同實(shí)施例5所述，最后得到的半夏塊莖中麻黃堿的含量達(dá)120.50ug/g。實(shí)施例8
根據(jù)實(shí)施例1中所述的裝置，通過(guò)植物組織培養(yǎng)進(jìn)行半夏中麻黃堿的獲得的方法，具體操作步驟如下:
(I)半夏種苗的批量獲得:所述培養(yǎng)參數(shù)同實(shí)施例3中(I)中所述，所不同的是培養(yǎng)時(shí)間為30d。( 2)植物次生代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo):
通過(guò)裝置中可分體式的設(shè)計(jì)，方便的對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行更換，代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配方為:Ms+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2, 4-D+30 g/L蔗糖，更換后繼續(xù)對(duì)半夏進(jìn)行培養(yǎng)，所述繼續(xù)培養(yǎng)的參數(shù)同步驟(I)中所述。在培養(yǎng)一定時(shí)間后，更換新鮮的代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。所述繼續(xù)培養(yǎng)的參數(shù)同步驟(I)中所述。利用可拆卸的多層培養(yǎng)網(wǎng)架的特點(diǎn)，根據(jù)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況，取出部分半夏塊莖進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的提取，剩余部分在更換新鮮的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)以獲得更多的提取材料。(3)植物次生代謝產(chǎn)物的收集和提取:
將更換下來(lái)的培養(yǎng)液通過(guò)離心，沉淀直接進(jìn)行超聲提取真空干燥，上清液經(jīng)過(guò)濃縮后進(jìn)行提取后真空干燥，后合并提取得到的麻黃堿產(chǎn)物，通過(guò)HPLC檢測(cè)得到，在更換下來(lái)的培養(yǎng)液中麻黃堿的含量可以達(dá)到12.56ug/L。將取出的部分半夏愈傷半夏通過(guò)研磨，超聲提取、真空干燥等步驟得到麻黃堿提取物，通過(guò)HPLC方法進(jìn)行檢測(cè)，得到所獲得的半夏塊莖中麻黃堿的含量可達(dá)92.50 ug/g。實(shí)施例9
根據(jù)實(shí)施例2中所述的裝置，通過(guò)植物組織培養(yǎng)進(jìn)行紫草中紫草素的獲得的方法，具體操作步驟如下:
(I)紫草愈傷的批量獲得:
所述培養(yǎng)參數(shù)主要有:將紫草愈傷組織接種入實(shí)施例2中所述的裝置中，接種密度:120個(gè)/L，分開(kāi)接種6層，每層20個(gè)，調(diào)整好培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。其中:培養(yǎng)基配方為:B5+1.0 mg/L 6-BA+0.lmg/L NAA+30 g/L 蔗糖；培養(yǎng)基 pH:6.0 ;浸沒(méi)頻率:lmin/6h。培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度1000 lux，光照時(shí)間18 h/d，培養(yǎng)溫度25±1°C，培養(yǎng)時(shí)間:60d。(2)植物次生代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo):通過(guò)裝置中可分體式的設(shè)計(jì)，方便的對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行更換，代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配方為:B5+1.0 mg/L 6-BA+0.lmg/L NAA+30 g/L蔗糖，并同時(shí)在培養(yǎng)液中添加CuSO4.5Η20，使培養(yǎng)液中的CuSO4濃度為0.075mg/L。更換后繼續(xù)對(duì)紫草愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，所述繼續(xù)培養(yǎng)的參數(shù)同步驟(I)中所述，所不同的是培養(yǎng)時(shí)間為20 d。在培養(yǎng)20 d后，再次更換新鮮的代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。在更換新鮮培養(yǎng)液的同時(shí)進(jìn)行舊的培養(yǎng)液的收集來(lái)提取所需紫草素，如此往復(fù)。同時(shí)通過(guò)多層培養(yǎng)網(wǎng)架的結(jié)構(gòu)調(diào)整紫草愈傷的數(shù)量使其保持相當(dāng)?shù)幕盍Α?3)植物次生代謝產(chǎn)物的收集和提取:
將更換下來(lái)的培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)濃縮后進(jìn)行丙酮提取紫草素，利用分光光度計(jì)通過(guò)在520nm下檢測(cè)來(lái)計(jì)算紫草蘇的產(chǎn)量，得到在更換下來(lái)的培養(yǎng)液中紫草素的含量可以達(dá)到2.3mg/L。實(shí)施例10
根據(jù)實(shí)施例3中所述的裝置，通過(guò)植物組織培養(yǎng)進(jìn)行紫草中紫草素的獲得的方法，具體操作步驟同實(shí)施例9中所述，最終得到在更換下來(lái)的培養(yǎng)液中紫草素的含量可以達(dá)到
1.6mg/L。實(shí)施例11根據(jù)實(shí)施例4中所述的裝置，通過(guò)植物組織培養(yǎng)進(jìn)行紫草中紫草素的獲得的方法，具體操作步驟同實(shí)施例9中所述，最終得到在更換下來(lái)的培養(yǎng)液中紫草素的含量可以達(dá)到4.2mg/L。實(shí)施例12
根據(jù)實(shí)施例1中所述的裝置，通過(guò)組織培養(yǎng)進(jìn)行人參毛狀根中人參皂甙的獲得方法，具體操作步驟如下:
(I)人參毛狀根的批量獲得:
所述培養(yǎng)參數(shù)主要有:將人參毛狀根接種入實(shí)施例1中所述的裝置中，接種密度:120個(gè)/L，分開(kāi)接種3層，每層40個(gè)，調(diào)整好培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。其中:培養(yǎng)基配方為:Ms+0.1mg/L IBA +30 g/L蔗糖；培養(yǎng)基pH:5.8 ;浸沒(méi)頻率:3min/4h。培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度2000lux，光照時(shí)間8 h/d，培養(yǎng)溫度25±1°C，培養(yǎng)時(shí)間:10do(2)植物次生代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo):利用可拆卸的設(shè)計(jì)方便更換培養(yǎng)液為:Ms+30 g/L蔗糖;培養(yǎng)基pH:5.8 ;浸沒(méi)頻率:10min/2h。培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度1000 lux，光照時(shí)間5 h/d，培養(yǎng)溫度25±1°C，培養(yǎng)時(shí)間:90d。(3)植物次生代謝產(chǎn)物的收集和提取:將人參毛狀根取出后按照中國(guó)人民藥典2010年版測(cè)定人參總皂甙以及人參皂甙Re+Rg的含量，經(jīng)檢測(cè)所獲得的人參毛狀根中人參總皂甙含量可達(dá)到6.182%，人參皂甙Re+Rg的含量可達(dá)到0.3752%。實(shí)施例13
根據(jù)實(shí)施例2中所述的裝置，通過(guò)組織培養(yǎng)進(jìn)行人參毛狀根中人參皂甙的獲得方法。具體操作步驟同實(shí) 施例12中所述，最終得到人參毛狀根中人參總皂甙含量可達(dá)到
4.8912%,人參皂甙Re+Rg的含量可達(dá)到0.2527%。實(shí)施例14
根據(jù)實(shí)施例3中所述的裝置，通過(guò)組織培養(yǎng)進(jìn)行人參毛狀根中人參皂甙的獲得方法，具體操作步驟同實(shí)施例12中所述，最終得到人參毛狀根中人參總皂甙含量可達(dá)到6.532%，人參皂甙Re+Rg的含量可達(dá)到0.3852%。實(shí)施例15
根據(jù)實(shí)施例4中所述的裝置，通過(guò)組織培養(yǎng)進(jìn)行人參毛狀根中人參皂甙的獲得方法，具體操作步驟同實(shí)施例12中所述，最終得到人參毛狀根中人參總皂甙含量可達(dá)到
4.6752%，人參皂甙Re+Rg的含量可達(dá)到0.2319%。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)組織培養(yǎng)持續(xù)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法，包括以下步驟: (1)植物體批量獲得:將植物體處理后接種入培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置中，進(jìn)行培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定后，進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)，根據(jù)需要進(jìn)行下一步的操作，所述植物體是指無(wú)菌培養(yǎng)下獲得的植物細(xì)胞、植物組織、植物器官和叢生芽等狀態(tài)； (2)植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生及誘導(dǎo):將獲得的植物體在一定的培養(yǎng)條件下生成或進(jìn)行誘導(dǎo)以獲得需要的次生代謝產(chǎn)物； (3)植物次生代謝產(chǎn)物的收集和提取:根據(jù)次生代謝產(chǎn)物存在的部位，以及次生代謝產(chǎn)物的特性進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的收集提取操作以獲得所需。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過(guò)組織培養(yǎng)持續(xù)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述步驟(I)中植物體處理的方法為:將滅菌后或無(wú)菌狀態(tài)的外植體接種至固體培養(yǎng)瓶或植物生物反應(yīng)器培養(yǎng)裝置中，根據(jù)不同的植物及培養(yǎng)目的接種不同的外植體類(lèi)型，所述培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置是利用間歇浸沒(méi)原理設(shè)計(jì)的植物生物反應(yīng)器變型； 所述植物生物反應(yīng)器裝置的培養(yǎng)因素主要有: 培養(yǎng)基:根據(jù)植物種類(lèi)的不同進(jìn)行不同培養(yǎng)基的確定及激素種類(lèi)及濃度的選擇，包含現(xiàn)有的培養(yǎng)基類(lèi)型及通過(guò)改良后的培養(yǎng)基類(lèi)型； 培養(yǎng)基PH:用于培養(yǎng)擴(kuò)繁的pH為植物適宜生長(zhǎng)的范圍為5.(Γ7.0 ； 浸沒(méi)頻率:根據(jù)植物種類(lèi)不同調(diào)整不同的浸沒(méi)頻率，lmin/24tT24h/24h ； 接種密度:3飛OO個(gè)/L ;或f200個(gè)/層，可以利用可拆卸的多層培養(yǎng)網(wǎng)架來(lái)進(jìn)行植物體的多層培養(yǎng)，來(lái)提高培養(yǎng)密度和空間利用效率； 培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度100(T500001ux，光照時(shí)間5 20 h/d，培養(yǎng)溫度25±1°C ; 培養(yǎng)時(shí)間:培養(yǎng)時(shí)間依據(jù)不同植物生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)確定，生長(zhǎng)時(shí)間為l(T90d。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過(guò)組織培養(yǎng)持續(xù)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基pH 5.5 6.5 ;所述浸沒(méi)頻率3min/18tr30min/3h ;所述光照強(qiáng)度150(T20001ux ;所述光照時(shí)間8 18 h/d，所述接種密度60 150個(gè)/L或20 50個(gè)/層，所述生長(zhǎng)時(shí)間為2(T40d。
4.根據(jù)權(quán)利要求f3任一項(xiàng)所述的通過(guò)組織培養(yǎng)持續(xù)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述規(guī)?；囵B(yǎng)是通過(guò)培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置中的可拆卸的多層培養(yǎng)網(wǎng)架來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述多層培養(yǎng)網(wǎng)架是用耐高溫、耐腐蝕材料制作的拆卸網(wǎng)架，多層培養(yǎng)網(wǎng)架可以分別接種或同批次接種植物體。
5.根據(jù)權(quán)利要求f3任一項(xiàng)所述的通過(guò)組織培養(yǎng)持續(xù)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述一定的培養(yǎng)條件包括創(chuàng)造合適的培養(yǎng)條件、逆境脅迫環(huán)境或添加誘導(dǎo)因子; 所述合適培養(yǎng)條件是針對(duì)不同的植物種類(lèi)設(shè)定不同的適合其生長(zhǎng)的因素，通過(guò)培養(yǎng)后即可獲得大量植物體特定部位的組織，從而從植物體中或從其分泌物中獲得所需次生代謝產(chǎn)物； 所述逆境脅迫環(huán)境指高溫、低溫、強(qiáng)光照、弱光照、機(jī)械刺激和輻射等環(huán)境因子等，通過(guò)逆境脅迫環(huán)境誘導(dǎo)使植物體內(nèi)產(chǎn)生新的次生代謝產(chǎn)物或提高原有次生代謝產(chǎn)物的含量，或誘導(dǎo)使次生代謝產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外或提高分泌效率；環(huán)境因子如合適的培養(yǎng)條件及逆境脅迫環(huán)境等的改變可以通過(guò)裝置外置的環(huán)境控制裝備來(lái)實(shí)現(xiàn)，如控溫裝置可以提高培養(yǎng)環(huán)境溫度、外置光照裝置可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境的光照強(qiáng)度等來(lái)誘導(dǎo)前述步驟(I)中大量的植物體產(chǎn)生所需的次生代謝產(chǎn)物； 所述誘導(dǎo)因子指鹽分含量、化學(xué)物質(zhì)、植物激素、前體物質(zhì)等，通過(guò)誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)使植物體內(nèi)產(chǎn)生新的次生代謝產(chǎn)物或提高原有次生代謝產(chǎn)物的含量，或誘導(dǎo)使次生代謝產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外或提高分泌效率；誘導(dǎo)因子的改變可以通過(guò)裝置中方便拆卸組裝的儲(chǔ)液罐結(jié)構(gòu)，在更換培養(yǎng)液的同時(shí)將誘導(dǎo)因子如鹽、誘導(dǎo)前體物質(zhì)或具有毒害作用的化學(xué)物質(zhì)等添加到培養(yǎng)液中來(lái)實(shí)現(xiàn)，在添加后通過(guò)培養(yǎng)使前期得到的大量植物體在誘導(dǎo)因子的作用下產(chǎn)生所需的次生代謝產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求f3任一項(xiàng)所述的通過(guò)組織培養(yǎng)持續(xù)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于，所述步驟(3)中次生代謝產(chǎn)物存在的部位包括:一是存在植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物；二是植物體分泌到細(xì)胞外的次生代謝產(chǎn)物；三是存在植物體內(nèi)同時(shí)亦可分泌到胞外的次生代謝產(chǎn)物； 所述次生代謝產(chǎn)物的收集根據(jù)其所存在的部位采取不同的操作:當(dāng)次生代謝產(chǎn)物存在植物體內(nèi)時(shí),將誘導(dǎo)后的多層培養(yǎng)網(wǎng)架上的植物體根據(jù)需要收獲部分植物體收集用于后續(xù)的提取操作，剩余的部分可以繼續(xù)培養(yǎng)以持續(xù)的獲得所需的植物體； 當(dāng)次生代謝產(chǎn)物分泌到植物細(xì)胞外時(shí)，此時(shí)次生代謝產(chǎn)物被沖刷到培養(yǎng)液中，此時(shí)只需要將裝置下部?jī)?chǔ)液罐中的培養(yǎng)液收集來(lái)進(jìn)行提取操作；通過(guò)上部的植物體的持續(xù)培養(yǎng)同時(shí)控制培養(yǎng)的數(shù)量，從培養(yǎng)液中就可以持續(xù)的提取所需的次生代謝產(chǎn)物； 當(dāng)次生代謝產(chǎn)物同時(shí)存在于植物體內(nèi)及分泌到細(xì)胞外時(shí)，可結(jié)合上述兩種方法來(lái)進(jìn)行操作，既可從植物體內(nèi)提取又可從培養(yǎng)液中收集所需的次生代謝產(chǎn)物。
7.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求f 6的任一項(xiàng)所述的通過(guò)組織培養(yǎng)方法持續(xù)的獲得次生代謝產(chǎn)物的方法的培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置，其特征在于，包括空氣除菌器(1)，所述空氣除菌器(I)通過(guò)第一連接管(2)安裝在反應(yīng)器罐體蓋子(3);還包括有反應(yīng)器培養(yǎng)罐體(4)，多層培養(yǎng)網(wǎng)架(6)放置入反應(yīng)器培養(yǎng)罐體(4)內(nèi)進(jìn)行分層培養(yǎng)，所述多層培養(yǎng)網(wǎng)架(6)，為可以拆卸組裝的分層培養(yǎng)網(wǎng)架；第二連接管(5)與反應(yīng)器培養(yǎng)罐體(4)相連，其長(zhǎng)度可接觸到儲(chǔ)液罐(8)的底部，所述儲(chǔ)液罐(8)上端還設(shè)有儲(chǔ)液罐蓋子(7);還包括有與反應(yīng)器培養(yǎng)罐體(4)相連的充氣泵(9)和時(shí)控器(10)； 所述多層培養(yǎng)網(wǎng)架(6)各網(wǎng)架之間利用可組裝拆卸支柱支撐，可根據(jù)培養(yǎng)目的調(diào)整網(wǎng)架的層數(shù)，網(wǎng)架層數(shù)為2 10層；網(wǎng)架間距為0.25^25.0cm ； 所述儲(chǔ)液罐(8)的上部具有螺紋或其他方式可與反應(yīng)器培養(yǎng)罐體(4)下部密封結(jié)合； 該裝置主體直徑為5 50cm ;裝置主體高度l(T50cm。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置，其特征在于，網(wǎng)架層數(shù)為3飛層；網(wǎng)架間距為，3.(TlOcm ;裝置主體直徑為l(T30cm ;裝置主體高度2(T40cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置，其特征在于，該裝置還設(shè)有輔助裝置。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)組織培養(yǎng)持續(xù)獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法，該方法的步驟包括(1)植物體批量獲得；(2)植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生及誘導(dǎo)和(3)植物次生代謝產(chǎn)物的收集和提取。本發(fā)明還涉及一種培養(yǎng)用反應(yīng)器裝置，該裝置上部采用植物組織器官的分層培養(yǎng)設(shè)計(jì)，可以方便地通過(guò)多層培養(yǎng)網(wǎng)架的設(shè)計(jì)分階段進(jìn)行培養(yǎng)物的采收操作；裝置下部采用分體式設(shè)計(jì)，其儲(chǔ)液罐可以方便拆卸，通過(guò)收集培養(yǎng)液以獲得所需產(chǎn)物，并且可通過(guò)培養(yǎng)液的更換減少次生代謝產(chǎn)物濃度對(duì)其繼續(xù)產(chǎn)生的抑制，從而保證持續(xù)獲得次生代謝產(chǎn)物。本發(fā)明具有通量大、操作方便、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103120124SQ20131004311
公開(kāi)日2013年5月29日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者陳集雙, 賈明良, 張本厚, 歐陽(yáng)平凱, 金磊磊 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)