專利名稱：一種花生短周期組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種花生短周期組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
花生是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物。我國(guó)花生產(chǎn)量居世界第一，種植面積居世界第二，在世界花生生產(chǎn)上具有舉足輕重的地位。傳統(tǒng)育種可以有效的提高花生在產(chǎn)量、抗旱等方面的特性，但基因工程育種比傳統(tǒng)育種方法更能有效地對(duì)一些有益目的性狀進(jìn)行保留、篩選?；ㄉ倪z傳基礎(chǔ)較弱，可用的有效資源有限，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行花生遺傳轉(zhuǎn)化，關(guān)鍵在于建立一個(gè)高效的受體系統(tǒng)，即需要建立一個(gè)高效的花生植株組織培養(yǎng)方法?；ㄉ鳛橐环N大粒豆科植物，國(guó)內(nèi)外已有成功實(shí)現(xiàn)花生離體再生的報(bào)道:McKently等以帶胚子葉以及去胚子葉為外植體誘導(dǎo)叢生芽，發(fā)現(xiàn)帶胚子葉為最適外植體，經(jīng)過(guò)258d長(zhǎng)成完整植株，但上述研究中外植體取材過(guò)程復(fù)雜且對(duì)種子需求量較大；Charleen和Venkatachala分別以胚小葉為外植體,通過(guò)體細(xì)胞胚再生途徑成功誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，但是存在分化成株困難的問(wèn)題;Mroginski等以3_5d苗齡的不成熟小葉為外植體誘導(dǎo)叢生芽并獲得完整植株；Tiwari等以未成熟胚小葉為外植體研究預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基及基因型對(duì)胚小葉再生的影響，整個(gè)過(guò)程再生率可達(dá)80%，耗時(shí)4個(gè)月，但上述以胚小葉為外植體的再生體系依然存在著成株困難以及重復(fù)性低的問(wèn)題，同時(shí)再生頻率低以及周期長(zhǎng)的問(wèn)題還有待解決，同時(shí)研究表明植株離體再生對(duì)基因型有很強(qiáng)的依賴性。因此建立一種周期短、再生率高、重復(fù)性好的花生植株再生體系具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)花生組織培養(yǎng)周期長(zhǎng)、再生率低、重復(fù)性差的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于提供一種花生短周期組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟:I)花生種子表面消毒和浸種；2)取步驟I)所述花生種子的胚小葉，接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚小葉產(chǎn)生叢生芽或叢生芽組織塊；所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB5+0.2mg/L NAA+5 6mg/L6_BA，pH=5.8的固體培養(yǎng)基(S卩以MSB5為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加NAA的終濃度為0.2mg/L,添加6-BA的終濃度為6mg/L，pH值為5.8的固體培養(yǎng)基，以下培養(yǎng)基成分以此類推)；3)切取步驟2)所述叢生芽或叢生芽組織塊，接種到一號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每三周繼代一次；每次繼代切取新分化的叢生芽或叢生芽組織塊轉(zhuǎn)至步驟2)所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并切取開(kāi)始伸長(zhǎng)的叢生芽或叢生芽組織塊轉(zhuǎn)至二號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)至得到2 3cm長(zhǎng)的幼苗；

所述一號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MSB5+0.2mg/L NAA+3mg/L6_BA的固體培養(yǎng)基，pH=5.8 ;所述二號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為 MSB5+0.2mg/LNAA+4mg/L6-BA+2mg/L GA3, pH=5.8 的固體培養(yǎng)基；
4)切取步驟3)所述2 3cm長(zhǎng)的幼苗，接種到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出至少4條根且主根長(zhǎng)度大于2cm，得到完整的植株；所述生根培養(yǎng)基為MSB5+lmg/L NAA, pH=5.8的固體培養(yǎng)基；5)將步驟4)所述完整的植株煉苗后移栽到蛭石上。其中，步驟I)所述表面消毒是指:將花生成熟莢果去果皮，選取顆粒飽滿、表面光滑的種子，用水沖洗后吸干表面水分，先后浸于體積百分比75%的乙醇溶液中l(wèi)min、質(zhì)量百分比0.1%的HgCl2溶液中l(wèi)Omin，再用無(wú)菌水漂洗4 5次。

其中，步驟I)所述浸種為將經(jīng)表面消毒的花生種子剝?nèi)シN皮，浸泡于無(wú)菌水中7h0其中，步驟4 )所述生根培養(yǎng)的時(shí)間為2周。其中，步驟5)所述煉苗為打開(kāi)培養(yǎng)瓶的封口膜，向瓶中加入沒(méi)過(guò)培養(yǎng)基的無(wú)菌水，開(kāi)蓋煉苗3d。其中，所述培養(yǎng)的環(huán)境條件為光照強(qiáng)度1500 20001x，光照時(shí)間16h/d，溫度26±0.50C ο本發(fā)明還提供應(yīng)用于花生短周期組織培養(yǎng)方法的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為MSB5+0.2mg/L NAA+5 6mg/L6_BA，ρΗ=5.8 的固體培養(yǎng)基。其中，所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選MSB5+0.2mg/L NAA+6mg/L6_BA，pH=5.8的固體
培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供應(yīng)用于花生短周期組織培養(yǎng)方法的一號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，為MSB5+0.2mg/L NAA+3mg/L6-BA, ρΗ=5.8 的固體培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供應(yīng)用于花生短周期組織培養(yǎng)方法的二號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，為MSB5+0.2mg/L NAA+4mg/L6-BA+2mg/L GA3, ρΗ=5.8 的固體培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供應(yīng)用于花生短周期組織培養(yǎng)方法的生根培養(yǎng)基，為MSB5+lmg/LNAA, pH=5.8的固體培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供所述花生短周期組織培養(yǎng)方法在花生繁育中的應(yīng)用。其中，所述花生的品種為麻油1-1、弗落蔓生、濮花23號(hào)或?；↖號(hào)。本發(fā)明的有益效果在于:1、通過(guò)本發(fā)明的方法對(duì)花生進(jìn)行組織培養(yǎng)，再生率高，其中再生率大于80%的品種有:麻油1-1、弗落蔓生、濮花23號(hào)、?；↖號(hào)，最高可達(dá)93.01%±0.01。2、通過(guò)本發(fā)明的方法對(duì)花生進(jìn)行組織培養(yǎng)，可在15周內(nèi)得到生根的組培苗，大大縮短了組培所需周期，從而加快了花生組培苗的繁育速度。3、本發(fā)明的花生組織培養(yǎng)方法重復(fù)性好。


圖1為實(shí)施例1中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)15天后的胚小葉照片；圖2為實(shí)施例1中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)15天后的胚小葉周邊長(zhǎng)出的叢生芽照片；圖3為實(shí)施例2中邊上有新分化的叢生芽的幼苗照片；圖4為實(shí)施例2中2_3cm長(zhǎng)的幼苗照片；圖5為實(shí)施例3中長(zhǎng)有根的完整植株照片；
圖6為實(shí)施例3中移栽到蛭石中的植株照片。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例中所用化學(xué)試劑均為化學(xué)純，其中所用6-BA購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司，所用NAA和GA3均購(gòu)自sigma，所用瓊脂、肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇和鹽酸硫胺素均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，其余所用藥品均購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠。所用的14個(gè)花生品種為:麻油1-1、弗落蔓生、獅頭企、RHP12、邢花I號(hào)、濮花23號(hào)、?；↖號(hào)、佛州巨人、蘭娜(大)、白沙1016、LH花生、冀花5號(hào)、花育19、花育25，以上品種均為地方品種，在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)種質(zhì)資源庫(kù)中均有保存。實(shí)施例1叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選本實(shí)施例以品種麻油1-1為材料。本實(shí)施例所用基本培養(yǎng)基為MSB5培養(yǎng)基，是包括MS培養(yǎng)基中大量、微量和鐵鹽成分以及B5培養(yǎng)基中的有機(jī)成分的培養(yǎng)基,其母液配置如表1-表5所不:表IMS大量母液(20倍)配置
權(quán)利要求
1.一種花生短周期組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟: 1)花生種子表面消毒和浸種； 2)取步驟I)所述花生種子的胚小葉，接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚小葉產(chǎn)生叢生芽或叢生芽組織塊； 所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MSB5+0.2mg/L NAA+5 6mg/L6_BA，pH=5.8的固體培養(yǎng)基； 3)切取步驟2)所述叢生芽或叢生芽組織塊，接種到一號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每三周繼代一次；每次繼代切取新分化的叢生芽或叢生芽組織塊轉(zhuǎn)至步驟2)所述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并切取開(kāi)始伸長(zhǎng)的叢生芽或叢生芽組織塊轉(zhuǎn)至二號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)至得到2 3cm長(zhǎng)的幼苗； 所述一號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MSB5+0.2mg/L NAA+3mg/L6-BA的固體培養(yǎng)基，pH=5.8 ;所述二號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為 MSB5+0.2mg/LNAA+4mg/L6-BA+2mg/L GA3, pH=5.8 的固體培養(yǎng)基； 4)切取步驟3)所述2 3cm長(zhǎng)的幼苗，接種到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出至少4條根且主根長(zhǎng)度大于2cm，得到完整的植株； 所述生根培養(yǎng)基為MSB5+lmg/L NAA, pH=5.8的固體培養(yǎng)基； 5)將步驟4)所述完整的植株煉苗后移栽到蛭石上。
2.如權(quán)利要求1所述的花生短周期組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟I)所述表面消毒是指:將花生成熟莢果去果皮，選取顆粒飽滿、表面光滑的種子，用水沖洗后吸干表面水分，先后浸于體積百分比75%的乙醇溶液中l(wèi)min、質(zhì)量百分比0.1%的HgCl2溶液中l(wèi)Omin，再用無(wú)菌水漂洗4 5次。
3.如權(quán)利要求1所述的花生短周期組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟I)所述浸種為將經(jīng)表面消毒的花生種子剝?nèi)シN皮，浸泡于無(wú)菌水中7h。
4.如權(quán)利要求1所述的花生短周期組織培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟5)所述煉苗為打開(kāi)培養(yǎng)瓶的封口膜，向瓶中加入沒(méi)過(guò)培養(yǎng)基的無(wú)菌水，開(kāi)蓋煉苗3d。
5.應(yīng)用于權(quán)利要求1所述花生短周期組織培養(yǎng)方法的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為MSB5+0.2mg/L NAA+5 6mg/L6_BA，ρΗ=5.8 的固體培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5所述的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為MSB5+0.2mg/LNAA+6mg/L6-BA, pH=5.8的固體培養(yǎng)基。
7.應(yīng)用于權(quán)利要求1所述花生短周期組織培養(yǎng)方法的一號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，為MSB5+0.2mg/L NAA+3mg/L6-BA, ρΗ=5.8 的固體培養(yǎng)基。
8.應(yīng)用于權(quán)利要求1所述花生短周期組織培養(yǎng)方法的二號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，為MSB5+0.2mg/L NAA+4mg/L6-BA+2mg/L GA3, ρΗ=5.8 的固體培養(yǎng)基。
9.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述花生短周期組織培養(yǎng)方法在花生繁育中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述花生的品種為麻油1-1、弗落蔓生、濮花23號(hào)或?；↖號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種花生短周期組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟1)花生種子表面消毒和浸種；2)取花生種子的胚小葉，接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)；3)切取叢生芽或叢生芽組織塊，接種到一號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)和二號(hào)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)至得到2～3cm長(zhǎng)的幼苗；4)切取2～3cm長(zhǎng)的幼苗，接種到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出健壯的根得到完整的植株；5)將完整的植株煉苗后移栽到蛭石上。通過(guò)本發(fā)明的方法對(duì)花生進(jìn)行組織培養(yǎng)，可在15周內(nèi)得到生根的花生組培苗，大大縮短了組培所需周期，從而加快了花生組培苗的繁育速度，且本發(fā)明的方法培育花生組配苗的再生率高，重復(fù)性好。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103168689SQ20131010006
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月26日
發(fā)明者劉立峰, 馬彩霞, 穆國(guó)俊, 侯名語(yǔ), 陳煥英, 何美敬 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)