一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法
【專利摘要】一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。其將卵母細胞經(jīng)采卵液和TCM199混合液分別清洗后，以1.5～3.5ml/100枚的比例將卵母細胞放入TCM199混合液中，在溫度30～37℃、飽和濕度下保存6～8小時，上述的TCM199混合液中含有M19911.01g/L、HEPES4～5g/L、NaHCO30.3～0.4g/L，PH為7.2～7.3。上述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，不僅可以在體外延時保存卵母細胞6～8小時，并且可以通過此方法來調(diào)控卵母細胞成熟發(fā)育的初始時間，而且不會影響卵母細胞的成熟率，卵裂率和囊胚率。
【專利說明】—種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，由于胚胎工程技術(shù)研究的迅速發(fā)展，科學家們致力于研究屠宰家畜卵巢獲得卵母細胞的體外成熟和體外受精技術(shù)，以探索胚胎移植所需要的大量早期胚胎來源的途徑。然而現(xiàn)在卵母細胞源的獲取仍然存在困擾，如由于大多定點屠宰場都在深夜進行屠宰，按正常操作及成熟培養(yǎng)所需時間推算，這將導致卵母細胞的體外成熟和體外受精，以及相關(guān)實驗研究的后續(xù)操作都將在深夜進行，這無疑增加了實驗操作人員的勞動強度，不利于正常試驗研究的開展。因此，有必要在獲取卵母細胞源后，通過體外卵母細胞的延時保存手法等來調(diào)控卵母細胞發(fā)育的初始時間，以此實現(xiàn)滿足后續(xù)實驗的工作時間的可控性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設計提供一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法的技術(shù)方案，通過該方法不僅可以調(diào)控卵母細胞發(fā)育的初始時間，而且不會影響卵母細胞的成熟率、卵裂率和囊胚率。
[0004]所述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，其特征在于將卵母細胞經(jīng)采卵液和TCM199混合液分別清洗后，以1.5~3.5ml/100枚的比例將卵母細胞放入TCM199混合液中，在溫度30~37°C、飽和濕度下保存6~8小時，上述的TCM199混合液中含有 M199 11.01g/L、HEPES4 ~5g/L、NaHC03 0.3 ~0.4 g/L，PH 為 7.2 ~7.3。
[0005]所述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，其特征在于將卵母細胞按2~3ml/100枚的比例放入 [0006]所述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，其特征在于TCM199混合液中含有 M199 11.0lg /L, HEPES4.2 ~4.8g/L、NaHCO3 0.32 ~0.38g/L。
[0007]所述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，其特征在于將清洗后的卵母細胞放入裝有TCM199混合液的第一滅菌燒杯中，再將第一滅菌燒杯外壁包裹無菌紗布，接著將包有無菌紗布的第一滅菌燒杯放入盛有超純水的第二滅菌燒杯中，然后將第二滅菌燒杯的燒杯口用保鮮膜封住，最后將第二滅菌燒杯置于溫度30~37°C、飽和濕度下保存6~8小時。
[0008]所述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，其特征在于超純水的高度低于第一滅菌燒杯的燒杯口。
[0009]本發(fā)明采用的試劑均為現(xiàn)有試劑，其中PMSG和HCG購自寧波激素制品廠，TCM199粉劑購自日水制藥株式會社，其它試劑均購自Sigma公司。
[0010]上述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，不僅可以在體外延時保存卵母細胞6~8小時，并且可以通過此方法來調(diào)控卵母細胞成熟發(fā)育的初始時間，而且不會影響卵母細胞的成熟率，卵裂率和囊胚率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為體外延時保存卵母細胞的示意模式圖；
圖2為延時保存卵母細胞后體外成熟培養(yǎng)42~44h時的示意圖(100X)；
圖3為延時保存卵母細胞體外受精6~8h后去除卵丘細胞的示意圖；
圖4為延時保存卵母細胞體外受精后的早期胚胎發(fā)育示意圖。
[0012]圖中:1_第一滅菌燒杯；2_無菌紗布；3_第二滅菌燒杯；4_保鮮膜。
【具體實施方式】
[0013]以下結(jié)合具體實施例來進一步說明本發(fā)明。
[0014]實施例:卵母細胞延時保存后成熟培養(yǎng)與常規(guī)立即成熟培養(yǎng)的比較 I)卵母細胞的采集
由屠宰場采集I~2歲齡后備母豬卵巢，放入添加雙抗的30~37°C滅菌生理鹽水中，2h內(nèi)送回實驗室。用IOml注射器，22號針頭從直徑3~6 mm的卵泡中抽取卵母細胞，在顯微鏡下揀出含卵丘細胞在3層及以上且包裹致密的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)，用于成熟培養(yǎng)。
[0015]2)卵母細胞體外成熟 實驗設計
(O對照組=COCs經(jīng)采卵液和成熟培養(yǎng)液(NCSU-37培養(yǎng)基)分別清洗后，放入預平衡3~6h的100 μ I以NCSU-37培養(yǎng)基為體外成熟基礎培養(yǎng)液的成熟液滴中，每滴20~25枚，于39°C、5%C02、5% O2、飽和濕度下培養(yǎng)42~44h，前20_22h在培養(yǎng)液中添加dbcAMP、豬卵泡液(PFF)、PMSG+HCG激素組合(CG)和巰基乙醇(β _ΜΕ)，后22~24h無激素培養(yǎng)。
[0016](2)實驗組:COCs經(jīng)采卵液和TCM199混合液分別清洗3次后，以1.5~3.5ml/100枚(優(yōu)選為2~3ml/100枚)的比例將卵母細胞放入裝有TCM199混合液的第一滅菌燒杯I中，再將第一滅菌燒杯I外壁包裹無菌紗布2，接著將包有無菌紗布2的第一滅菌燒杯I放入盛有超純水的第二滅菌燒杯3中，其中超純水的高度低于第一滅菌燒杯I的燒杯口，然后將第二滅菌燒杯3的燒杯口用保鮮膜4封住，最后將第二滅菌燒杯3置于溫度30~37°C、飽和濕度下保存6~8h，優(yōu)選為置于溫度35°C、飽和濕度下保存6~8h (如圖1所示)。
[0017]之后轉(zhuǎn)入成熟培養(yǎng)液中，與(I)方案相同培養(yǎng)。上述的TCM199混合液由蒸餾水配置而成，其含有 M199 11.01g/L、HEPES4 ~5g/L、NaHC03 0.3 ~0.4 g/L，PH 為 7.2 ~7.3，優(yōu)選為含有 M199 11.01g/L、HEPES4.2 ~4.8g/L、NaHC03 0.32 ~0.38 g/L。
[0018]3)體外受精
采集健康公豬鮮精液，用改良的PGM-tac溶液(peptide研究所日本)洗滌2次，調(diào)整精子濃度為2~4X IO6個/ml，等量加入到50 μ I預平衡12~13h的改良PGM-tac體外受精培養(yǎng)液，制成100 μ I受精液滴。將經(jīng)PGM-tac溶液洗滌后的成熟卵母細胞移入改良的PGM-tac溶液受精液滴，每滴20~25枚，于39°C、5%C02、5% O2、飽和濕度下精卵共同培養(yǎng)6~8h以上。
[0019]4)受精卵培養(yǎng)精卵共同作用后，將假定受精卵在TALP-HEPES洗液中去除卵丘后經(jīng)洗滌移入PZM-5發(fā)育培養(yǎng)液中于39 °C、5%C02、飽和濕度下培養(yǎng)。
[0020]5)結(jié)果
(O延時保存卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的結(jié)果(見表1)
卵母細胞體外培養(yǎng)成熟標準:卵母細胞裹有的卵丘細胞均勻擴散，培養(yǎng)42~44h后釋放出第一極體。
[0021 ] 本試驗共進行3次實驗，采集有效COCs共1990枚，其中試驗組960枚，得到76.25%的成熟率；對照組1030枚，得到78.08%的成熟率，可以看出試驗組和對照組無顯著差異(ρ>0.05)。(見圖 2)
(2)延時保存卵母細胞體外受精效果(見表2)
體外受精標準:共孵作用后卵子釋放出第二極體或培養(yǎng)到48h發(fā)育至2胞期。
[0022]本試驗共進行3次實驗，采集有效COCs共1506枚，其中實驗組卵母細胞共720枚，卵裂數(shù)為396枚，得到卵裂率為55.00% ;對照組卵母細胞共786枚，卵裂數(shù)為441枚，卵裂率為55.87%，試驗組和對照組差異不顯著(p>0.05)。
[0023](3)延時保存卵母細胞體外受精胚胎發(fā)育的效果影響(見表3)
胚胎發(fā)育判斷標準:體外受精后培育發(fā)育5-8d的囊胚發(fā)育比率。
[0024]試驗組受精卵發(fā)育培養(yǎng)至囊胚期胚胎共48枚，囊胚發(fā)育率為12.12% ;對照組56枚，囊胚發(fā)育率為12.23%，試驗組與對照組受精卵胚胎和發(fā)育差異不顯著(p>0.05)。(圖3、圖4)
表1 TCM199 (含HEPES)延遲保存卵母細胞對成熟發(fā)育的影響
【權(quán)利要求】
1.一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，其特征在于將卵母細胞經(jīng)采卵液和TCM199混合液分別清洗后，以1.5~3.5ml/100枚的比例將卵母細胞放入TCM199混合液中，在溫度30~37°C、飽和濕度下保存6~8小時，上述的TCM199混合液中含有M19911.01g/L、HEPES4 ~5g/L、NaHCO3 0.3 ~0.4 g/L, PH 為 7.2 ~7.3。
2.如權(quán)利要求1所述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，其特征在于將卵母細胞按2~3ml/100枚的比例放入TCM199混合液中。
3.如權(quán)利要求1所述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，其特征在于 TCM199 混合液中含有 M199 11.01g/L、HEPES4.2 ~4.8g/L、NaHCO3 0.32 ~0.38g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，其特征在于將清洗后的卵母細胞放入裝有TCM199混合液的第一滅菌燒杯(I)中，再將第一滅菌燒杯(I)外壁包裹無菌紗布(2 )，接著將包有無菌紗布(2 )的第一滅菌燒杯(I)放入盛有超純水的第二滅菌燒杯(3)中，然后將第二滅菌燒杯(3)的燒杯口用保鮮膜(4)封住，最后將第二滅菌燒杯(3)置于溫度30~37°C、飽和濕度下保存6~8小時。
5.如權(quán)利要求4所述的一種可用于體外延時保存卵母細胞生物活性的方法，其特征在于超純水的高度低于第一 滅菌燒杯(I)的燒杯口。
【文檔編號】A01N1/02GK103461323SQ201310286127
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月9日
【發(fā)明者】潘建治, 朱志偉 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院