簡(jiǎn)便、高效、低耗的豬卵母細(xì)胞體外成熟克隆培育方法
【專利說(shuō)明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)便、高效、低耗的豬卵母細(xì)胞體外成熟克隆培育方法，屬于細(xì)胞生物 學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】： 傳統(tǒng)的動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟體系依賴于C02培養(yǎng)箱和細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、石蠟油 等耗材，基本上都依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定嚴(yán)重依賴經(jīng)過(guò)嚴(yán)格訓(xùn)練有素的技術(shù) 人員。進(jìn)行胚胎工程技術(shù)的大規(guī)模工程化生產(chǎn)，要求必須建立操作簡(jiǎn)便、便宜、可操作性較 強(qiáng)的技術(shù)體系。通過(guò)本發(fā)明研宄，成功建立了卵母細(xì)胞3-D搖床成熟體系，很好的解決了服 務(wù)于胚胎工廠化生產(chǎn)的卵母細(xì)胞體外成熟的問(wèn)題，必將對(duì)相關(guān)胚胎工程技術(shù)的應(yīng)用產(chǎn)生巨 大的推動(dòng)和促進(jìn)作用。
[0003]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種簡(jiǎn)便、高效、低耗的豬卵母細(xì)胞體外成熟克隆 培育方法，經(jīng)3-D搖床成熟的卵母細(xì)胞獲得的豬孤雌激活胚胎的囊胚發(fā)育率超過(guò)70%。
[0004] 本發(fā)明為解決就技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是： 一種簡(jiǎn)便、高效、低耗的豬卵母細(xì)胞體外成熟克隆培育方法，其具體操作步驟如下： ① 收集豬卵巢：從屠宰場(chǎng)收集普通商品豬卵巢，置于30~37 °C的0.9%生理鹽水中， 5 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并用生理鹽水沖洗3~5次； ② 挑選卵母細(xì)胞：用帶12號(hào)針頭的10 ml注射器抽取卵巢表面上直徑為2~6 ml 卵泡的卵母細(xì)胞，然后在實(shí)體顯微鏡下用胚胎移液器吸取帶有2層卵丘細(xì)胞以上、胞質(zhì)均 勻的卵母細(xì)胞，在洗卵液中洗3次，再在成熟液中洗2次； ③ 卵母細(xì)胞成熟：將挑選好的卵母細(xì)胞放入含有卵母細(xì)胞成熟液的離心管中，用3-D 搖床成熟45 h，培養(yǎng)條件為39 °C; ④ 供體細(xì)胞分離培養(yǎng)：無(wú)菌獲取成年豬耳部組織樣本，并于低溫條件下及時(shí)運(yùn)送到實(shí) 驗(yàn)室；將其剪碎離心洗滌后，加入適量供體細(xì)胞培養(yǎng)液，并將組織碎塊接種到培養(yǎng)瓶中；待 供體細(xì)胞爬出并長(zhǎng)到70~80%匯合度時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或冷凍保存； ⑤ 挑選成熟卵母細(xì)胞：將成熟42~46 h的豬卵母細(xì)胞在0.1~0.3 %的透明質(zhì)酸酶中 渦旋震蕩，去除卵丘細(xì)胞，挑選排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞，通過(guò)盲吸去核法進(jìn)行去核； ⑥ 克隆胚胎構(gòu)建：吸取中等大小、圓形、細(xì)胞膜折光度較好的供體細(xì)胞注射到透明帶下 方，并輕點(diǎn)透明帶使供體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞細(xì)胞膜良好接觸，形成重構(gòu)卵； ⑦ 克隆胚胎培養(yǎng)：將重構(gòu)卵在洗滌液中洗滌3遍后，分批移到融合槽的融合液中進(jìn)行 融合；將融合過(guò)的重構(gòu)胚，分批移入激活液中激活3h，然后再移入胚胎培養(yǎng)液中，在39°C的 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至移植； ⑧ 克隆胚胎移植：選用自然發(fā)情或誘導(dǎo)發(fā)情的母豬作為受體母豬，發(fā)情當(dāng)天至第2天 手術(shù)進(jìn)行克隆胚胎移植，手術(shù)前停喂飼料12h;將培養(yǎng)好的克隆胚胎置入37°C的便攜式培 養(yǎng)箱中帶入豬場(chǎng)手術(shù)室； ⑨ 克隆胚胎移植后28~30天通過(guò)B超檢查受體母豬懷孕情況。
[0005] 在步驟③中，所述的卵母細(xì)胞成熟液為10%的卵泡液+lPg/ml的促卵泡素FSH +lMg/ml的促黃體素LH+5. 9g/L的輕乙基哌嘆乙硫磺酸Hepes+5_15mM的NaHC03+ 10~20ng/ml的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF+0? 57mM的半胱氨酸L-Cysteine+75yg/ml 的青霉素+50yg/ml的鏈霉素+2~8mM的維他命BT+20剛的維他命E。
[0006] 在步驟④中，所述的供體細(xì)胞培養(yǎng)液為66mg/L的青霉素+100mg/L的硫酸鏈 霉素+ 10~15%的胎牛血清FBS。
[0007] 在步驟⑤中，所述盲吸去核法如下：用固定針固定卵母細(xì)胞，用外徑為18~2〇Mm 的去核針吸取第一極體及其周圍的少量細(xì)胞質(zhì)，然后用去核針輕壓透明帶切口再擠出些許 胞質(zhì)；或用5~10Pg/ml的Hoechest 33342 (-種活細(xì)胞染料，其與細(xì)胞DNA可逆性結(jié)合， 在紫外光照射下，可以發(fā)出熒光)染色15~20min后，在紫外光下直接對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行去核 處理。
[0008] 在步驟⑦中，所述融合液為0.25 M的甘露醇+ 0.05 mmol/L的CaCl2 + 0.1 mm〇l/L的MgS04 + 0. 01%聚乙烯醇；所述激活液為0. 25 M的甘露醇+ 0. 1 mmol/L的 CaCl2+ 0.1 mmol/L的MgS04 + 0.01%的聚乙烯醇；所述激活液為改良豬合子培養(yǎng)液 mPZM+0. 4%牛血清白蛋白BSA + 7. 5呢/ml的細(xì)胞松弛素CB ;所述胚胎培養(yǎng)液為豬合子培 養(yǎng)液mPZM + 0. 4%牛血清白蛋白BSA。
[0009] 在步驟⑧中，所述受體母豬在手術(shù)前要由獸醫(yī)對(duì)其健康狀況進(jìn)行檢查，然后用無(wú) 菌生理鹽水配制0. 025 g/ml的戊巴比妥鈉，按豬體重20~25 mg/kg的用量進(jìn)行麻醉后綁 定；再分別用1%的高錳酸鉀溶液、3%的碘酊和75%的酒精消毒需要手術(shù)部位；手術(shù)時(shí)，在 側(cè)腹部表皮做5~7cm左右的切口，然后依次鈍性分離肌肉、脂肪、腹膜，快速、輕柔地取出 輸卵管和卵巢，并觀察卵巢上排卵情況，準(zhǔn)備移植；整個(gè)過(guò)程中要不斷用保溫生理鹽水沖洗 保留組織，保持其濕度；將胚胎移植管從輸卵管傘部插入5~10cm，然后將克隆胚胎緩緩注 入、撤出、快速縫合創(chuàng)口，并作好創(chuàng)面保護(hù)；手術(shù)后連續(xù)兩天注射青霉素或鏈霉素消炎防止 感染，單獨(dú)隔離受體母豬。
[0010] 經(jīng)3-D搖床成熟的卵母細(xì)胞獲得的豬孤雌激活胚胎的囊胚發(fā)育率超過(guò)70%。
[0011] 本發(fā)明將市售的適宜大小的3-D搖床放置于恒溫箱中，裝有卵母細(xì)胞的離心管放 于搖床之上，構(gòu)成卵母細(xì)胞的3-D搖床成熟培養(yǎng)體系，可以替代昂貴的C0 2培養(yǎng)箱成熟，經(jīng) 3-D搖床成熟的卵母細(xì)胞獲得的豬孤雌激活胚胎的囊胚發(fā)育率超過(guò)70%，達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水 平。
[0012] 本發(fā)明建立了操作簡(jiǎn)便、便宜、可操作性較強(qiáng)的卵母細(xì)胞3-D搖床成熟技術(shù)體系， 可以完全替代傳統(tǒng)的卵母細(xì)胞體外成熟方法。該體系對(duì)于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟和胚 胎培養(yǎng)的優(yōu)化等提供了具體策略和方法，對(duì)于整個(gè)哺乳動(dòng)物的胚胎工程產(chǎn)業(yè)化和相關(guān)發(fā)育 生物學(xué)研宄具有很大的應(yīng)用價(jià)值和借鑒意義。
[0013] 本發(fā)明的試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下： 一、實(shí)驗(yàn)材料與方法： 1.1豬卵母細(xì)胞的收集和體外成熟 從屠宰場(chǎng)收集普通商品豬卵巢，置于30~37 °C的0.9%生理鹽水中5 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn) 室，并用生理鹽水沖洗3~5次。用帶12號(hào)針頭的10 ml注射器抽取卵巢表面上直徑 2~6 ml卵泡的卵母細(xì)胞，在實(shí)體顯微鏡下用胚胎移液器吸取帶有2層卵丘細(xì)胞以上、 胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞（COCs)，在洗卵液中洗3次，再在成熟液中洗2次后成熟。
[0014] 成熟方法一：將卵母細(xì)胞移入在培養(yǎng)箱平衡至少4 h的成熟液滴mTCM199成熟 液（10%的卵泡液、0. 57 mM的半胱氨酸、10-20ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子EGF、75 μg/ml青 霉素、50 μg/ml的鏈霉素，1吒/ml的促卵泡素FSH、1吒/ml的促黃體素LH)中，用 胚胎級(jí)礦物油覆蓋，成熟45 h，培養(yǎng)箱條件為：5 % C02的空氣、最大相對(duì)飽和濕度、39 °C。
[0015] 成熟方法二：挑選好的卵母細(xì)胞放入含有成熟液mTCM199 (10%的卵泡液+ 1呢/ ml的促卵泡素FSH + lMg/ml的促黃體素LH + 5. 9g/L的輕乙基哌嘆乙硫磺酸Hepes + 5-15mM的NaHC03+10~20 ng/ml的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF+ 0. 57mM的半胱氨酸 L-Cysteine + 75 μg/ml的青霉素+ 50 μg/ml的鏈霉素+ 2~8 mM的維他命BT + 20剛的維他命E)的離心管中，用3-D搖床成熟45 h，培養(yǎng)條件為39 °C。
[0016] 該實(shí)驗(yàn)將市售的適宜大小的3-D搖床放置于恒溫箱中，裝有卵母細(xì)胞的離心管則 放于搖床之上，構(gòu)成卵母細(xì)胞的3-D搖床成熟培養(yǎng)體系。
[0017] 1.2供體細(xì)胞分離培養(yǎng)： 無(wú)菌獲取成年豬耳部組織樣本，并于低溫條件下及時(shí)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。分別采用手術(shù)刀 和用眼科剪將其剪碎，并離心洗滌；加入供體細(xì)胞DMEM培養(yǎng)液（66 mg/L的青霉素和100 mg/L的硫酸鏈霉素和10~15%的胎牛血清FBS)少許，并將組織碎塊接種到培養(yǎng)瓶。待細(xì) 胞爬出并長(zhǎng)到70~80%匯合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或冷凍保存。
[0018] 1. 3克隆胚胎構(gòu)建及培養(yǎng)： 將成熟42~46 h的豬卵母細(xì)胞在0. 1~0. 3 %的透明質(zhì)酸酶中渦旋震蕩，去除卵丘 細(xì)胞；挑選排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行去核【在顯微操作儀下用盲吸法去核法進(jìn)行 去核，簡(jiǎn)述如下：用固定針固定卵母細(xì)胞，用外徑為18~2〇Mm的去核針吸取第一極體及其 周圍的少量細(xì)胞質(zhì)，然后用去核針輕壓