一種小菜蛾抗菌肽defensin及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種小菜蛾抗菌肽defensin及其制備方法與應(yīng)用。所述小菜蛾抗菌肽defensin的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；其相應(yīng)的核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。將小菜蛾抗菌肽defensin基因或其成熟肽基因進(jìn)行真核表達(dá)，得到的成熟肽對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌具有抑制作用，尤其是對(duì)蘇云金芽孢桿菌具有顯著的抑制或殺死作用，可應(yīng)用于制備抑制或殺死蘇云金芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的制劑。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種小菜蛾抗菌肽defensin及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種小菜蛾抗菌肽defensin及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]抗菌肽(antibacterial peptide)是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類(lèi)具有生物活性的小分子多肽，存在于多種生物體中，是宿主免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分(Boman andHultmark, 1987; Bulet et al., 2004)?？咕目勺饔糜诟锾m氏陰性菌(GO、革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)、真菌、寄生蟲(chóng)、癌細(xì)胞甚至是包膜病毒，而絕大多數(shù)抗菌肽對(duì)哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞無(wú)害，并且其殺菌機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素完全不同，被學(xué)者們認(rèn)為是一種天然抗生素而備受青睞。隨著研究的不斷深入，越來(lái)越顯示出了其在人類(lèi)醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的獨(dú)特應(yīng)用價(jià)值(Boulanger et al., 2006; Bulet et al., 2004)。
[0003]生物在病原體侵染時(shí)，自身會(huì)產(chǎn)生一系列的拮抗物質(zhì)，以阻止病害的傳播和病原微生物的進(jìn)一步侵染，這種系統(tǒng)被稱(chēng)為防御系統(tǒng)。編碼這些拮抗物質(zhì)的基因統(tǒng)稱(chēng)為防御基因。防御素(defensin)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于植物、昆蟲(chóng)、兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一類(lèi)富含半胱氨酸的天然廣譜抗菌小分子多肽(Tecle et al.，2010)。防御素通常由29飛4個(gè)氨基酸組成，其中包括6~8個(gè)保守半胱氨酸，可通過(guò)半胱氨酸分子間二硫鍵使肽環(huán)形成反向平行的β片狀結(jié)構(gòu)，或含有一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)(Tecle et al.，2010;余興邦等，2006)。防御素分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有廣譜的抗菌活性。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)特征和來(lái)源的不同，動(dòng)物防御素可分為α-防御素、β-防御素和Θ-防御素3種。除此之外，還有昆蟲(chóng)防御素和植物防御素。防御素是一種富含半胱氨酸的小分子多肽，對(duì)細(xì)菌等微生物具有廣譜抗性，且作用機(jī)制特殊。昆蟲(chóng)防御素是1989年由法國(guó)學(xué)者Hoffmann等人首先分離得到，它與兔子肺吞噬細(xì)胞防御素分子同源(Hoffmann and Hetru, 1992)。昆蟲(chóng)防御素大量存在于昆蟲(chóng)血淋巴液中，至今已在昆`蟲(chóng)綱動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種防御素和抗菌肽。成熟的昆蟲(chóng)防御素一般含有34~43個(gè)氨基酸，其分子鏈中在Cys3與Cys4之間有3個(gè)保守的Gly殘基。此外，其分子內(nèi)的3對(duì)二硫鍵配對(duì)也與α-和β-防御素不同，分別為Cysl—Cys4、CyS2—CyS5、CyS3—CyS6。研究表明，昆蟲(chóng)防御素能夠抵抗細(xì)菌的感染，但僅對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性菌表現(xiàn)抗性，對(duì)革蘭氏陰性菌幾乎無(wú)作用；昆蟲(chóng)防御素對(duì)真核細(xì)胞無(wú)作用，而且也未見(jiàn)昆蟲(chóng)防御素抗病毒感染的報(bào)道(付藍(lán)寶等，2011)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種小菜蛾defensin基因。
[0005]本發(fā)明另一目的在于提供一種小菜蛾defensin蛋白。
[0006]本發(fā)明另一目的在于提供一種小菜蛾defensin成熟肽蛋白的制備方法。
[0007]本發(fā)明另一目的在于提供一種小菜蛾defensin和其成熟肽的應(yīng)用，所述應(yīng)用為用于制備抑制或殺死蘇云金芽孢桿菌制劑。[0008]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種小菜蛾抗菌肽defensin基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。
[0009]—種小菜蛾抗菌肽defensin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]一種小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽，成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；成熟肽對(duì)應(yīng)核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0011]一對(duì)擴(kuò)增小菜蛾抗菌肽defensin的引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13~14所示。
[0012]一種重組表達(dá)載體，由出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入如上所述小菜蛾抗菌肽defensin基因序列(如SEQ ID NO:1~2所示)或其成熟肽對(duì)應(yīng)核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0013]優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為pMTA-PxDef。
[0014]一種重組細(xì)胞系,是由如上所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入S2細(xì)胞中所得。
[0015]一種小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽的制備方法，具體方法為向如上所述的重組細(xì)胞系中加入終濃度為250 mM的硫酸銅，連續(xù)收集10天誘導(dǎo)24小時(shí)后培養(yǎng)基上清，將收集的培養(yǎng)基上清混合在一起，離心，收集上清，除去細(xì)胞碎片，首先用平衡buffer平衡Ant1-V5凝膠珠，其次與收集的上清進(jìn)行充分的溫育，然后將Ant1-V5凝膠珠混合液加入柱子中，流速為0.05 ml/min，將所有收集的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基通過(guò)柱子流過(guò)幾次后，用平衡buffer洗脫柱子,直到收集的流出液測(cè)定蛋白濃度A280接近零時(shí),用洗脫buffer洗脫蛋白，并預(yù)先在收集蛋白的管中加入100 mil M Tris-base, pH 8.0收集流出液，并將收集的組分用15% SDS-PAGE電泳分析蛋白的純度和濃度，最后將收集的蛋白進(jìn)行脫鹽，利用超純水對(duì)脫鹽柱Excellulose GF_5進(jìn)行平衡，然后將收集的蛋白加入到柱子中去，收集流出的蛋白，即為成熟肽。
[0016]如上所述小菜蛾抗菌肽defensin的應(yīng)用，用于制備抑制或殺死蘇云金芽孢桿菌的制劑。
[0017]如上所述小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽的應(yīng)用，用于制備抑制或殺死蘇云金芽孢桿菌的制劑。
[0018]本發(fā)明利用農(nóng)業(yè)重要害蟲(chóng)小菜蛾作為研究對(duì)象，利用深度測(cè)序獲得小菜蛾725條免疫相關(guān)的unigenes,從中篩選了 defensin unigene,并利用3 ' -RACE和5' RACE技術(shù)獲得了 defensin的全長(zhǎng)cDNA序列，并在S2細(xì)胞中高效表達(dá)了有活力的重組蛋白defensin。Bt是一個(gè)生物殺蟲(chóng)劑,但是抗菌肽對(duì)Bt產(chǎn)生抑制,如果能將抗菌肽defensin表達(dá)抑制，就增強(qiáng)了 Bt的殺蟲(chóng)活力，可以通過(guò)基因工程手段將抗菌肽defensin的表達(dá)阻斷，就為生產(chǎn)綠色有機(jī)蔬菜和食品開(kāi)辟了新的途徑。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明從重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)小菜蛾中首次克隆得到抗菌肽defensin基因。并將抗菌肽defensin基因序列或其成熟肽基因序列通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)得到有活性的的成熟肽，得到的成熟肽對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌具有抑制作用，尤其是對(duì)蘇云金芽孢桿菌具有顯著的抑制或殺死作用，可應(yīng)用于制備抑制或殺死蘇云金芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的制劑。
[0020]說(shuō)明書(shū)附圖
圖1SDS-PAGE檢檢測(cè)重組蛋白PxDef。[0021]圖2重組蛋白PxDef處理蘇云金芽孢桿菌24 h后的致凋亡作用；A:0.P/oDMSO對(duì)照；B: 10 μ g/mL重組蛋白PxDef ;左上象限:壞死細(xì)胞；右上象限:晚期調(diào)亡細(xì)胞；左下象限:活細(xì)胞；右下象限:早期凋亡細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
[0023]實(shí)施例1
S1.實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)小菜蛾(/7wii?77a幼蟲(chóng),用大腸桿菌coli)
和B.thuringiensis作為供試菌種。
[0024]S2.小菜蛾轉(zhuǎn)錄組序列的測(cè)定:收集小菜蛾I齡到4齡幼蟲(chóng)，預(yù)蛹、蛹、成蟲(chóng)，抽取總RNA后進(jìn)行利用RNA-seq技術(shù)測(cè)定其轉(zhuǎn)錄組序列，總RNA的提取方法參照Trizol(Invitrogen，USA)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。共測(cè)定了 34，522，812 條 clean reads, reads 平均長(zhǎng)度為90bp，獲得3，107，053，080個(gè)堿基。最后組裝成107710個(gè)Unigene，長(zhǎng)度范圍為20(T3000bp。COG,GO,KEGG注釋和分析后共獲得68984條具較高注釋可信度的Unigene，與昆蟲(chóng)免疫直接相關(guān)的Unigenes 725條，其中Defensin的Unigene I條，其序列為342 bp,SEQ ID NO:8 所示。
[0025]S3.根據(jù)defensin的Unigene設(shè)計(jì)3'端和5'端RACE末端快速擴(kuò)增反應(yīng)的特異引物,3' RACE 引物序列為:5' -GCAGGAGACAGTGGTTGAGGAG-3'，如 SEQ ID NO:9 所示，5' RACE 引物為 5' - GTTGGCAAATTGTATCTTCAGTGGCGTC -3'，如 SEQ ID NO: 10 所示。
3'端和5 '端RACE分別和UPMs配對(duì)進(jìn)行RACE末端快速擴(kuò)增反應(yīng)，UPMs引物序列為:UPM-L:5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ 如 SEQ ID NO:11 所示和 UPM-S:5’ -CTAATACGAC TCACTATAGGGC-3’ 如 SEQ ID NO:12 所示。
[0026]S4.cDNA 第一鏈合成:
首先，提取小菜蛾總RNA:用OD值為0.8~1.0的大腸桿菌菌液刺激小菜蛾4齡幼蟲(chóng)，進(jìn)行肽聚糖識(shí)別蛋白的誘導(dǎo)。取0.5~Ig經(jīng)6小時(shí)誘導(dǎo)后的小菜蛾，液氮中研磨，用Trizol法提取小菜蛾總RNA ;總RNA的提取方法參照Trizol (Invitrogen，USA)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
[0027]按照CL0NTECH公司RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，10μδ總RNA，加反應(yīng)液20μ?，42°C反應(yīng)90分鐘。72°C 10分鐘終止反應(yīng)。反應(yīng)液組成:50毫摩爾氯化鉀，3毫摩爾氯化鎂，10毫摩爾Tris-HCL pH8.3，I毫摩爾DTT，5微摩爾d NTP，25單位RNA酶抑制劑，8單位AMV逆
轉(zhuǎn)錄酶。
[0028]S5.3' RACE和5' RACE反應(yīng):以步驟S4反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板，S3所示的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)試劑與條件如下:
首先將下列試劑混合在一起
【權(quán)利要求】
1.一種小菜蛾抗菌肽defensin基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。
2.一種小菜蛾抗菌肽defensin，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一種小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽，其特征在于，成熟肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示；成熟肽對(duì)應(yīng)核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
4.一對(duì)擴(kuò)增小菜蛾抗菌肽defensin的引物,其特征在于，引物序列如SEQ ID N0:13~14所示。
5.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，由出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求1所述小菜蛾抗菌肽defensin的核苷酸序列或權(quán)利要求3所述小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為pMTA-PxDef。
7.—種重組細(xì)胞系，其特征在于，是由權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入S2細(xì)胞中所得。
8.一種小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽的制備方法，其特征在于，具體方法為向權(quán)利要求7所述的重組細(xì)胞系中加入終濃度為250 mM的硫酸銅，連續(xù)收集10天誘導(dǎo)24小時(shí)后培養(yǎng)基上清，將收集的培養(yǎng)基上清混合在一起，離心，收集上清，除去細(xì)胞碎片，首先用平衡buffer平衡Ant1-V5凝膠珠，其次與收集的上清進(jìn)行充分的溫育，然后將Anti_V5凝膠珠混合液加入柱子中，流速為0.05 ml/min，將所有收集的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基通過(guò)柱子流過(guò)幾次后，用平衡buffer洗脫柱子，洗脫到測(cè)定蛋白濃度A280接近零時(shí)，換成洗脫buffer洗脫目的蛋白，在收集蛋白時(shí)，預(yù)先在收集蛋白的管中加入100 UL I M Tris-base ( pH 8.0 )收集流出液，利用15% SDS`-PAGE電泳分析蛋白的純度和濃度，最后將收集的蛋白進(jìn)行脫鹽，利用超純水對(duì)脫鹽柱Excellulose GF_5進(jìn)行平衡，然后將收集的蛋白加入到柱子中去，收集流出的蛋白，即為成熟肽。
9.權(quán)利要求1所述小菜蛾抗菌肽defensin的應(yīng)用，其特征在于，用于制備抑制或殺死蘇云金芽孢桿菌的制劑。
10.權(quán)利要求3所述小菜蛾抗菌肽defensin的成熟肽的應(yīng)用，其特征在于，用于制備抑制或殺死蘇云金芽孢桿菌的制劑。
【文檔編號(hào)】A01P1/00GK103484469SQ201310411704
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】金豐良, 許小霞, 徐洪芝 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)