一種具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗菌劑領(lǐng)域，具體涉及一種具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的抗菌肽及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 長(zhǎng)期大量使用抗生素導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生頑強(qiáng)的耐藥性，對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重 的危害。近30年新型抗生素的研究進(jìn)展緩慢，解決病菌耐藥性這一問(wèn)題已經(jīng)迫在眉睫?？咕?肽(Antimicrobial Peptides，AMP)是一種具有強(qiáng)抗菌作用的陽(yáng)離子多肽，是生物先天免疫 系統(tǒng)的重要組成?？咕脑谧匀唤绶植紡V泛，在微生物、動(dòng)植物體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)?？咕拇蠖?具有廣譜抗細(xì)菌活性，并且對(duì)真菌、病毒及癌細(xì)胞也有殺傷作用。天然存在的抗菌肽一般是 由12-50個(gè)氨基酸組成，同時(shí)具有兩個(gè)明顯的特征:帶有兩個(gè)以上的相鄰的正電荷或具有兩 親性空間結(jié)構(gòu)。天然抗菌肽N末端有較強(qiáng)的形成兩親a螺旋的趨勢(shì)，多富含堿性氨基酸(賴氨 酸，精氨酸），呈強(qiáng)堿性，帶電荷氨基酸均在螺旋一側(cè)分布;C端有形成疏水(螺旋）的傾向，C 端大部分酰胺化且C端中性疏水。因此我們可以知道天然抗菌肽所帶正電荷是形成抗菌作 用的必要條件。抗菌肽是一種很有潛力的新抗菌藥物來(lái)源。人們一方面在繼續(xù)尋找新的陽(yáng) 離子抗菌肽，另一方面對(duì)已知的天然抗菌肽進(jìn)行改造以求獲得高效安全的抗菌藥物。盡管 如此，陽(yáng)離子抗菌肽仍存在著許多尚待解決的問(wèn)題:抗菌肽一級(jí)結(jié)構(gòu)中由于含有多個(gè)堿性 氨基酸(如賴氨酸、精氨酸)而容易被胰蛋白酶水解，從而限制了抗菌肽作為抗感染藥物的 體內(nèi)使用。同時(shí)有些陽(yáng)離子抗菌肽可對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生巨大的毒性作用。因此，開(kāi)發(fā)安 全、穩(wěn)定、低細(xì)胞毒性的抗菌肽具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了一種新型抗菌肽，該抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)具有抗菌活性。
[0004] 本發(fā)明提供了一種多肽，其氨基酸序列為序列表SEQ ID No. 1或SEQ ID No.2的氨 基酸序列所示，所述多肽通過(guò)其氨基酸序列中的2個(gè)半胱氨酸殘基成分子內(nèi)二硫鍵，形成環(huán) 狀。具體的，所述多肽通過(guò)其氨基酸序列中第2位的半胱氨酸殘基與10位的半胱氨酸殘基之 間成分子內(nèi)二硫鍵，形成環(huán)狀。
[0005] 本發(fā)明提供了一種環(huán)狀多肽，其氨基酸序列為序列表SEQ ID No.3或SEQ ID No.4 的氨基酸序列所示，所述環(huán)狀結(jié)構(gòu)為其氨基酸序列中的兩個(gè)半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵 構(gòu)成，即氨基酸序列中第2位的半胱氨酸殘基與10位的半胱氨酸殘基之間形成分子內(nèi)二硫 鍵。
[0006] 本發(fā)明所述環(huán)狀多肽，通過(guò)N-2位點(diǎn)的半胱氨酸殘基與N-10位點(diǎn)的半胱氨酸殘基 形成分子內(nèi)二硫鍵成環(huán)，在環(huán)肽結(jié)構(gòu)中N-端的N-5，N-6和N-8位點(diǎn)由具有較長(zhǎng)的堿性側(cè)鏈的 賴氨酸殘基構(gòu)成，具體結(jié)構(gòu)表示如下。
[0007] 環(huán)狀多肽1:可表示為
卩如序列表SEQ ID No.3所示。 .，
[0008] 和環(huán)狀多肽2:可表示為：
即如序列表SEQ ID No. 4所 不。
[0009] 本發(fā)明多肽的序列特征:長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中半胱氨酸中的巰基形成分子 內(nèi)二硫鍵;拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):環(huán)狀;結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：富含堿性氨基酸，環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
[0010] 本發(fā)明提供了所述環(huán)狀多肽在制備金黃色葡萄球菌抑制劑中的應(yīng)用，以及在制備 治療與預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的藥物中的應(yīng)用。
[0011] 同時(shí)，本發(fā)明提供了一種治療與預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的藥物組合物，包含環(huán) 狀多肽1或環(huán)狀多肽2中的一種或兩種的組合，以及藥學(xué)上可接受的輔料。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種治療與預(yù)防金黃色葡萄球菌感染的聯(lián)合用藥物，包含環(huán)狀多 肽1或環(huán)狀多肽2中的一種或兩種的組合和抗生素的聯(lián)用，所述抗生素選自：青霉素類抗生 素、頭孢類抗生素、喹諾酮類抗生素、碳?xì)涿瓜☆惪股亍⒋蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素中的一種或兩 種及兩種以上的組合。
[0013]此外，本發(fā)明還提供了上述環(huán)狀多肽的制備方法，包括以下步驟：
[0014] (1)采用固相合成法合成序列表SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多 肽；
[0015] (2)對(duì)步驟(1)制備得到的多肽進(jìn)行環(huán)化；
[0016] (3)純化步驟(2)制備得到的多肽。
[0017]其中，步驟(2)環(huán)化方法優(yōu)選為碘氧化法;步驟(3)所述純化方法優(yōu)選采用葡聚糖 凝膠柱進(jìn)行純化。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明制備得到的環(huán)狀多肽對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的 抑制作用；本發(fā)明多肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)有利于提高多肽穩(wěn)定性，并不會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生明 顯的細(xì)胞毒性。
[0019] 本發(fā)明環(huán)狀多肽具有顯著的抗金黃色葡萄球菌的作用，同時(shí)具有良好的穩(wěn)定性， 而相同氨基酸序列的直鏈結(jié)構(gòu)的多肽沒(méi)有明顯的抗菌活性。
[0020] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想的前提下，還可以做出其他多種形式的修改、替換或者變更。
[0021] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方法，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容在做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí) 現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0022] 說(shuō)明書【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1:氨基酸序列為SEQ ID No. 1的直鏈多肽高效液相色譜圖 [0024]圖2:氨基酸序列為SEQ ID No. 1的直鏈多肽的電噴霧離子化質(zhì)譜圖譜
[0025] 圖3:環(huán)狀多肽1的高效液相色譜圖
[0026] 圖4:環(huán)狀多肽1的電噴霧離子化質(zhì)譜圖譜
[0027] 圖5:環(huán)狀多肽2的高效液相色譜圖譜
[0028] 圖6:環(huán)狀多肽2的電噴霧離子化質(zhì)譜圖譜
[0029] 圖7:環(huán)狀多肽1在不同濃度下的2小時(shí)抑菌率
[0030] 圖8:5毫克/毫升環(huán)狀多肽1在不同作用時(shí)間的抑菌率 [0031]圖9:環(huán)狀多肽1在不同時(shí)間的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1氨基酸序列為SEQ ID No. 1的直鏈多肽的合成
[0033] 1)溶脹樹(shù)脂:稱取0. lmmol的Fmoc-甘氨酸-Wang樹(shù)脂于固相反應(yīng)器中，加入10ml的 DCM(二氯甲烷），溶脹樹(shù)脂30min，待樹(shù)脂充分溶脹，真空抽干溶劑。
[0034] 2)脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)：在固相合成器中加入20%哌啶/DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶 液15ml洗滌樹(shù)脂一遍，用真空栗抽干之后加入20%哌啶/DMF溶液15ml，將固相合成器放入 振蕩器中，在常溫下130rpm震搖30min。反應(yīng)結(jié)束后真空抽干，用DCM洗滌2次，抽濾。
[0035] 3)Kaiser法檢測(cè)：用玻璃毛細(xì)點(diǎn)樣管從反應(yīng)器中蘸取少量樹(shù)脂，放入小玻璃管中， 加入3滴水合茚三酮溶液，在沸水浴中加熱，觀察其變色情況。若無(wú)顏色變化則為陰性，若有 顏色變化則為陽(yáng)性，表明Fmoc保護(hù)基洗脫完全或縮合反應(yīng)未進(jìn)行完。經(jīng)檢測(cè)，滴加水合茚三 酮溶液至步驟2)制備產(chǎn)物后，加熱，顏色變?yōu)榧t色。
[0036] 4)肽鏈縮合延長(zhǎng)：稱取3eq Fmoc-Cys(Acm)-OH，3eq(228mg)HBTU(0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯）和3eq(82mg)H0Bt(l-羥基苯并三唑），用DMF溶解后，加入5eq(174yL) DIEA(N，N-二異丙基乙胺)靜置2min使其充分活化，充分混合后加入固相合成器，將固相合 成器放入振蕩器中常溫3小時(shí)?？s合完成后，用DCM，DMF依次洗滌樹(shù)脂。
[0037] 根據(jù)SEQ ID No · 1的氨基酸序列，只是依次替換Fmoc-Cys(Acm)-〇H為Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Ser(tBu)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Ser(tBu)-〇H、Fmoc-Ser(tBu)-〇H、Fmoc-Cys(Acm)-〇H、Fmoc-Ala-〇H，重復(fù)步驟4)以上 各步反應(yīng)得到所需直鏈多肽。
[0038] 5)洗脫樹(shù)脂:在Fmoc-Ala-OH縮合完成后，將樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到50ml錐形瓶中，加入19ml 三氟乙酸和lml純凈水，在磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?h。去掉N-端和側(cè)鏈保護(hù)基并切除樹(shù)脂， 用DCM洗滌三次，濾液濃縮至最小體積后，加入30倍體積冰乙醚，在4°C條件下，10000r/min 離心15min，棄去上清液，重復(fù)結(jié)晶兩次，真空干燥得到多肽直鏈產(chǎn)物。多肽直鏈的產(chǎn)率為 75%。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(說(shuō)明書附圖圖1)和ESI-MS(說(shuō)明書附圖圖2)。進(jìn)行鑒定，高效液相色譜分 析直鏈多肽純度為97.6% ; [Μ-ΗΓ為1134.8，與計(jì)算值一致(表1)確定所合成多肽是氨基酸 序列為SEQ ID No. 1的直鏈多肽。
[0039] 實(shí)施例2環(huán)狀多肽1即環(huán)狀多肽SEQ ID No. 3的合成(該環(huán)狀多肽編號(hào)為:抗菌環(huán)肽 TD34)
[0040]將2.5eq碘溶于體積百分比為75%的甲醇的水溶液中，實(shí)施例1制備得到的直鏈多 肽溶解于75 %的甲醇的水溶液后逐滴加入其中進(jìn)行氧化成環(huán)反應(yīng)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0.5h后濃 縮，得到環(huán)肽粗產(chǎn)品。將環(huán)化后的多肽在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上進(jìn)行減壓蒸餾，去除過(guò)多的溶劑。 [0041 ] 實(shí)施例3環(huán)狀多肽1即環(huán)狀多肽SEQ ID No. 3的純化(該環(huán)狀多肽編號(hào)為:抗菌環(huán)肽 TD34)
[0042]采用凝膠層析色譜Sephadex G-25對(duì)實(shí)施例2制備得到的環(huán)肽粗產(chǎn)品進(jìn)行純化，洗 脫液為體積百分比為50%甲醇水溶液.提純后的環(huán)肽經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干，得到最終產(chǎn)物進(jìn) 行稱重計(jì)算產(chǎn)率為63%。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(圖3)