miR159a基因的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種miR159a基因的應(yīng)用，該基因能夠用于轉(zhuǎn)基因育種且具有高抗旱性。將miR159a轉(zhuǎn)入擬南芥，可顯著提高擬南芥的抗旱性，因此，可將miR159a基因用于培育抗旱性經(jīng)濟作物，提高經(jīng)濟作物的產(chǎn)量。
【專利說明】miR159a基因的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物育種，具體涉及miR159a基因的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)侨祟惖闹饕Z食作物，在世界范圍內(nèi)被廣泛種植。隨著世界人口數(shù)量的不斷增加以及人們生活水平的提高，人類對于糧食的需求量越來越大。因此，保持小麥生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)展，對維護世界糧食安全意義重大。在影響小麥產(chǎn)量的諸多因素中，干旱造成的產(chǎn)量損失是巨大的。據(jù)統(tǒng)計，在我國約2 / 3的小麥種植在干旱半干旱地區(qū)，每年由于干旱造成的小麥減產(chǎn)達700~800億公斤。因此，提高小麥對于旱、鹽堿等非生物脅迫的抗性，改良其對環(huán)境的適應(yīng)性，一直是育種家們面臨的一項艱巨任務(wù)。
[0003]利用傳統(tǒng)的育種方法和物種間的現(xiàn)有遺傳基因通過基因重組技術(shù)來改良作物的耐旱能力還存在很多局限，發(fā)展起來的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為改良作物的耐旱性提供了新的途徑，通過外源基因的導(dǎo)入和表達，可以提高許多轉(zhuǎn)基因植物對干旱脅迫的耐性。因此，尋求干旱誘導(dǎo)基因，研究抗旱基因的表達、調(diào)控和功能，是利用基因工程技術(shù)獲得抗旱轉(zhuǎn)基因小麥的前提，也是生產(chǎn)上亟待解決的突出問題。
[0004]近年來人們在植物miRNA應(yīng)答各種逆境脅迫方面開展了大量的研究工作。早在2004年，Sunkar等人率先利用miRNA mi croarray技術(shù)對擬南芥mi RNA對非生物逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)進行研究，結(jié)果表明，在高鹽、低溫及干旱等條件下，擬南芥中部分miRNA的表達譜會發(fā)生相應(yīng)的變化。另外，miR399和miR395a分別涉及到對無機磷以及硫酸鹽缺乏脅迫下的應(yīng)答反應(yīng)。Sunkar等人在2006年發(fā)現(xiàn)在氧化脅迫下擬南芥miR398的表達明顯下調(diào)，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)證明如果抑制miR398的表達將會大大提高擬南芥對氧化脅迫的抗性。Zhao等人在水稻中發(fā)現(xiàn)miR169的表達明顯受到高鹽脅迫的誘導(dǎo)。還有,應(yīng)用Solexa測序技術(shù)和microarray等高通`量技術(shù),人們已經(jīng)從玉米、水稻以及擬南芥等植物中識別了大量與養(yǎng)分、高鹽和低溫等非生物脅迫相關(guān)的miRNA基因；此外，人們對植物miRNA在應(yīng)答生物脅迫方面也展開了一定的研究。例如在2006年，Navairo等人發(fā)現(xiàn)當(dāng)擬南芥受到病原細菌侵染時，其體內(nèi)的miR399的表達明顯增加，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR399在轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)過量表達將提高擬南芥對該病菌的抗性。上述相關(guān)研究表明，植物在受到外界非生物脅迫或生物脅迫時，會通過調(diào)節(jié)其自身miRNA的表達譜以應(yīng)答這些脅迫，并且這些受脅迫誘導(dǎo)表達的miRNA可能直接與植物抗逆性相關(guān)。
[0005]近年來植物miRNA對干旱脅迫應(yīng)答的研究越來越受到研究人員的重視。如:2007年，Zhao等人發(fā)現(xiàn)水稻miR-169g的表達受干旱脅迫誘導(dǎo)，且在水稻根中受誘導(dǎo)程度明顯大于葉片；2008年，Liu等人利用microarray技術(shù)識別了 4個受干旱脅迫應(yīng)答的擬南芥miRNA ；2011年,Frazier等人發(fā)現(xiàn)9個miRNA受干旱脅迫表達上調(diào),其中miR395a對干旱脅迫最為敏感，而Li等人利用高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)有104個miRNA在干旱脅迫的胡楊中表達升高，27個胡楊miRNA表達下調(diào)；2012年，Eldem等人對扁桃干旱應(yīng)答相關(guān)miRNA的研究表明，在葉片中有262個miRNA的表達受干旱脅迫影響，而有368個miRNA在根中的表達受干旱脅迫發(fā)生顯著改變，而Sun等人發(fā)現(xiàn)miR156和miR162這兩個miRNA的表達在柳枝稷受干旱脅迫時發(fā)生顯著變化，Chen等人發(fā)現(xiàn)miR393可提高擬南芥根對干旱脅迫的耐受性。在轉(zhuǎn)基因研究方面，2011年，Zhang等人利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將miR169c導(dǎo)入番茄使其過量表達，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄具有較強的抗旱性。以上研究成果均表明，miRNA可能在植物應(yīng)答干旱脅迫的過程中扮演著重要的角色，因此，識別抗旱miRNA并研究其相應(yīng)的抗旱調(diào)控機制將有望幫助我們更加深入揭示植物抗旱的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為將來人工培育抗旱作物奠定理論基礎(chǔ)。
[0006]但是，上述已報道的抗性相關(guān)的基因通過轉(zhuǎn)基因進行抗旱性鑒定，發(fā)現(xiàn)很多不具有抗旱性，或?qū)D(zhuǎn)基因植物的抗旱性提高不明顯。因此，有必要提供一種能夠用于轉(zhuǎn)基因育種且具有高抗旱性的基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠用于轉(zhuǎn)基因育種且具有高抗旱性的基因。
[0008]一種miR159a基因的應(yīng)用，其特征在于:miR159a基因在培育抗旱性植物中的應(yīng)用。上述所指的miR159a基因是指所有能夠在植物體內(nèi)最終產(chǎn)生序列為:5，_uuuggauugaagggagcucua_3，°
[0009]具體的為:miR159a基因在抗旱性植物育種中的應(yīng)用。miR159a基因在抗旱性植物轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
[0010] 申請人:通過長期試驗發(fā)現(xiàn):過表達miR159a擬南芥突變株的構(gòu)建分析得到，miR159a轉(zhuǎn)入擬南芥，可顯著提高擬南芥的抗旱性，因此，可將miR159a基因用于培育抗旱性經(jīng)濟作物，提高經(jīng)濟作物的產(chǎn)量。例外，通過將miR159a轉(zhuǎn)入不同經(jīng)濟作物的比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入小麥中獲取的抗旱效果最佳，因此，更為優(yōu)選的方案為:
[0011 ] miR159a基因在培育抗旱性小麥中的應(yīng)用。
`[0012]miR159a基因在抗旱性`小麥育種中的應(yīng)用。
[0013]miR159a基因在抗旱性小麥轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為實施例2中干旱脅迫對miR159a前體表達的影響；
[0015]圖2為實施例3中構(gòu)建的載體的結(jié)構(gòu)圖；
[0016]圖3為實施例4中Northern雜交檢測Tae_miR159在正常及轉(zhuǎn)基因擬南芥的表達，其中:1:非轉(zhuǎn)基因植株；2:轉(zhuǎn)基因植株；
[0017]圖4為實施例5中停止?jié)菜?6天處理的轉(zhuǎn)基因擬南芥。
【具體實施方式】
[0018]以下通過【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的說明和佐證；
[0019]實施例1:小麥干旱脅迫處理及和RNA的提取
[0020]本實施例對2周齡的抗旱和不抗旱的兩種小麥的水培幼苗進行干旱處理，即用20%PEG6000模擬干旱條件對小麥幼苗分別處理0h、3h、6h、9h和12h，然后提取處理后的小麥幼苗的總RNA。[0021]本實施例采用Trizol試劑盒提取小麥總RNA，其具體步驟如下:
[0022]1、液氮速凍的葉片用塑料棒于Eppendorf管中磨碎,加入800 μ I的Trizol,劇烈混勻后室溫放置5min。
[0023]2、在管中再加入400 μ I酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，劇烈混勻后室溫放置5min。
[0024]3、4°C 1000Og離心IOmin,吸取上清液600 μ I至另一新的Eppendorf管，加入600 μ I氯仿，輕柔混勻，室溫放置lOmin。
[0025]4、4°C 1000Og離心IOmin,吸取上清液500 μ I至另一新的Eppendorf管，加入850 μ I無水乙醇,輕柔混勻后，-20°C放置8h以上。
[0026]5、4°C 12000g離心IOmin,棄上清液,加入1000 μ 170%乙醇,輕柔顛倒Eppendorf管，室溫放置5min。
[0027]6、4°C 12000g離心lOmin，棄上清液，放置超凈臺上自然風(fēng)干。
[0028]7、用50 μ I經(jīng)DEPC處理后的ddH20溶解沉淀。保存于-20 V。
[0029]8、取I μ IDNA樣品稀釋50倍，以紫外分光光度計測樣品的0D260和0D280，通過0D260計算RNA樣品濃度及純度。依據(jù)濃度，將樣品統(tǒng)一稀釋至50ng / ul，取I μ I用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0030]實施例2:干旱脅迫下抗旱和不抗旱小麥中miR159a前體的表達動態(tài)
[0031 ] 本實施例對實施例1提取的樣品總RNA進行定量RT-PCR分析，其具體步驟如下:`[0032]按照invitrogen公司提供的反轉(zhuǎn)錄酶說明書配制，反轉(zhuǎn)錄引物為Oligo (dT) 18,反應(yīng)條件為:60°C 5min ；37°C Ih ；70°C IOmin0
[0033]反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍后取I μ I作為模版，其他試劑及容量按照Takara公司提供的 Ex-Taq 說明書配制反應(yīng)體系，溫度條件:94°C Imin ；94°C 20sec, 58°C 20sec, 72°C 40sec,32 循環(huán)；72°C 7min。
[0034]PCR產(chǎn)物加入I / 10體積的IOXloading buffer，上樣于I %瓊脂糖凝膠上，電泳至溴酚藍跑出底線，經(jīng)溴化乙錠染色后應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄結(jié)果，參見圖1。
[0035]實施例3:過表達miR159a擬南芥突變株的構(gòu)建
[0036]本實施例在實施例2的檢測結(jié)果基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建了過表達miR159a的擬南芥突變株，其具體步驟如下:
[0037]l、miR159a組成型表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0038]回收圖1中陜合6號48h的miR159前體片段，通過分子克隆及DNA測定鑒定正確后，通過與35S啟動子融合構(gòu)建成目標(biāo)miRNA的植物表達載體。大致的構(gòu)建策略是:切除PCAMBIA1301載體上的⑶S基因，然后將目標(biāo)片段(miRNA前體片段)插入到原來⑶S基因的位置上。最終構(gòu)建的載體簡圖如圖2所示:
[0039]2、miR159a組成型表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥
[0040](I)將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3103，然后將含有表達載體的陽性農(nóng)桿菌菌落接種于5m含有適量Rif、Gen、Spec抗性的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)2d。
[0041](2)按照1:100比例，移取上一步的培養(yǎng)物于500ml含有適量Rif、Gen、Spec抗性的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)16-24h。
[0042](3)測得此時菌液的OD值在1.5-2.0之間，室溫4000gX IOmin離心收集菌體。
[0043](4)用5%等體積的蔗糖溶液重懸菌體，并往其中加入IOOul Silwet_L77，混勻，轉(zhuǎn)移至500ml大燒杯中。
[0044](5)倒置處于花期的野生型擬南芥(培養(yǎng)方法見2.2.1)，將其花及莖部分浸入農(nóng)桿菌懸浮液中并輕輕攪動1Os左右。
[0045](6)為了保持一定的濕度，用塑料袋將浸染過的擬南芥覆蓋住16_24h。
[0046](7)將處理過的植物移回溫室中繼續(xù)培養(yǎng)1個月，收集種子。
[0047]3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選
[0048](1)將上述收集的種子經(jīng)過消毒后均勻涂布到含有適量Kan和Crb抗性的MS培養(yǎng)基上。
[0049](2)將培養(yǎng)皿置于長日照條件(16h光照/ 8h黑暗，20°C )培養(yǎng)2周，讓種子發(fā)芽和小苗生長，然后篩選能夠正常生長的轉(zhuǎn)基因陽性苗轉(zhuǎn)移到濕土中。
[0050](3)將土中的擬南芥置于溫室短日照培養(yǎng)3-4周，再轉(zhuǎn)換成長日照條件誘導(dǎo)其開花。
[0051](4)通過PCR技術(shù)篩選出PCR陽性的轉(zhuǎn)基因植株。
[0052]實施例4:miR159a在轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型中的表達鑒定
[0053]本實施例采用northern blot來檢測實施例3所得轉(zhuǎn)基因擬南芥miR159a的表達情況，野生型擬南芥作為對照。具體操作參考《分子克隆實驗指南(第三版)》。結(jié)果如圖3所示，目標(biāo)miRNA在轉(zhuǎn)基因擬南芥中得到過量表達。
[0054]實施例5:干旱處理野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥
[0055]將野生型擬南芥和實施例4所得的miR159a高表達的T3代突變株種子種到土里，一個月后進行停水處理，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)停止?jié)菜?6天后，轉(zhuǎn)基因擬南芥仍然生長良好，而對照組的非轉(zhuǎn)基因擬南芥卻已經(jīng)全部枯死。表明Tae-miR159是一個具有強抗旱功能的 miRNA。
[0056]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該于解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種miR159a基因的應(yīng)用，其特征在于:miR159a基因在培育抗旱性植物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的miR159a基因的應(yīng)用，其特征在于:miR159a基因在抗旱性植物育種中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的miR159a基因的應(yīng)用，其特征在于:miR159a基因在培育抗旱性小麥中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的miR159a基因的應(yīng)用，其特征在于:miR159a基因在抗旱性植物轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求3所述的miR159a基因的應(yīng)用，其特征在于:miR159a基因在抗旱性小麥育種中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求3所述的miR159a基因的應(yīng)用，其特征在于:miR159a基因在抗旱性小麥轉(zhuǎn)基因育種中 的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK103695461SQ201310545024
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月2日
【發(fā)明者】金偉波, 吳方麗, 劉雨, 鄭聿賢, 張偉 申請人:浙江理工大學(xué)