VEGFR2基因Val297Ile位點的應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種左旋多巴治療帕金森病藥物敏感性相 關(guān)的VEGFR2基因 Val297Ile位點的應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管內(nèi)皮生長因子受體 2 (vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2)屬于受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK)超家族，主要分布在血 管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中，是血管內(nèi)皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor，VEGF-A)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，提高血管通透性的主要調(diào)節(jié)因子，并且在 VEGF-A的信號傳導(dǎo)中起主導(dǎo)作用。
[0003] 研宄報道左旋多巴（levodopa，L-dopa)治療帕金森病誘發(fā)運(yùn)動障礙并發(fā)癥，可能 與血腦屏障功能退化，使得原本難以通過血腦屏障的藥物滲入黑質(zhì)和紋狀體，引起L-dopa 腦內(nèi)有效濃度的變化所致。多項研宄證實L-dopa導(dǎo)致運(yùn)動障礙與VEGF-A上調(diào)，誘導(dǎo)血腦 屏障內(nèi)皮生成，改變血腦屏障滲透性相關(guān)。
[0004] 研宄表明VEGFR2基因多態(tài)性與多種疾病相關(guān)，并采用了不同的基因分型方法來 進(jìn)行檢查。例如，有研宄采用質(zhì)譜分型方法證實VEGFR2(rs2071559)多態(tài)性與膠質(zhì)瘤風(fēng)險 增加有關(guān)；有研宄采用Taqman探針法研宄了 VEGFR2-604T/C多態(tài)性與鼻咽癌易感性及侵襲 性的關(guān)系。質(zhì)譜分型是針對大樣本多位點的高通量分型方法，而Taqman探針法是中通量分 型的金標(biāo)準(zhǔn)，并且具有靈敏度高、花費(fèi)相對較少的優(yōu)點。
[0005] Taqman探針法是在PCR上下游引物間選取一段序列作為探針，并在探針上下標(biāo)記 熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，該探針可與模板結(jié)合，在延伸反應(yīng)中，當(dāng)引物合成至探針與模板結(jié)合 處時，Taq酶的5'外切酶活性可以降解探針的5'端，使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，釋放熒 光。相對于傳統(tǒng)的限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP)，Taqman探針法具有靈 敏度更高、操作更簡單的優(yōu)勢，且通路更高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供VEGFR2基因 Val297Ile位點的應(yīng)用方法，具體地說是一種檢測與 左旋多巴治療帕金森藥物敏感性相關(guān)基因的多態(tài)性的試劑盒，該試劑盒可用于制備檢測與 左旋多巴治療帕金森藥物敏感性相關(guān)基因的多態(tài)性的試劑。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0008] VEGFR2基因 Val 29711 e位點的應(yīng)用方法，所述的VEGFR2基因 Val 29711 e位點用于 制備檢測帕金森患者對于采用左旋多巴治療時的藥物敏感性的制劑。
[0009] 上述制劑包括試劑盒，特別是包括采用Taqman探針法的試劑盒。
[0010] 所述的試劑盒中含有檢測VEGFR2基因 Val297Ile位點的探針和引物，所述探針和 引物能與VEGFR2基因 Val297Ile位點前后的基因序列特異性結(jié)合并擴(kuò)增出包含VEGFR2基 因 Val297Ile位點的基因序列。
[0011] 所述的探針和引物優(yōu)選是與VEGFR2基因 Val297Ile位點前后500bp的基因序列 特異性結(jié)合并能擴(kuò)增出包含VEGFR2基因 Val297Ile位點的基因序列。
[0012] 所述的試劑盒中含有如下探針：
[0013] VIC-CCTTAACTATAGATGGTGTAACC-MGB ；
[0014] FAM-CTTAACTATAGATGGTATAACC-MGB ；
[0015] 所述的試劑盒中含有如下引物：
[0016] 5' -CAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAAT-3' ；
[0017] 5 ' -GGTCATCAGCCCACTGGAT-3 '。
[0018] VIC和FAM為報告基團(tuán)，VIC吸收波長515-535nm，發(fā)射波長540-560nm ;FAM吸收 波長485-505nm，發(fā)射波長515-530nm ;MGB為淬滅基團(tuán)。
[0019] 上述試劑盒檢測時根據(jù)FAM與VIC熒光強(qiáng)度相當(dāng)，說明VEGFR2基因 Val297Ile位 點為AG基因型；VIC熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于FAM熒光強(qiáng)度，說明VEGFR2基因 Val297Ile位點為GG 基因型；FAM熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于VIC熒光強(qiáng)度，說明VEGFR2基因 Val297Ile位點為AA基因型。
[0020] 本課題組的前期研宄表明，VEGFR2基因多態(tài)Val297Ile(rs2305948)可能通過影 響VEGFR2表達(dá)水平，從而與左旋多巴治療帕金森藥物敏感性相關(guān)，而之前并無相關(guān)報道。
[0021] VEGFR2蛋白的胞外域包含7個免疫球蛋白樣袢。胞外第1袢是與VEGF結(jié)合的必 須部位，第2-3袢是與VEGF緊密結(jié)合的主要部位，VEGFR2基因 Val297Ile位點編碼VEGFR2 胞外域第3袢。在中國漢族人群中，其最小等位基因頻率（Minor Allele Frequency, MAF) 為29. 71 %。由于目前還沒有有關(guān)Val297Ile基因多態(tài)性及其功能的相關(guān)報道，本課題組近 期研宄才發(fā)現(xiàn)其與左旋多巴治療帕金森藥物敏感性相關(guān)，所以還沒有人檢測過VEGFR2基 因 Val297Ile多態(tài)性，更沒有相關(guān)檢測的試劑盒產(chǎn)品面世。因此，探索檢測與左旋多巴治療 帕金森藥物敏感性相關(guān)基因的多態(tài)性的方法及產(chǎn)品顯得意義深遠(yuǎn)。
[0022] 本發(fā)明的試劑盒能準(zhǔn)確、快速、簡便地檢測與左旋多巴治療帕金森藥物敏感性相 關(guān)的基因位點（VEGFR2基因 Val297Ile多態(tài)性）。
【附圖說明】
[0023] 圖1為Taqman探針法檢測VEGFR2基因 Val297Ile位點基因型；
[0024] 圖2為質(zhì)譜法檢測VEGFR2基因 Val297Ile位點基因型。
【具體實施方式】
[0025] 以下結(jié)合實施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0026] 實施例1
[0027] 1.設(shè)計Taqman探針及引物
[0028] I. 1查找VEGFR2基因 Val297Ile位點前后500bp序列
[0029] 在 PUBMED SNP 數(shù)據(jù)庫中搜索 VEGFR2,進(jìn)入 Gene view，選擇 NC_000004. 12 轉(zhuǎn)錄本 并顯示整個基因區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性（SNP)，進(jìn)入rs2305948,在Fasta sequence中可獲 得此多態(tài)位點前、后500bp的序列（SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6)，用于尋找合適的探針和 引物。
[0030] CAGGCTATGAATATTAGTTTTCTCTAGGTGATTACATCTTTCCACATTATGTCATTTCTCTGTTCTCCA AAGTTTTTGATCTACATTCCTTTTAAGGGAATTTCTCTTTAAGAGGTGGCATGAGATACACTGCTCCTTAAACAGTG GTCACATTTACTTGTGTTTCTGCAGTTTATATCCATCTCACTTTCACCACGTGAGGTTTTAAAAATCCTAATTCAGT TGGTTCCATTTATTTCTCCTGAAACAAAATATATTTGTTGTCTGCATGAGGTTAAAAGTTCTGGTGTCCCTGTTTTT AGCATTAAATAATGTTTACCAAAGCCCAGATTTAATTCTGTGTGTTACTAGAAGTTATTGGGTAATGTTATATGCTG TGCTTTGGAAGTTCAGTCAACTCTTTTTTTCAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTC TGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGT(SEQ ID NO. 5)
[0031] Y(Y 是指 VEGFR2 基因 Val297Ile 位點）
[0032] TAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCA CATTTGTCAGGGTCCATGGTAAGCTATGGTCTTGGAAATTATTCTGTGCCTTGACAAGTGAGATAATTTAAATAAAT TTAGGTCACTTAGTGATTCCTATTTTGTTCATTCAGAAGATAGTTTCTAGTTTTTCTTGTTAGGGAGGCCACATGAC CTAGAGGTCAAGAGCATAGCTTTGTAGTCAGGAACTTGGGTTCAAACCTCAACTTTAAAGATGAGATGTGCTGATAT ACAGTAAGAGTTCATTTAGTATTACTTATTATAGTTATTGCTGCTATTAGGATTGTTACTATGATAAATAGTATTAG CTAAGGTAGTTTTTAAATTTTCATTTTATTGCAAGGCTGAGAGGCCTACTTGAATAAGCATGAGCTTTGCAAACTGG GGAAACATTTAGCAATATACAGTTGACCTGTGAGCAACTCAGGGAT(SEQ ID NO. 6)
[0033] I. 2利用Primer Express3. 0進(jìn)行探針和引物設(shè)計
[0034] (I)探針設(shè)計原則：
[0035] 1.確保G-C含量在20% -80 %之間。
[0036] 2.探針5'端的第一個堿基不能是G。
[0037] 3.用Primer Express軟件計算出來的探針Tm值應(yīng)當(dāng)在68-7CTC之間。
[0038] 4.探針要盡可能地短，但是不要短于13個堿基。
[0039] 5.避免同一堿基重復(fù)過多，特別是G，不可超過4個及以上。
[0040] 6.盡量使用含C多于含G的探針。如果C少于G，則使用互補(bǔ)鏈上的探針。
[0041] 7.如果是SNP，多態(tài)性位點盡量位于探針中央。
[0042] (2)引物設(shè)計原則：
[0043] 1.在探針確定以后再選擇引物。
[0044] 2.引物要盡可能地接近探針，但是不要重疊