一種基于多肽k12的轉基因載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體地說，是多肽K12修飾的PEI衍生物P407-PEI轉 基因載體及其應用。
【背景技術】
[0002] 基因治療是近年來建立在基因工程技術和分子遺傳學原理上的新型治療方法，因 腫瘤發(fā)生于發(fā)展的生物學基礎是基因突變，所以基因治療現已成為功克腫瘤最具希望的領 域?；蛑委熡腥齻€重要環(huán)節(jié)，即目的基因、轉基因載體和靶細胞?；虻谷胂到y(tǒng)是基因治 療的核心技術，現階段面臨的最大難題在于尚未找到理想的基因載體。目前應用的載體包 括病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體轉染效率較高但存在運載能力低、有潛在安全 威脅等問題，而非病毒載體近年來發(fā)展迅速，尤其是陽離子聚合物。
[0003] 聚乙稀亞胺（polyethyleniminePEI)是近年來研宄最為廣泛的陽離子多聚物非 病毒基因載體，富含陽離子，具有強大的緩沖能力，有較強結合DNA和黏附細胞的能力。然 而，聚乙烯亞胺作為基因載體使用存在兩個突出問題：第一、轉染效率與細胞毒性存在矛 盾。小分子PEI雖細胞毒性低，但在生理的離子濃度下與DNA易發(fā)生解離，造成轉染效果差； 分子量在20kd以上的PEI雖具有較理想的轉染率，但由于PEI表面富含陽性電荷以及體內 不可降解性，致使高分子量PEI表現出較強的細胞毒性。第二，聚乙烯亞胺靶向性差：它是 利用自身所帶的正電荷，與細胞表面帶負電荷的受體通過靜電作用相結合，所以細胞的選 擇特異性差，解決靶向性問題已成為非病毒載體中最為關注的問題。另外，聚合物/DNA復 合物是需要進入到細胞核中，并被RNA解離從而發(fā)揮作用。因此，如何提高陽離子復合物在 體內祀細胞的細胞核遞送能力成為其能否應用于臨床的關鍵之一。泊洛沙姆poloxame是 一類由聚氧乙烯（PE0)、聚氧丙烯（PP0)組成的PE0-PP0-PE0型非離子三嵌段共聚物。泊洛 沙姆407 (簡稱P407)由約70%乙烯氧化物和30%丙烯氧化物組成，平均分子量11500,是 泊洛沙姆系列中研宄最為廣泛、也是最常用到的一種聚合物。
[0004] 核定位信號NLS是核內功能蛋白進入細胞核的結構基礎，是介導某些蛋白入核的 一段充分而必要的信息片段，大分子物質可通過NLS的介導經核孔復合物主動運轉至細胞 核內，其中研宄最多的NLS是來自SV40的T抗原，主要功能序列為KKKRKV。借助NLS可將 PEI的復合物由細胞核轉運到核內，提高復合物的轉染效率。NPR是腦膠質瘤腫瘤細胞膜和 新生血管內皮細胞膜上存在的跨膜蛋白，在腫瘤的生物學方面起著十分關鍵的作用，目前 已證實NRP受體在胰腺癌、胃癌、結腸癌、黑色素瘤、卵巢癌等細胞上均存在高表達，可作為 惡性腫瘤的標志之一。tLyP-1是新發(fā)現的靶向多肽，氨基酸序列為CGNKRTR，能特異性的靶 向并與NRPs受體高效結合，同時能產生跨血管滲透和腫瘤穿膜作用，對NPR受體有特異性 和高親和性。研宄顯示tLyP-1能選擇性的歸巢與腫瘤靶位，高效的從血管內滲到血管外， 均勻性地浸潤到腫瘤間質內，并能穿過腫瘤細胞的細胞膜進入核細胞內。
[0005] 因此，理論上可將tLyP-1 (序列為CGNKRTR)引入NLS序列（KKKRK)，合成含 tLyP-l、NLS的多肽tLyP-l-l-NLS(序列為KKKRKCGNKRTR，命名為K12)，用于修飾P407-PEI 衍生物，增強其在體內對腫瘤細胞選擇性，并提高核遞送能力，從而增加DNA的體內轉染效 率。
[0006] 中國專利文獻CN201110372844. 5,公開了一種雙功能肽修飾的基因載體及其制備 方法和應用，該發(fā)明的基因載體是由雙功能肽（RGDCTAT)和普朗尼克P123修飾的聚乙烯亞 胺衍生物偶聯(lián)而成的。中國專利文獻CN201410766122. 1公開了一種由功能肽R11修飾的基 因載體及其制備方法和應用，該發(fā)明的基因載體是由雙功能肽（RGDCNLS)和普郎尼克P123 修飾的聚乙烯亞胺衍生物偶聯(lián)而成。但是關于多肽tLyP-1-NLS修飾的泊洛沙姆407-聚乙 烯亞胺，目前還未見報道。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種多肽。
[0008] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種基因載體。
[0009] 本發(fā)明的另一的目的是，提供上述基因載體的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的第四個目的是，提供一種基因復合物。
[0011] 本發(fā)明的第五個目的是，提供上述多肽及基因載體的用途。
[0012] 為實現上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0013] 一種多肽，所述的多肽氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0014] 本發(fā)明提供的多肽由核定位信號肽NLS(KKKRK)與具有靶向于NRP跨膜蛋白受體 的tLyP-1組成，多肽序列為KKKRKCGNKRTR。
[0015] 為實現上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0016] 一種基因載體，它是由如上所述的多肽和聚乙烯亞胺衍生物偶聯(lián)而成，所述的聚 乙烯亞胺衍生物是泊洛沙姆407修飾的聚乙烯亞胺即P407-聚乙烯亞胺，所述的泊洛沙姆 407與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:1-20;所述的聚乙烯亞胺的分子量范圍為600-70000Da。
[0017] 所述的泊洛沙姆407與聚乙烯亞胺摩爾比為1:1-10。
[0018] 所述的泊洛沙姆407與聚乙烯亞胺摩爾比為1:10。
[0019] 所述的多肽與聚乙烯亞胺衍生物的摩爾比為1-20:1;優(yōu)選為2:1。
[0020] 為實現上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0021] 如上任一所述的基因載體的制備方法，包括如下步驟：
[0022] (a)合成如上所述的多肽；
[0023] (b)泊洛沙姆407除水后，加入兩倍摩爾量的三光氣，磁力攪拌反應后加入N-羥基 琥珀酰亞胺，攪拌條件下逐滴加入無水三乙胺，待反應完全后除去溶劑，所得殘渣溶于乙酸 乙酯，離心取上清液，旋蒸除去乙酸乙酯，冷卻固化后得活化的泊洛沙姆407 ;
[0024] (c)活化的泊洛沙姆407與聚乙烯亞胺PEI分別溶于無水二氯甲烷，將所得的兩液 同時加入無水二氯甲烷底液中，充氮氣飽和后磁力攪拌過夜，透析，凍干，得P407-PEI;
[0025] (d)將表面活性劑溶解于二甲基亞砜溶液中，步