一種短小芽孢桿菌gbsw19及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)GBSW19，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏日期為2013年9月9日，保藏編號為CGMCC?No.8140。本發(fā)明的短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)GBSW19可用于作物秸稈降解，同時兼具抑制水稻紋枯病菌、水稻白葉枯病菌等植物病原菌的功能，從而促進(jìn)水稻的生長，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種短小芽孢桿菌GBSW19及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種短小芽孢桿菌GBSW19及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]作物秸桿是當(dāng)今世界上僅次于煤炭，石油，天然氣的第四大能源，也是唯一可再生的能源，是最具有利用潛力的生物質(zhì)資源之一。在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中，秸桿資源不經(jīng)過任何處理而直接用于肥料、燃料和飼料，利用率較低，并且大量的秸桿由于缺乏合適利用方法而被農(nóng)民就地焚燒，一方面是對資源的一種浪費(fèi)，另一方面，給周邊地區(qū)安全和環(huán)境帶來了巨大威脅，如釋放出大量一氧化碳、氮氧化物、光化學(xué)氧化劑和懸浮顆粒等對人體有害的物質(zhì)。
[0003]目前，雖然秸桿利用的方法有很多，在不同地區(qū)的效果也不錯，但由于技術(shù)和成本的原因，秸桿在工業(yè)及能源領(lǐng)域的應(yīng)用尚存在一定程度的制約；此外，由于目前收集、運(yùn)輸秸桿成本高而收購價(jià)格低，農(nóng)民缺少積極性，因而并未從根本上解決秸桿出路問題，農(nóng)民們?nèi)匀辉谀陱?fù)一年地就地焚燒大量秸桿。
[0004]就中國乃至全世界的秸桿利用情況來看，秸桿還田是目前適用范圍最廣，最容易推廣的利用方法。秸桿還田可以將秸桿中的C、N、K、P及微量元素釋放到大田，大量研究結(jié)果表明，秸桿還田能有效改善土壤物理性狀，增加土壤養(yǎng)分含量，有利于土壤中有機(jī)質(zhì)的積累，長期保持秸桿還田，可以有效解決目前中國耕地生產(chǎn)力和肥力下降問題，同時顯著提高作物產(chǎn)量并減少甚至替代部分化肥的使用。然而，秸桿不經(jīng)處理直接還田在自然條件下腐解速度慢，影響播種、出苗和苗期生長；而且秸桿覆蓋后會給病蟲害提供越冬場所，易使下茬作物發(fā)生各類病蟲害。
[0005]短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus),是一種耐熱、好氧的G+桿狀細(xì)菌,該菌能產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的芽孢，能顯著抑制病原菌，是一種常見的植物根圍促生細(xì)菌(PGPR)，也是目前生防細(xì)菌中研究和應(yīng)用較多的一類細(xì)菌；同時，大量的報(bào)道證實(shí)，芽孢桿菌可以產(chǎn)生胞外纖維素酶、半纖維素酶等，可以有效降`解木質(zhì)纖維素。因此，在秸桿降解過程中，利用可產(chǎn)生降解木質(zhì)纖維素酶類的生防短小芽孢桿菌加速秸桿木質(zhì)纖維素的降解，使養(yǎng)分最有效的釋放；同時，作為生防菌的芽孢桿菌對大田作物本身不僅無害，還兼具對病原微生物的拮抗作用，從而降低病害發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。短小芽孢桿菌生長繁殖快、營養(yǎng)需求低、對人畜無害、能夠抑制多種作物病害并產(chǎn)生脂肽化合物，且其批量生產(chǎn)工藝簡單、成本較低、施用方便、儲存期長、不會讓農(nóng)作物產(chǎn)生抗藥性，這些優(yōu)點(diǎn)使之成為一種理想的作物秸桿降解制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提出一種能夠有效降解作物秸桿、同時能拮抗作物病原菌的短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)GBSW19。
[0007]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)GBSW19,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年9月9日，保藏編號為CGMCC N0.8140。[0009]該菌為革蘭氏陽性菌，細(xì)桿狀，好氧，能運(yùn)動。菌落半透明，微黃色。生理生化特性:接觸酶陽性，V-P反應(yīng)呈陽性，不能水解淀粉、可以水解酪素，不產(chǎn)生吲哚。&16S rDNA測序結(jié)果與 Genbank 上(http://www.ncb1.nlm.nih gov/blast/Blast.cgi )已知序列進(jìn)行比對，與 Bacillus pumilus XJSL4-9 相似度為 100%。
[0010]所述短小芽孢桿菌GBSW19能產(chǎn)生胞外木質(zhì)纖維素降解酶和表面活性肽。
[0011]包含所述短小芽孢桿菌GBSW19和/或其代謝產(chǎn)物并以其為活性成分的微生物制劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]優(yōu)選地，所述微生物制劑為液態(tài)。
[0013]本發(fā)明還提供了上述微生物制劑的制備方法，包括如下步驟:
[0014](I)將所述短小芽孢桿菌GBSW19接種于LB固體培養(yǎng)基，于28~37°C下培養(yǎng)14~24小時獲得菌體；
[0015](2)將步驟(1)獲得的菌體接入LB液體培養(yǎng)基中，于28~37°C下振蕩培養(yǎng)12~24小時制成種子液；
[0016](3)按體積百分比為5%的接種量，將步驟(2)所得種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28~37°C下發(fā)酵培養(yǎng)至少36~48小時，收集發(fā)酵液即得所述微生物制劑。
[0017]上述制備方法中，優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下重量百分比的組分:小麥秸桿粉I~3%、優(yōu)選2%，磷酸氫二鉀0.1~0.5%、優(yōu)選0.2%，硝酸鈉0.3~0.8%、優(yōu)選0.5%和葡萄糖0.5~1.5%、優(yōu)選1%。
[0018]本發(fā)明還提供了所述短小芽孢桿菌GBSW19的應(yīng)用，具體應(yīng)用如下:
[0019]所述短小芽孢桿菌GBSW19在作物秸桿降解中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述作物秸桿為小麥稻桿。
[0020]所述短小芽孢桿菌GBSW19在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。
[0021]所述短小芽孢桿菌GBSW19在防治水稻白葉枯病中的應(yīng)用。
[0022]所述短小芽孢桿菌GBSW19在促進(jìn)水稻生長中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明提供的短小芽孢桿菌GBSW19對小麥秸桿等作物秸桿有明顯的降解效果，并且對水稻紋枯病菌、水稻白葉枯病菌等植物病原菌有明顯的抑制效果。本發(fā)明短小芽孢桿菌GBSW19單獨(dú)作用于秸桿時，秸桿失重率可達(dá)39.8%，纖維素降解率達(dá)31.5%，半纖維素降解率達(dá)37.7%，木質(zhì)素降解率達(dá)52.9%。
[0024]保藏信息
[0025]保藏日期:2013年9月9日；
[0026]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱:CGMCC)，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，100101 ；
[0027]保藏編號:CGMCCN0.8140。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為實(shí)施例1分離的部分菌株的BOX-PCR指紋圖譜。
[0029]圖2為基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0030]圖3為實(shí)施例2所述對31株生防芽孢桿菌的平板篩選的部分結(jié)果(A)和胞外內(nèi)切纖維素酶活測定結(jié)果(B);其中，圖A顯示的平板篩選的部分結(jié)果包含了本發(fā)明的短小芽孢桿菌GBSW19。
[0031]圖4為本發(fā)明的短小芽孢桿菌GBSW19單獨(dú)降解時小麥秸桿粉的失重率曲線。
[0032]圖5為本發(fā)明的短小芽孢桿菌GBSW19單獨(dú)降解時小麥秸桿粉的纖維素降解率曲線。
[0033]圖6為本發(fā)明的短小芽孢桿菌GBSW19單獨(dú)降解時小麥秸桿粉的半纖維素降解率曲線。
[0034]圖7為本發(fā)明的短小芽孢桿菌GBSW19單獨(dú)降解時小麥秸桿粉的木質(zhì)素降解率曲線。
[0035]圖8為本發(fā)明的短小芽孢桿菌GBSW19產(chǎn)生的表面活性素(surfactin)的MALD1-TOF-MS 檢測圖。
[0036]圖9顯示分離的本發(fā)明短小芽孢桿菌GBSW19的抑菌活性；從左到右依次為對水稻白葉枯病菌(A)和水稻紋枯病菌(B)的抑菌活性效果圖，其中CK代表空白對照組，GBSW19代表本發(fā)明短小芽孢桿菌GBSW19處理組。
【具體實(shí)施方式】
[0037]為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下。
[0038]實(shí)施例1具有生 防效應(yīng)的芽孢桿菌的分離、篩選與鑒定
[0039]采用五點(diǎn)取樣法，于西藏拉薩市、林芝地區(qū)、山南地區(qū)和日喀則地區(qū)，不同環(huán)境條件下共采集35個土樣，以稀釋涂平板法對菌株進(jìn)行分離純化，分離得到1388個菌株。然后，以水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)和油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)為指不菌，最后得到311株抑菌效果較好的菌株(抑菌圈直徑> 5mm)。對這311個抑菌效果好的分離菌株進(jìn)行基因組rep-PCR (repetitive extragenic palindromic PCR)指紋圖譜篩選,共得到 150 個指紋圖譜不一樣菌株(指紋圖譜見圖1)。對經(jīng)過指紋圖譜篩選獲得的150個菌株進(jìn)行生理生化鑒定，將150個菌株分為7個類群，然后，從每個類群中選取代表性的菌株共31個株系進(jìn)行脂肪酸氣相色譜(fatty acid methyl ester, FAME)和16S rDNA分子鑒定(見圖2),最后，綜合表型鑒定和一系列分子鑒定的結(jié)果，將分離的、有生防潛力的31個芽孢桿菌菌株鑒定為:短小芽孢桿菌(B.pumilus) 11株,臘樣芽孢桿菌(B.cereus) 7株,蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis) 3株,解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) 3株,萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus) 3 株，B.axarquiensis2 株,枯草芽抱桿菌(B.subtilis) I 株,地衣芽抱桿菌(B.1icheniformis) I 株。
[0040]實(shí)施例2兼具生防和秸桿降解潛力菌株的篩選
[0041]以實(shí)施例1所鑒定的31株生防芽孢桿菌為基礎(chǔ)，以平板透明圈法進(jìn)行第一輪初篩，得到可以產(chǎn)生胞外木質(zhì)纖維素降解酶的菌株27株，部分平板篩選結(jié)果見圖3A。緊接著以不同性質(zhì)的多糖底物測定這27株芽孢桿菌胞外酶活力的大小，胞外內(nèi)切纖維素酶活測定結(jié)果見圖3B。最后綜合初篩和復(fù)篩結(jié)果，得到2株兼具生防和秸桿降解潛力的菌株GBSW19 和 LNXM37。
[0042]實(shí)施例3菌株GBSW19對小麥秸桿粉的實(shí)際降解效果綜合測評[0043]將實(shí)施例2所得平板上活化的GBSW19菌株挑至液體LB培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)12小時制成種子液，再以體積百分比為2%的接菌量轉(zhuǎn)接至添加小麥秸桿粉(5目)為唯一碳源的Hutchinson培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),于不同天次收集培養(yǎng)液，并以差重法和改進(jìn)的Van Voest法測定小麥秸桿粉的失重率、纖維素降解率、半纖維素降解率和木質(zhì)素降解率，最終得到菌株GBSW19對小麥秸桿粉的實(shí)際降解效果綜合測評結(jié)果(見圖4-7)。
[0044]圖4-7結(jié)果顯示:菌株GBSW19單獨(dú)作用于秸桿時，秸桿失重率可達(dá)39.8%，纖維素降解率達(dá)31.5%，半纖維素降解率達(dá)37.7%，木質(zhì)素降解率達(dá)52.9%。
[0045]實(shí)施例4菌株GBSW19產(chǎn)生的脂肽化合物的MALD1-T0F-MS分析
[0046]脂肽化合物是芽孢桿菌產(chǎn)生的最主要抑菌化合物，包括伊枯草菌素(Iturin)、表面活性素(Surfactin)和芬枯草菌素(Fengycin)三大類,在植物病害防治過程中發(fā)揮著重要的作用。將芽孢桿菌菌株GBSW19首先接種于LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第二天將菌株轉(zhuǎn)接入含有Landy培養(yǎng)基的三角瓶中，在30°C、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)38h。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物離心取上清液，在上清液中加入6mol.T1HCl調(diào)pH至2.0,然后輕微攪動2h或過夜。離心收集沉淀,加入甲醇后用Imo l.L4NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，再用甲醇抽提2次并將抽提液合并，獲得脂肽類化合物粗提物；利用基質(zhì)協(xié)助激光解吸附離子化-飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)對該粗體物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)GBSW19可以產(chǎn)生surfactin (見圖8)。
[0047]實(shí)施例5本發(fā)明短小芽孢桿菌GBSW19的抑菌活性
[0048]a.對病原細(xì)菌水稻白葉枯病菌的抑菌篩選
[0049]將指示菌病原細(xì)菌水稻白葉枯病菌按一定比例(1:30)加入冷卻到50°C左右的NA培養(yǎng)基中混勻，制成含菌平板，在距離中心2.5cm處十字垂直放置4個直徑為4_的濾紙片，吸取待測菌株菌液5 μ 1，接種于濾紙片上，對照不接種測試菌，用無菌水代替，每個處理重復(fù)三次。置于28°C培養(yǎng)箱共培養(yǎng)2-3天后，觀察并記錄結(jié)果。
[0050]b.對病原真菌油菜菌核病菌的拮抗篩選
[0051]在26°C培養(yǎng)箱中活化的油菜菌核病病菌PDA平板邊緣打取直徑為0.7cm的菌碟(取指示菌邊緣生長旺盛的菌絲塊)，接種在新的PDA平板中央。在距離菌塊2.5cm處，呈“十”字形分布的四個接種點(diǎn)，放上直徑4mm的濾紙小圓片，取待測菌液5ul點(diǎn)在濾紙片中央，對照不接種測試菌，用無菌水代替，每個處理重復(fù)3次，放入26°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天后，取出觀測并記錄抑菌結(jié)果。
[0052]c.對病原真菌水稻紋枯病菌的拮抗篩選
[0053]在28°C培養(yǎng)箱中活化的水稻紋枯病菌PDA平板邊緣打取直徑為0.7cm的菌碟(取指示菌邊緣生長旺盛的菌絲塊)，接種在新的PDA平板中央。在距離菌塊2.5cm處，呈“十”字形分布的四個接種點(diǎn)，放上直徑7mm的濾紙小圓片，取待測菌液5ul點(diǎn)在濾紙片中央，對照不接種測試菌，用無菌水代替，每個處理重復(fù)3次，放入26°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天后，取出觀測并記錄抑菌結(jié)果。
[0054]結(jié)果:本發(fā)明短小芽孢桿菌GBSW19能夠有效抑制水稻白葉枯病菌和水稻紋枯病菌，抑菌圈直徑分別>15mm和>5mm，如圖9的A和B所示；對油菜菌核病菌無明顯抑制效果。
[0055] 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于上述，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。`
【權(quán)利要求】
1.一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)GBSW19,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年9月9日，保藏編號為CGMCC N0.8140。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌GBSW19，其特征在于，能產(chǎn)生胞外木質(zhì)纖維素降解酶和表面活性肽。
3.—種微生物制劑，其特征在于，其活性成分為權(quán)利要求1或2所述短小芽孢桿菌GBSW19和/或其代謝產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物制劑，其特征在于，所述微生物制劑為液態(tài)。
5.如權(quán)利要求3或4所述微生物制劑的制備方法，包括如下步驟: (1)將所述短小芽孢桿菌GBSW19接種于LB固體培養(yǎng)基，于28~37°C下培養(yǎng)14~24小時獲得菌體； (2)將步驟(1)獲得的菌體接入LB液體培養(yǎng)基中，于28~37°C下振蕩培養(yǎng)12~24小時制成種子液； (3)按體積百分比為5%的接種量，將步驟(2)所得種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28~37°C下發(fā)酵培養(yǎng)至少36~48小時，收集發(fā)酵液即得所述微生物制劑； 優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下重量百分比的組分:小麥秸桿粉I~3%、優(yōu)選2%，磷酸氫二鉀0.1~0.5%、優(yōu)選0.2%，硝酸鈉0.3~0.8%、優(yōu)選0.5%和葡萄糖0.5~1.5%、優(yōu)選1%。
6.權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌GBSW19在作物秸桿降解中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述作物稻桿為小麥稻桿。
7.權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌GBSW19在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌GBSW19在防治水稻白葉枯病中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌GBSW19在促進(jìn)水稻生長中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01P3/00GK103589670SQ201310560992
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日
【發(fā)明者】高學(xué)文, 臧昊昱, 伍輝軍, 張萬寬 申請人:無錫亞克生物科技有限公司