一種作為斷乳仔豬飼料添加劑的表達乳鐵蛋白重組乳酸菌組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種作為斷乳仔豬飼料添加劑的表達乳鐵蛋白重組乳酸菌組合物，其特征在于，所述組合物將戊糖乳桿菌（Lactobacillus?pentosus?KLDS1.0413）和植物乳桿菌（Lactobacillus?plantarum?KLDS1.0344）作為口服活載體，其中，戊糖乳桿菌和植物乳桿菌中均含有連接有PLF基因的穿梭表達載體pPG612.1。本發(fā)明可以替代抗生素，乳鐵蛋白還能刺激腸道細胞的生長，增加腸道中有益菌群，如雙歧桿菌和乳酸桿菌等的數量，減少大腸桿菌等有害菌群的繁殖，從而保障仔豬腸道健康發(fā)育，增強仔豬腸道對營養(yǎng)物質的消化、吸收能力，降低腹瀉率，提高其生長性能，促進仔豬生長。
【專利說明】一種作為斷乳仔豬飼料添加劑的表達乳鐵蛋白重組乳酸菌組合物
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種作為斷乳仔豬飼料添加劑的表達乳鐵蛋白重組乳酸菌組合物，可作為活菌制劑直接添加到仔豬日糧中，進而提高仔豬生長性能，免疫功能和腸道微生態(tài)健康，屬于基因工程和飼料科學領域。
【背景技術】
[0002]斷奶時期在豬的整個生長周期中是一個非常具有挑戰(zhàn)性且影響重大的時期，斷乳仔豬飼養(yǎng)中由于環(huán)境和營養(yǎng)條件的變化，使仔豬的腸道內正常菌群遭受破壞，加上斷奶后胃腸消化酶減少，活性不足，影響對飼料的消化，引起消化不良性腹瀉；仔豬由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，對抗原刺激反應很弱，不能積極地產生主動免疫，只能從母乳中獲得被動免疫，斷乳后，會造成免疫機能下降，另外仔豬的神經調節(jié)機能弱，在斷奶、更換飼料、變換環(huán)境等應激狀態(tài)下會誘發(fā)一系列的斷乳應激綜合癥，甚至造成死亡。改善飼料品質是減少斷乳應激的主要防治措施。日糧品質的改善主要體現在基本營養(yǎng)成份的改善和添加劑的使用兩方面:
[0003]飼料基本營養(yǎng)成分的改變主要考慮日糧中蛋白質的消化率、適口性、氨基酸平衡和是否有免疫保護等，以及應用一些優(yōu)質原料，提高斷乳仔豬日糧的可消化性，降低其抗原性。為提高早期斷乳仔豬的采食量，彌補消化酶和胃酸的不足，目前國內外在早期斷乳日糧中普遍使用的添加劑主要有酸化劑、調味齊?、酶制劑等。近年來提出的益生素的研究引起越來越多人的關注，其作為一種活菌制劑通過在腸道內的大量繁殖來調節(jié)腸道菌群的平衡，并在代謝過程中產生有機酸、酶、氨基酸及一些生長因子來增強動物的抗病力。
[0004]乳鐵蛋白(Lactoferrin, LF)是一種天然活性鐵結合糖蛋白，廣泛存在于動物的乳汁(初乳)、血液、唾液、小腸液等外分泌液或血漿、中性粒細胞中。其中除乳腺組織中含量豐富外，其他組織中均含量甚微。LF能夠調節(jié)機體對鐵的需求，影響腸黏膜對鐵的吸收，從而達到機體內鐵離子的平衡。動物機體內轉運鐵離子的蛋白有運鐵蛋白和乳鐵蛋白，都具有運輸鐵的功能，由于運鐵蛋白在極酸性的胃環(huán)境內不能正常發(fā)揮其運送鐵的能力，而乳鐵蛋白能夠抵抗胃酸，仍然能保持自身生理功能，因此乳鐵蛋白才能在動物腸道內運送鐵離子。當LF運送到達腸道后，與腸黏膜細胞表面的特異性受體細胞結合，再由這些受體細胞運送鐵離子進入細胞內部，然后乳鐵蛋白-R進入細胞內部，釋放鐵離子，從而達到增強機體對鐵的吸收作用，它能使吸收率提高5~7倍。另外，現已經確定LF廣譜的抗菌和抗病毒活性，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用，針對需鐵的革蘭氏陰性菌，如大腸菌群、沙門氏菌等；可抑制的革蘭氏陽性菌有金黃色葡萄球菌、單細胞李斯特菌等，但基本不抑制對鐵需求不高的細菌，如乳酸菌。在抗病毒方面，對牛LF研究成果較顯著，研究比較多的如單純皰疹病毒、丙肝病毒、人免疫缺陷性病毒、人巨細胞病毒、人乳頭瘤病毒及貓科動物免疫缺陷性病毒都有很強的抑制作用。LF還是一種天然的機體免疫調節(jié)劑。LF能夠發(fā)揮其特異的調節(jié)功能，主要是與其靶細胞表面的特異性受體結合的能力，機體釋放出的LF能夠與致病菌細胞膜表面的受體結合，并導致病菌的死亡，從而發(fā)揮免疫調節(jié)的功能，同時還能夠調節(jié)機體細胞因子的水平，促進抗體的生成，誘導機體體液免疫應答，促進B細胞和T細胞的成熟和淋巴細胞增生，從而減輕炎癥反應。LF還有促進中性白細胞向受傷部位的吸附和聚集、增加粒細胞黏性、調節(jié)免疫球蛋白分泌、參與調節(jié)機體免疫耐受能力、促進細胞間相互作用、抑制補體系統(tǒng)激活或激活已有的補體途徑等功能。斷乳后乳鐵蛋白的補充可提高早期斷奶仔豬生產性能、促進腸黏膜發(fā)育、改善腸道微生物菌群、增強腸道黏膜分泌型免疫球蛋白A和腸道細胞因子的產生，但由于乳鐵蛋白來源有限，大腸桿菌及酵母菌的體外表達，純化成本高，難以在生產中推廣應用；如果以益生性乳酸菌進行分泌表達，通過發(fā)酵罐大量培養(yǎng)后以活菌制劑的形式，無需純化，可直接作為飼料添加劑飼喂仔豬，既可以抑制斷乳應激的產生，又可以替代抗生素在飼料生產中進行應用，為健康環(huán)保的綠色添加劑。
[0005]乳酸菌(Lactic Acid Bacteria, LAB)是一群可以發(fā)酵碳水化合物(主要指葡萄糖)產生乳酸的革蘭氏陽性兼性厭氧細菌，廣泛存在于人、畜的消化道中并發(fā)揮著重要的生理功能。主要包括乳酸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、鏈球菌等十幾個屬。乳桿菌(Lactobacillus)是乳酸菌屬中最重要的一個種屬，乳酸乳球菌長期以來在食品工業(yè)應用廣泛，被公認為安全級(GRAS, generally recognized as safe)微生物。以乳酸乳球菌作為宿主菌，構建表達載體用來表達異源蛋白和酶，已經成為食品工業(yè)、疫苗開發(fā)及生物制藥研究的熱點，尤其在食品工業(yè)領域更是深入，以其營養(yǎng)價值高、生長迅速、操作簡單等優(yōu)點成為表達外源蛋白、作為活載體疫苗的理想選擇。
[0006]現有技術中，以牛初乳為原料，利用色譜法、超濾法、鹽析法以及酸沉淀法等從乳液中分離純化乳鐵蛋白。通過以上工藝制備的乳鐵蛋白作為飼料添加劑直接添加到動物日糧中以發(fā)揮其生物學功能。其缺點是原料來源有限，工藝繁瑣，耗資高，只能小規(guī)模的進行實驗研究，不能在生產中應用推廣。此外，通過基因工程生產乳鐵蛋白作為飼料添加劑，已經有報導成功在大腸桿菌和畢赤酵母中表達乳鐵蛋白，通過基因工程的方法，得到完整的cDNA,構建生產乳鐵蛋白原核表達載體，通過發(fā)酵法大量生產乳鐵蛋白。經過分離純化，獲得重組乳鐵蛋白，作為飼料添加劑直接添加到動物日糧中以發(fā)揮其生物學功能。而這一方法的缺點是酵母菌和大腸桿菌都不能大量直接添加到飼料中飼喂動物，所以所表達的乳鐵蛋白也需要純化，純化成本高，難以在生產中推廣應用。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明依據乳鐵蛋白的多種生物活性，合成了豬(porcine)乳鐵蛋白(PLF)基因，其核苷酸序列為SEQ N0.1,選擇公認的安全級(GRAS, generally recognized as safe)乳酸桿菌中的具有良好益生作用的戍糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus KLDS1.0413)和植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum KLDS 1.0344)作為口服活載體，將PLF基因與穿梭表達載體PPG612.1連接，穿梭表達載體PPG612.1的核苷酸序列為SEQ N0.2，構建了表達PLF蛋白的兩種重組乳桿菌 pPG612.1-PLF/L.pentosus 和 pPG612.1-PLF/L.plantarum,將誘導表達升級到發(fā)酵罐大量培養(yǎng)，以發(fā)酵培養(yǎng)的活菌作為飼料添加劑飼喂斷乳仔豬，本發(fā)明可以替代抗生素，乳鐵蛋白還能刺激腸道細胞的生長，增加腸道中有益菌群，如雙歧桿菌和乳酸桿菌等數量，減少大腸桿菌等有害菌群的繁殖，從而保障仔豬腸道健康發(fā)育，增強仔豬腸道對營養(yǎng)物質的消化、吸收能力，降低腹瀉率，提高其生長性能，促進仔豬生長?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0008]圖1為重組戊糖乳桿菌KLDS1.0413Western blotting鑒定結果圖，其中，M為蛋白分子質量標準；I為經誘導的pPG612.1/L.pentosus ；2為經誘導pPG612.1-PLF/L.pentosus ；3為經誘導的pPG612.1/L.pentosus發(fā)酵上清濃縮物；4為經誘導的pPG612.1-PLF/L.pentosus 培養(yǎng)發(fā)酵濃縮物；
[0009]圖2為重組植物乳桿菌KLDS1.0344Western blotting鑒定結果圖，其中，M為蛋白分子質量標準；1為經誘導的pPG612.1/L.plantarum;2為經誘導pPG612.1-PLF/L.PI an tar um ；3為經誘導的pPG612.1/L.pi ant arum發(fā)酵液上清濃縮物；4為經誘導的pPG612.1-PLF/L.pi ant arum 發(fā)酵液上清濃縮物。
【具體實施方式】
[0010]下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。
[0011]試驗例I表達乳鐵蛋白的兩株重組乳酸菌的構建和發(fā)酵生產
[0012]PLF全基因序列由公司優(yōu)化合成，兩端分別有BamH I和Xho I酶切位點。
[0013]pPG612.1質粒由實驗室保存，質粒用BamH I和Xho I雙酶切，酶切反應體系37°C水浴2h，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回3290bp的片段，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確的線性化PPG612.1與PLF全基因序列進行連接，體系于連接儀中16°C連接過夜。
[0014]連接產物轉化大腸桿菌TGl，在LB氯霉素(10 μ g/ml)選擇性培養(yǎng)基平板上37°C培養(yǎng)12?18h。挑取單菌，37°C振蕩培養(yǎng)IOh,用小量質粒DNA提取試劑盒提取重組質粒，落通過單、雙酶切和PCR方法鑒定，將提出的陽性克隆命名為pPG612.1-PLF,送到北京博士生物技術有限公司進行測序。
[0015]測序正確后，將陽性重組質粒電轉化到戊糖乳桿菌和植物乳桿菌中，成功構建PLF兩種乳桿菌原核表達載體，得到的重組菌中在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)。
[0016]發(fā)酵罐及附屬控制裝置按照說明書進行組裝，用PH4.14,6.86的校正液校正PH計，配置2.5L的無糖MRS培養(yǎng)基于發(fā)酵罐中，將校正好的PH計插入指定位置，用錫紙包上與導管連接口，將整個發(fā)酵罐放入滅菌鍋內，濕熱滅菌121°C，30min ;滅菌結束后連接冷凝水管，插入溫度計，冷卻至37°C ;依次接入50mL的50%果糖，兩種重組乳桿菌混合菌液IOOml ;調控PH值6.4(用氨水自動調節(jié)PH)，攪拌速度為50rpm，接通CO2氣體；待菌液OD6tltl約為0.6時，加入誘導劑。設定程序，發(fā)酵6小時之后自動連續(xù)補加50%滅菌果糖，添加速率為每分鐘泵0.5s ;發(fā)酵24h，無菌條件下收集菌液，用作飼料添加劑。
[0017]試驗例2表達乳鐵蛋白的檢測
[0018]Western Blot檢測蛋白表達
[0019]樣品的處理:取發(fā)酵后的pPG612.1-PLF/L.pentosus 和 pPG612.1-PLF/L.PI ant arum 菌液以及作為對照的 pPG612.1/L.pentosus 和 pPG612.1/L.pi ant arum 各ImL, 5000r/min離心IOmin,分離上清液和菌體沉淀,分開處理。[0020](I)取 800 μ L 上清液，加入 400 μ L100%TCA 冰上放置 30min，4 °C 20000g 離心30min,棄凈上清后用250 μ L丙酮清洗沉淀一次，用80 μ L50mM NaOH溶解沉淀，再加入等體積的SDS-PAGE2X上樣緩沖液(含DTT) 100°C煮沸IOmin。
[0021](2)向離心后的菌體沉淀中加入72yL的TER，37°C水浴30min，加入18yL的20%SDS，溶液將從渾濁變澄清，100°C煮沸3min，再加入30 μ L的SDS-PAGE4X上樣緩沖液(含 DTT) 100°C煮沸 IOmin。
[0022]ffestern-blot 鑒定
[0023]兔抗PLF高免血清(I: 500稀釋)，37°C作用2h ;羊抗兔IgG_HRP(l:2000稀釋)，37°C作用2h后,在暗室條件下ECL顯色(曝光2min,顯影Imin,定影5min),觀察顯色結果如圖1和圖2所示。
[0024]試驗例3本發(fā)明與現有技術中仔豬飼料的比較
[0025]從豬場購買108頭斷奶仔豬(大白X長白；初始體重為5.66±0.09千克21±3d的年齡)，按照初始體重分成三個處理組，每組12頭，分別為對照組(基礎日糧)、抗生素組(基礎日糧+20mg/kg黃霉素+110mg/kg金霉素)和重組(recombinant)乳鐵蛋白(rPLF)組(基礎日糧+發(fā)酵重組菌菌液)每組有三個重復。配制日糧，以滿足美國國家研究委員會(NRC) 5-10公斤仔豬建議營養(yǎng)搭配，飼料和水可供仔豬自由采食。其中發(fā)酵重組菌菌液量為:60ml濃度為2X 107CFU/ml的兩種重組菌發(fā)酵液，實驗期為30天。
[0026]1、發(fā)酵菌液飼喂仔豬后的生長表現
[0027]抗生素組和實驗組仔豬生長狀態(tài)良好，采食量較多，皮膚呈粉紅色，毛順而有光澤，對照組仔豬采食量相對較少，有輕微腹瀉狀況發(fā)生，皮膚，毛缺乏光澤。
[0028]從開始飼喂重組菌之后的十四天中，稱量仔豬的始末體重，每天記錄仔豬的日采食量。
[0029]與對照組相比，rPLF組平均日增重(ADG)增加(Ρ〈0.01)，平均日采食量(ADFI) (P=0.013)增加，提高了飼料利用率(G/F) (Ρ〈0.01);抗生素組 ADG (P=0.01)，ADFI (P=0.015)以及飼料利用率也顯著增加。然而，rPLF組與抗生素組沒有顯著差別，如表I所示。
[0030]表1重組豬乳鐵蛋白對仔豬生長性能的影響
[0031]
【權利要求】
1.一種作為斷乳仔豬飼料添加劑的表達乳鐵蛋白重組乳酸菌組合物，其特征在于，所述組合物將戍糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus KLDS1.0413)和植物乳桿菌(Lactobacillus pi ant arum KLDS 1.0344)作為口服活載體，其中，戍糖乳桿菌和植物乳桿菌中均含有連接有PLF基因的穿梭表達載體pPG612.1，所述PLF基因的核苷酸序列為SEQN0.1。
2.權利要求1所述的表達乳鐵蛋白重組乳酸菌組合物在斷乳仔豬飼料添加劑方面的用途。
【文檔編號】A23K1/00GK103689247SQ201310594969
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權日:2013年11月22日
【發(fā)明者】唐麗杰, 李一經, 喬薪瑗, 姜艷平, 崔文, 于慧, 劉敏 申請人:東北農業(yè)大學