專利名稱：乳鐵蛋白變體及其應用的制作方法
Ⅰ發(fā)明領域本發(fā)明總的涉及乳鐵蛋白相關的糖蛋白。更具體地，本發(fā)明涉及乳鐵蛋白變體及其部分、它們的生產以及應用。
Ⅱ發(fā)明背景乳鐵蛋白是非血紅素鐵結合糖蛋白中運鐵蛋白家族的成員(Aisen等，1980,Ann,Rev.Biochem.49:357-393)，運鐵蛋白家族還包括運鐵蛋白，血液中主要運輸鐵的蛋白質(MacGollivray等，1983,J.Biol.Chem.258:3543-3553)；卵運鐵蛋白，禽蛋白色蛋白(Jeltesh等，1982,Eur.J.Biochem.122:291-295)；以及黑色素運鐵蛋白，該家族的一種膜結合形式見于人體黑色素細胞(Rose等，1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:1261-1265)。乳鐵蛋白有很廣的分布，它不僅存在于充滿機體表面的外部分泌物中(Masson等，1971,Comp.Biochem.Physiol.39:119-129；Hemmart等，1991,Am.J.Clin.Nutr.53:32-39；Masson等，1966,clin.chim.Acta.14:735-739；Pentecost等，1987,J.Biol.Chem.262:10134-10139；Yu等，1993,Biochem.J.296:107-111)，還存在于多形核嗜中性白細胞的二級顆粒中，該顆?？稍谑戎行园准毎せ顣r釋放到血液中(Masson等，1969,J.Exp.Med.130:643-658)。乳鐵蛋白的功能包括與鐵結合并運輸到小腸(Fransson等，1980,J.Pediatrics96:380-384；Iyer等，1993,Eur.J.Clin.Nutr.47:232-241；Cox等，1979,Biochem.Biophys.Acta.558:129-141；Hu等，1988,Biochem.J.249:435-441；Gislason等，1995,J.Pediatr.Gastroent,Nutr.21:37-43；Mikogami等，1994,Am.J.Physiol.267:G1-G8；Ward等，1995,Biotechnology13:498-503)；對各類革蘭陰性和革蘭陽性細菌有抗微生物活性(Oram等，1968 Biochem.Biophys.Acta.170:351-365；Aronld等，1977,Science197:263-265；Ellison等，1988,Infect.Immun.56:2774-2781；Bellamy等，1992,Biochem.biophys.Acta.1221:130-136；Yamauchi等，1993,Infect.Immun.61:719-728)；促進細胞生長(Hashizume等，1983,Infect.Immun.763:377-382；Nichols等，1987,Pediatr.Res.21:563-567)；調節(jié)成髓作用(Sawatzki等，1989,Blood Cells15:371-375；Broxmeyer等，1986,Blood Cells13:31-48；Zucali等，1979,Blood54:951-954)；以及免疫調節(jié)性能(Machnicki等，1993,Int.J.Exp.Path.74:433-439；Crouch等，1992,Blood80:235-240；Zagulski等，1989,Br.J.Exp.Pathol.70:697-704)。
乳鐵蛋白與運鐵蛋白家族其它成員有高度的結構同源性。所有這些蛋白質均是分子量約為80kDa的單體糖蛋白。Aisen等，1980,Ann.Rev.Biochem.49:357-393；Metz-Boutique等，1984,Eur.J.Biochem.145:659-676。用X射線晶體學分析已經精確地確定了乳鐵蛋白(Anderson等，1989,J.Mol.biol.209:711-734)和運鐵蛋白(Lindley等，1988,Biochem.27:5804-5812)的三維結構。蛋白質的氨基和羧基端各一半折疊成球狀葉形。該雙葉結構的氨基和羧基端各一半之間的保守性約為40％，認為這是由共同的始祖基因的基因內復制而進化成的。Williams等，1982,Trends biochem.Sci.7:394-397。兩葉各自可與鐵發(fā)生高親和性的可逆結合，并伴隨與一個陰離子(通常是碳酸根)結合。Asien等，1980,Ann.Rev.Biochem.49:357-393。乳鐵蛋白與鐵結合所需的氨基酸在運鐵蛋白家族中是高度保守的。Baker等，1992,J.Inorg.Biochem.47:147-160。在乳鐵蛋白中，鐵原子與氨基端葉結構中的Asp396,Tyr93,Tyr193和His254以及羧基端葉結構中相應的Asp396,Tyr93,Tyr193和His254分別結合。Anderson等，1989,J.Mol.Biol.209:711-734。
盡管它們的結構相似，但是乳鐵蛋白比其在血清中的對應物運鐵蛋白表現出高得多的鐵結合親合性。特別是，乳鐵蛋白的鐵釋放比運鐵蛋白表現出更高的pH穩(wěn)定性，后者在約6-4的pH范圍內釋放鐵，而前者在約4-2的pH范圍內釋放出鐵。Mazuier等，1989,Biochem.Biophys.Acta.629:399-408。曾經提出，乳鐵蛋白特有的鐵結合性能賦予了該蛋白質一些不同的功能活性。對參與乳鐵蛋白特有鐵結合性能的結構和功能特性的描述，使我們得以模仿并生成性能改進的乳鐵蛋白變體，這些變體包括，但不局限于，對鐵有較高的親和性、抗微生物活性改進的乳鐵蛋白變體；對鐵親和性較低、鐵釋放性能改進的乳鐵蛋白變體、或對鐵釋放的pH依賴性有所修飾的乳鐵蛋白變體。
本發(fā)明申請者曾報道過在絲狀真菌(包括曲霉屬(Aspergillus))中高水平生產重組人乳鐵蛋白及其特點。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503；美國專利No.5,571,896,5,571,619和5,571,697，其內容均納入本文作參考。盡管它有特殊而獨特的糖組成，但是該重組蛋白質顯示與人乳中乳鐵蛋白在生理活性(包括與鐵和受體的結合以及抗微生物活性)方面沒有區(qū)別。因此，現在該表達系統可用來生產足夠量的乳鐵蛋白變體，以說明該蛋白質的結構/功能，從而生成性能改進的變體。
Ⅲ發(fā)明概述本發(fā)明涉及編碼乳鐵蛋白變體或其部分的核酸序列，其中該部分包括乳鐵蛋白至少一個鐵結合位點的對應序列。與野生型乳鐵蛋白相比乳鐵蛋白變體或其部分的還有比改進的鐵結合性能進一步得到明確。
通過定點誘變，本發(fā)明解釋了兩葉結構對乳鐵蛋白特有的鐵結合性能的作用。使人乳鐵蛋白cDNA在該蛋白質一葉或兩葉中參與鐵結合的兩個酪氨酸殘基選擇性突變，將獲得的三個鐵結合缺陷型變體在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中表達，并純化。采用39FeCl3作鐵結合分析表明，兩葉中任一葉參與鐵結合的兩個酪氨酸殘基的突變將使突變葉選擇性地失去鐵結合性。另外，pH依賴型鐵釋放研究證明，乳鐵蛋白兩葉的鐵結合穩(wěn)定性不同，氨基端葉比羧基端葉更具酸不穩(wěn)定性。更重要的是，本發(fā)明表明，功能性鐵結合羧基端葉是氨基端葉與鐵結合pH穩(wěn)定性所必需的，這是野生型乳鐵蛋白的特性。這些結果支持這樣一個結論乳鐵蛋白兩葉之間的相互協同作用產生了該蛋白質特有的鐵結合性能。
因此，本發(fā)明提供指南來生產性能改進(如變化的鐵結合性質，如增強或減弱對鐵的親和性，改變鐵結合的pH或溫度需求或范圍)的乳鐵蛋白變體。而且，本發(fā)明還提供指南來設計具有其它改進性質(如在保持鐵結合活性的同時有治療耐受性能)的乳鐵蛋白變體。
第二方面，本發(fā)明還涉及包括編碼乳鐵蛋白變體或其部分的核酸的載體，該載體適于在真核細胞中表達乳鐵蛋白變體或其部分。較佳的，質粒適于在真菌細胞中表達，這些真菌細胞包括米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(aspergillusniger)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)以及泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。
本發(fā)明的第三方面還涉及制備這些載體和包含這些載體的轉染細胞的方法。另外也提供在各種真核細胞或原核細胞中生產乳鐵蛋白及其變體的方法。最后，本發(fā)明涉及用本發(fā)明方法制得的乳鐵蛋白及其變體。因此，本發(fā)明提供了一種經濟有效地生產重組乳鐵蛋白及其變體以及乳鐵蛋白相關多肽的方法。
Ⅳ附圖簡述

圖1A和1B顯示了經純化的鐵結合缺陷型乳鐵蛋白變體的Western免疫印跡分析和銀染分析結果。
圖1A表示對純化的重組人乳鐵蛋白(Rec hLF)、氨基端沒有鐵結合性(MN-2Y)、羧基端沒有鐵結合性(MC-2Y)、氨基和羧基端均沒有鐵結合性(MNC-4Y)的乳鐵蛋白變體樣品各200ng的Western免疫印跡分析。
圖1B是對純化的Rec hLF、MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y(各1gμ)的銀染SDS聚丙烯酰胺凝膠分析的結果。
圖2A、2B、2C和2D表示鐵結合缺陷型乳鐵蛋白變體與生物素化的重組乳鐵蛋白變體競爭結合人腸細胞。
圖2A。在濃度漸增的未標記鐵飽和重組乳鐵蛋白(Fe-Rec hLF)或脫輔基(即不含鐵)重組乳鐵蛋白(Apo-Rec hLF)存在或不存在下，使鐵飽和的生物素化重組人乳鐵蛋白(0.4μm)與Caco-2膜(300ng)一起培育。用生物素/親和素微量滴定測定法(Ward等，1995,Biotechnology13:498-503)測定生物素化乳鐵蛋白與Caco-2膜結合受抑制的情況。
圖2B、2C和2D。在濃度漸增的未標記Apo-Rec hLF或MN-2Y(圖2B)、MC-2Y(圖2C)或MNC-4T(圖2D)的存在或不存在下，使脫輔基生物素化的重組人乳鐵蛋白(0.4μm)與Caco-2膜(300ng)一起培育。用生物素/親和素微量滴定測定法測定生物素化乳鐵蛋白與Caco-2膜結合受抑制的情況。數據用均值±平均標準差來表示。
圖3表示乳鐵蛋白氨基端(MN-2Y)、羧基端(MC-2Y)、氨基羧基端(MNC-4Y)鐵結合缺陷型變體的鐵飽和分析結果。如實驗步驟中所述的，用鐵使不含鐵的重組人乳鐵蛋白(Rec hLF)、MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y飽和。用液體閃爍計數法測定與樣品結合的59Fe量，確定Fe/蛋白質的摩爾比。數據用均值±標準差表示。
圖4表示乳鐵蛋白氨基端(MN-2Y)和羧基端(MC-2Y)鐵結合缺陷型變體的pH依賴型59Fe釋放結果。對59Fe飽和的重組人乳鐵蛋白(Rec hLF)、MN-2Y和MC-2Y用pH范圍為7-2的緩沖液透析。用液體閃爍計數法測定與樣品結合的59Fe量，確定Fe/蛋白質的摩爾比。數據用均值±標準差表示。
Ⅴ定義本文所用的術語大都與本領域中通常采用的一致。本文中所用的下列術語有下列通用含義術語“乳鐵蛋白變體”指天然存在的乳鐵蛋白在至少一個氨基酸位置上發(fā)生突變而生成的多肽。
術語“載體”指質粒、粘粒、噬菌體、病毒、逆轉錄病毒或其它用來插入、增殖和/或表達編碼乳鐵蛋白變體或其部分的核酸的載體。
術語“宿主細胞”指可以使乳鐵蛋白表達的任何細胞。
術語“啟動子”指控制乳鐵蛋白cDNA轉錄的調控DNA序列。
術語“轉化”指插入細胞使得細胞能表達異源核酸序列。
術語“鐵結合性能”指與Fe結合的能力。功能齊全的人乳鐵蛋白每分子乳鐵蛋白可結合兩分子鐵原子。
術語“生物活性/有生物活性”指乳鐵蛋白的生物活性，根據它與鐵結合的能力、殺死微生物、或阻抑微生物生長的能力，或鐵轉運蛋白功能來衡量。
Ⅵ發(fā)明詳述A綜述本發(fā)明的基礎部分在于確定了乳鐵蛋白多肽中對蛋白鐵結合性能有作用的那些結構功能域、序列和結構。因此，本發(fā)明提供指南來生產性能有所改進的乳鐵蛋白變體，這些改進的性能例如有變化的鐵結合性質(如增強或減弱的鐵結合能力)、或改變鐵結合的pH或溫度需求或范圍。而且，本發(fā)明還提供指南來設計有其它改進性質(如在保持鐵結合活性的同時有治療耐受性、抗降解穩(wěn)定性或免疫反應性)的乳鐵蛋白變體。
因此，本發(fā)明涉及編碼乳鐵蛋白變體及其部分的重組核酸，以及包含所述重組核酸的載體。本發(fā)明還涉及制備該載體以及包含該載體的轉染細胞的方法。另外也提供了在各種真核細胞或原核細胞中生產乳鐵蛋白變體及其部分的方法。最后，本發(fā)明涉及本發(fā)明的核酸編碼的和/或用本發(fā)明的方法生產的乳鐵蛋白變體及其部分。因此本發(fā)明提供了指南來設計性能改進的乳鐵蛋白變體或其部分，并提供了一種經濟而有效的生產這些乳鐵蛋白變體及其部分的方法。
B乳鐵蛋白的雙葉結構對其特有的鐵結合性能的作用在本發(fā)明中，用定點誘變方法來研究乳鐵蛋白的雙葉結構對該蛋白特有的鐵結合性能的作用。
更具體地是，為生成三種鐵結合缺陷型變體，使乳鐵蛋白一葉或兩葉結構中參與鐵結合的兩個酪氨酸突變成相應的丙氨酸殘基。如以前關于野生型蛋白的描述，使這些乳鐵蛋白變體在泡盛曲霉中表達并純化。美國專利No.5,571,896；Ward等，1995,Biotechnology13:498-503。用銀染法、Western免疫印跡法和腸受體結合測定法對這些乳鐵蛋白變體的大小、免疫反應性和功能活性進行測定，結果與野生型重組人乳鐵蛋白相似，這表明氨基酸的取代對蛋白質沒有不利影響。用59FeCl3的鐵飽和分析表明，當羧基端鐵結合葉結構完整的乳鐵蛋白變體以預計的1∶1(鐵∶蛋白質)比值飽和時，但是氨基端鐵結合功能完整的變體的飽和比值始終低于1∶1，這表明該乳鐵蛋白變體在pH7.0下的鐵結合穩(wěn)定性有所降低。另外，鐵結合的研究證明，兩葉中酪氨酸殘基的突變均有效地破壞了整個蛋白質的鐵結合性能。參見Ⅶ.A.,Ⅶ.C.和Ⅶ.D.。
如本文所公開的，對非突變的葉的pH依賴性鐵釋放研究表明，乳鐵蛋白的氨基端和羧基端葉結構的鐵結合穩(wěn)定性是不同的。羧基端鐵結合功能完整的乳鐵蛋白變體的鐵的釋放與天然乳鐵蛋白中所見相似。相反，氨基端鐵結合位點完整的乳鐵蛋白變體酸不穩(wěn)定性高得多，在pH7-5內會釋放出所有的結合鐵。因此，盡管這兩葉之間有總體結構同源性(40％)，但已證明，乳鐵蛋白的氨基端和羧基端葉在其鐵結合的pH穩(wěn)定性方面是不同的。另外，已經證明，需要有功能性鐵結合羧基端葉才能使氨基端葉具有鐵結合穩(wěn)定性，這是野生型蛋白質所特有的。
乳鐵蛋白氨基端和羧基端葉的鐵結合不等價性以前已有描述。Mazuier等，1989,Biochem.Biophys.Acta.629:399-408；Day等，1992,J.Biol.Chem.167:13857-13862；Shimazaki等，1993,J.Dairy Sci.76:946-955。用克隆的人乳鐵蛋白氨基端片段(Day等，1992,J.Biol.chem.167:13857-13862)和對牛乳鐵蛋白用蛋白酶解獲得的羧基端片段(Shimazaki等，1993,J.Dairy Sci.76:946-955)的研究表明，如同本發(fā)明所報道的，在鐵結合pH依賴性方面呈現相似的差異。然而，由于以前的報道沒有指出羧基端或其部分是氨基端葉結構鐵結合功能穩(wěn)定化所必需的，因此這些研究是有局限性的，它們仍有待來確定羧基端葉的結構存在或功能性羧基端鐵結合活性是否是氨基端葉結構鐵結合性能穩(wěn)定化所必需的。本發(fā)明延伸了這些研究，并且證明兩葉間的相互協同作用(主要是由功能性羧基端葉結構引起)是鐵結合穩(wěn)定化所必需的。
在運鐵蛋白家族的進化中雙葉結構的選擇偏性是未知的。本公開為乳鐵蛋白的這種選擇提供了功能上的合理解釋。因此，本發(fā)明表明兩葉結構的進化賦予了乳鐵蛋白特有的鐵結合性能，該性能成為該蛋白特有的功能活性。有趣的是，運鐵蛋白與乳鐵蛋白不同，因為已經證明，運鐵蛋白的pH依賴型鐵釋放性能和蛋白酶解衍生獲得的氨基端片段的性能相似。Mazuier等，1989,Biochem.Biophys.Acta.629:399-408；Lineback-Zins等，1980,J.Biol.Chem.255:708-713。這些發(fā)現可以說明，運鐵蛋白兩葉之間缺少協同性可能是導致該蛋白質鐵結合穩(wěn)定性較弱的一個關鍵因素。將上述研究結合起來，認為乳鐵蛋白和運鐵蛋白鐵結合性能的差別可能是由于(或至少部分由于)乳鐵蛋白的羧基端鐵結合葉的進化增強了酸穩(wěn)定性，并且與氨基端葉的協同賦予了氨基端葉pH穩(wěn)定性，這是雙葉結構蛋白質的特性。
C乳鐵蛋白變體根據對乳鐵蛋白多肽中對該蛋白鐵結合性能有作用的那些結構域、序列和結構的鑒定，本發(fā)明提供指南來設計并生產新的鐵結合能力改進的乳鐵蛋白變體或其部分。本發(fā)明的性能改進的乳鐵蛋白變體通常包括，但不局限于，對鐵的親和力較高、抗微生物活性改進的乳鐵蛋白變體；對鐵親和力較低、鐵釋放性能改進的乳鐵蛋白變體；或鐵結合和/或釋放時對pH或溫度需求或范圍有所改變的乳鐵蛋白變體。另外，本發(fā)明還可以設計有其它改進性能(如在保持鐵結合能力的同時有治療耐受性、生物半衰期長或免疫反應性)的乳鐵蛋白變體。
本發(fā)明的乳鐵蛋白變體可從各類哺乳動物的野生型乳鐵蛋白衍生獲得，這些野生型乳鐵蛋白包括，但不局限于，人、小鼠、大鼠、牛和豬的乳鐵蛋白。野生型乳鐵蛋白可用本領域通常已知的各種方法來進行突變。參見其它文獻，Sambrook等，1990,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarbourLaboratory Press,New York；Kunkel等，1987,Meth.Enzymol.154:367-382；Kunkel,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492。
在一個較佳的實例中，乳鐵蛋白變體包含至少一個突變，該突變對至少一個鐵結合位點有影響。與野生型乳鐵蛋白相比，該鐵結合位點的鐵結合性能可能有變化。例如，對鐵的親和力可以增加或減少。另外，對鐵的親和性會表現出pH范圍特性的改變?；蛘撸F結合位點的改變可使得乳鐵蛋白變體或其部分完全不與鐵結合。
在另一個實例中，乳鐵蛋白變體包括至少一個突變，該突變影響乳鐵蛋白的治療耐受性、生物穩(wěn)定性或免疫耐受性，而仍保留其生物活性。
D乳鐵蛋白變體的表達和產生編碼乳鐵蛋白變體的本發(fā)明的核酸序列可插入一個適合在真核細胞中表達的載體，從而使得乳鐵蛋白變體表達?；蛘撸幋a本發(fā)明乳鐵蛋白變體一部分的核酸序列可插入載體，使它們在真核細胞中表達。較佳的，乳鐵蛋白變體的此部分應至少包含一個經過修飾的鐵結合位點。
在較佳的實例中，乳鐵蛋白是在重組表達系統中制得的。參見其它文獻，Ward等，1992,Biotechnology 10:784-789；Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。出于此目的，可將編碼所需乳鐵蛋白形式的核酸(參見例如美國專利5,571,691，其內容全部結合入本文作參考)表達型摻入細胞宿主中，然后在適于該特定肽或蛋白質表達的條件下進行培育。用各種基因表達系統實現該目的，通常是靠所選宿主細胞天然自用的表達控制來表達所需的基因。
由于本發(fā)明的乳鐵蛋白變體與天然存在的乳鐵蛋白一樣，需要進行翻譯后的修飾(如在幾個氨基酸殘基上糖基化)，因此大多數乳鐵蛋白變體或其部分需要在真核宿主中生產。在較佳的實例中，乳鐵蛋白產物由曲霉屬表達體系生產，如Ward等，1992,Gene,122:219-223；美國專利No.5,571,896和5,571,697中所述，這些文獻的內容均結合入本文作參考。
如果要生成非糖基化形式的乳鐵蛋白變體或其部分，那么它們的生產可方便地在細菌宿主(如大腸桿菌)中實現。對于這種生產，編碼所選乳鐵蛋白變體或其部分的核酸可放在表達控制系統(如大腸桿菌的lac、trp或PL基因)后。
另一種表達編碼乳鐵蛋白變體或其部分核酸的方法是，使宿主以融合蛋白形式表達乳鐵蛋白產物，該融合蛋白中乳鐵蛋白產物以可釋放形式與便于表達產物分離和穩(wěn)定的載體蛋白連接。
還有一種方法是，可用有機合成方法來生成乳鐵蛋白變體或其部分。特別當打算生產乳鐵蛋白變體的部分(如約20-50個氨基酸長度的肽)時，宜采用已經建立的自動化肽合成技術，這些技術在下列文獻中有所描述例如J.M.Stewart和J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Edition,1984,Pierce chemicalCompany,Rochford,Illinois；M.Bodanszky和A.Bodanszky,The Practice of PeptideSynthesis,1984,Springer-Verlag,New York；Applied Biosystems 430A UsersManual,1987,ABI Inc.,Foster City,California；Solid Phase Peptide Synthesis-APractical Approach,by:E.Atherton&R.C.Sheppard,IRL Press,Oxford(1989)。在這些技術中，乳鐵蛋白變體蛋白質從其C端開始生長，然后采用Fmoc或tBoc方案依次加入適當的保護氨基酸來形成與樹脂交聯的殘基。
E應用本發(fā)明的乳鐵蛋白變體可用于各類應用。
例如，鐵結合能力改進的乳鐵蛋白變體或其部分可用于抗微生物應用，包括治療感染、作為人或動物食品中的添加劑、滴眼藥、滴耳藥、接觸眼晶狀體和其它眼科保健液、表皮護理產品、漱口劑、口香糖和牙膏中的添加劑。
pH或溫度需求改變的乳鐵蛋白變體或其部分也可用于上述應用。它們還可用作增強或改變鐵輸送傳遞的治療添加劑。
乳鐵蛋白變體和其部分的其它應用包括治療炎性皮膚疾病，如待審查臨時申請(代理案卷號8206-041-88,1997年4月1日提交)中所述的，其內容全部結合入本文作參考。
對于上述許多應用只應理解為本發(fā)明作的列舉，具有改進的治療耐受性、改變的生物穩(wěn)定性或免疫耐受性的乳鐵蛋白變體和其部分是特別佳的例子。
F藥物配方和給藥途徑對于治療用途，所選的乳鐵蛋白變體或其部分可作為單獨的治療劑，或治療劑組合，以常規(guī)方法聯同其它藥物給藥。它可以單獨給藥，但是通常是與藥物載體一同給藥，該載體根據所選的給藥途徑和標準藥物服用方法來選擇。本發(fā)明的藥物組合物可以口服、非腸胃給藥、表皮給藥或直腸給藥，或是作為吸入劑，并且可以單位劑量形式和藥學領域技術人員熟知的方式來進行給藥。非腸胃給藥包括，但不局限于，皮下注射、靜脈注射、腹腔內注射或肌內注射。
可在待治療疾病(如感染或皮膚病(牛皮癬、接觸性皮炎等))明確后任何時刻用活性組分進行治療?？梢栽\斷UV引起的炎癥、嬰兒尿布皮疹、哮喘、關節(jié)炎等。治療最好是預防性的或是在疾病早期進行，首先防止大范圍感染或發(fā)炎。治療通常將持續(xù)到疾病痊愈。慢性疾病如牛皮癬、哮喘或關節(jié)炎，或持續(xù)暴露在過敏原下時，可能需要在癥狀痊愈后繼續(xù)治療一段時間。
當然，給藥的劑量將根據已知的因素而不同，這些因素例如是(1)具體乳鐵蛋白產品的藥物動力學特征及其給藥方式和途徑；(2)接受者的年齡、健康狀況、身高和體重；(3)癥狀的性質和程度；(4)同時采用的治療的類型；(5)治療的頻率和(6)所希望的效果。該領域技術人員可根據上述因素來決定活性組分的日常劑量。
活性組分可表面給藥，用作吸入劑，或注射入發(fā)炎的關節(jié)或軟骨中。然而，乳鐵蛋白變體還可以固體或半固體藥劑形式(如硬的或軟的明膠膠囊、片劑或粉劑)或液體藥劑形式(如酏劑、糖漿或懸浮劑)口服。它也可以無菌液體藥劑形式進行非腸胃給藥。其它藥劑形式如補片、軟膏或透皮給藥也是可行的。
本發(fā)明的乳鐵蛋白變體也可配制成緩釋放的植入材料來延長和維持乳鐵蛋白產品的給藥。這些緩釋配方包括生物相容性聚合物組分，如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纖維素、透明質酸、膠原等。在幾篇出版物(包括A.Domb等，Polymers for Advanced Technologies 3:279-292,1992)中評述了在藥物運載體中可降解聚合物的結構、選擇及其應用。在M.Chasin和R.Langer(eds.)＂Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems,＂Vol.45 of＂Drugs and thePharmaceutical Science,＂M.Dekker,New York.1990的文章中可發(fā)現在藥物配方中選擇和使用聚合物的其它指南。也可用脂質體來提供乳鐵蛋白變體或其部分的緩釋。關于怎樣使用和制備感興趣的脂質體藥物配方的詳細情況在其它文獻中有所描述，它們包括美國專利No.4,944,948；5,008,050；4,921,706；4,927,637；4,452,747；4,016,100；4,311,712；4,370,349；4,372,949；4,529,561；5,009,956；4,752,442；4,737,323；4,920,016。當需要提供局部(如在關節(jié)炎的關節(jié)處，或在局部皮膚發(fā)炎處等)高濃度乳鐵蛋白變體時，緩釋配方是特別佳的。
明膠膠囊或液體填充的軟明膠膠囊可以含有活性組分和粉末載體或液體載體(如乳糖、卵磷脂淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸煤、硬脂酸等)?？捎妙愃频南♂寗﹣碇瞥蓧撼尚推瑒?。片劑和膠囊均可制成緩釋產品，以在幾個小時內持續(xù)釋放藥劑。壓縮片劑可用糖衣包裹或用薄膜包裹以遮蓋令人討厭的味道并使片劑與空氣隔開，或包有腸溶衣使其選擇性地在腸胃道中消化?？诜o藥的液體藥劑形式可含有著色劑和/或調味劑，以使患者能夠接受。
合適的藥物載體還在Remington′s Pharmaceutical Scienes,17th ed.,MackPublishing Company,Easton,PA(1990)中有所描述，該文是該領域內標準的參考文獻，其內容全部結合入本文作參考。
下述實施例將更詳細地描述本發(fā)明。下列制備方法和實施例的給出是為了使本領域技術人員更清楚地了解并實施本發(fā)明。然而，應當理解，列舉的實例只是用來描述本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明不局限于列舉實例的范圍，而功能上等價的方法均包括在本發(fā)明范圍內。實際上，除了本文所述的那些以外，本發(fā)明的各類變化對于本領域技術人員來說顯然可以從前述描述及附圖明顯得出。這些變化均認為是落在本文所附權利要求的范圍內。
Ⅶ實施例A材料和方法通用泡盛曲霉表達載體pPLF-26的構建。用于在泡盛曲霉中生產乳鐵蛋白的表達載體pPLF-19的構建已有描述。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503；美國專利No.5,571,896。為了構建含有編碼乳鐵蛋白變體的克隆化cDNA上特有位點的表達載體，先制成pPLF-26。簡要地說，用SphⅠ消化pPLF-18(Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503)，生成3.3kb和4.4kb兩個片段。將含有乳鐵蛋白cDNA的3.3kb SphⅠ片段亞克隆入SphⅠ消化的pALTER(Promega,Madison,WI)中，生成pLF18sp.Alt。將4.4kb SphⅠ片段重新連接生成PR18.2。用商業(yè)上購得的pALTER試劑盒(Promega,Madison,WI)進行體外誘變，在pLF18Sp.Alt的成熟乳鐵蛋白cDNA起始處引入NotⅠ限制性酶位點，生成pNot.9。用于誘變的5′磷酸化寡核苷酸如下5′AGCGC GGCCG CAGGA GAAGGA 3′[SEQ ID NO:1]。用EcoRⅠ消化PR18.2，得到的兩個片段用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段修復，并以正確方向再聯接。獲得的pΔE12用SphⅠ消化，并與pNot.9的3.3kb SphⅠ片段連接，生成pPLF-25。用EcoRⅠ消化PL03(在β-微管蛋白啟動子控制下可編碼腐草霉素抗性基因)(Gatignol等，1987,Mol.Gen.Gener.207:342-348)，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段修復獲得的片段，并以正確定向再連接。用HindⅢ消化獲得的載體PLO3ΔR1，將得到的2.3kb片段亞克隆入HindⅢ消化的pPLF-25中與乳鐵蛋白cDNA相同的定向，生成pPLF-26。
鐵結合缺陷型乳鐵蛋白變體MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y的構建。合成有5′EcoRⅠ/BamHⅠ末端的5′磷酸化寡核苷酸，以便將NotⅠ位點引入pALTER中。寡核苷酸的序列如下。頂鏈5′GATCCA TGCGG CCGCATG 3′[SEQ ID NO:2]。底鏈5′AATTCA TGCGG CCGCATG 3′[SEQ ID NO:3]。使該寡核苷酸退火連接到EocRⅠ/BamHⅠ消化的pALTER上，生成pALTLink。用NotⅠ/EcorⅠ消化pPLF-26，將獲得的含人乳鐵蛋白cDNA的2.1kb片段亞克隆入NotⅠ/EocRⅠ消化的pALTLINK中。將獲得的質粒pALThLF用于后續(xù)誘變實驗。用pALTER試劑盒進行體外誘變，將乳鐵蛋白氨基端葉(Tyr93、Tyr193)、羧基端葉(Tyr436、Tyr529)、以及氨基端和羧基端葉結構中參與鐵結合的酪氨酸殘基(Tyr93、Tyr193、Tyr436和Tyr529)變成相應的丙氨酸殘基。用于誘變的5′磷酸化寡核苷酸如下Tyr93-Ala93:5′CACAG CCACG GCATA AGCGT GAGTT CGTG GCTG 3′[SEQ ID NO:4]Tyr193-Ala193:5′CTTGAA GGCACC AGAGG CGCTG AAGTA CGGTTC 3′[SEQ ID NO:5]Tyr436-Ala436:5′CACCGCC ACAGCA AGGGC TCCTT CCACA GGTCT 3′[SEQ ID NO:6]Tyr529-Ala529:5′CCGGAAA GCCCCA GTGGC GCCGT AGTAT CTCTC 3′[SEQ ID NO:7]用NotⅠ/EcoRⅠ消化獲得的質粒pALTMN-2Y、pALTMC-2Y和pALTMNC-4Y，并亞克隆入NotⅠ/EcoRⅠ消化的pPLF-26中，生成適于在曲霉屬真菌細胞中表達的質粒即分別為p26MN-2Y、p26MC-2Y和p26MNC-4Y。用市售的Sequenase Version2.0試劑盒(United States Biochemical Corporation,Cleveland OH)對所有的寡核苷酸序列和構建物接頭進行測序。
MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y的表達和純化。將泡盛曲霉表達載體p26MN-2Y、p26MC-2Y和p26MNC-4Y轉化入泡盛曲霉中，使獲得的轉化體如已有文獻所述培育7天。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。用ELISA測定法篩選培養(yǎng)基中的鐵結合變體。Vilja等，1985,J.Immunol.Meth.76:73-83。陽性培養(yǎng)物(＞50mg/l)在2升搖瓶中培育7天，用CM-sephadex離子交換層析純化乳鐵蛋白變體。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。用0.1M檸檬酸對此蛋白質進行透析，然后再以H2O和5mM,pH7.5的磷酸鈉(3g)進行大量透析。
受體結合測定法。用生物素/親和素微量滴定平板測定法(Rejman等，1994,Int.J.Biochem.26:201-206)進行受體結合測定法，方法基本如文獻中所述的，采用8天齡Caco-2增溶膜(300ng)。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。
乳鐵蛋白變體的鐵飽和性和鐵結合的pH穩(wěn)定性。使MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y(5mg)與4倍過量的FeCl3∶59FeCl3∶NTA(400∶1∶8)共育。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。樣品室溫培育30分鐘。使樣品通過NAP-10柱(Pharmaica,Piscataway,NJ)進行純化，然后用0.05M Tris/HCl、0.2M NaCl、pH7.0透析12小時，除去與乳鐵蛋白變體非特異性結合的鐵。用液體閃爍計數法對透析后與乳鐵蛋白變體結合的鐵進行定量分析。每個乳鐵蛋白變體的鐵結合pH穩(wěn)定性的測定如前所述。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。
B實施例1乳鐵蛋白氨基和羧基端結構域中鐵結合缺陷型變體的表達和純化為了測定兩個結構域的結構對乳鐵蛋白特有的鐵結合性能的作用，采用定點誘變方法在人乳鐵蛋白cDNA中產生突變，使cDNA編碼的蛋白質的一葉或兩葉缺失鐵結合能力。
具體說，使Tyr93、Tyr193突變成Ala93、Ala193，從而生成乳鐵蛋白氨基端一半不能結合鐵的一個變體(MN-2Y)。乳鐵蛋白羧基端一半相應的酪氨酸殘基Tyr436、Tyr529變成丙氨酸殘基，致使羧基端結構域失去鐵結合功能(MC-2Y)。乳鐵蛋白中所有參與鐵結合的四個酪氨酸殘基(即Tyr93、Tyr193、Tyr436和Tyr529)都突變成相應的丙氨酸殘基，生成乳鐵蛋白的兩葉均不能結合鐵的一個變體(MNC-4Y)。
如重組人乳鐵蛋白中所述，在泡盛曲霉中表達這些乳鐵蛋白并純化。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503，美國專利No.5,571,896。對純化蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后作weastern免疫印跡分析或銀染分析。參見圖1。采用抗人乳鐵蛋白的特異性多克隆IgG的western免疫印跡分析檢測到，三種乳鐵蛋白變體各自在對應于野生型重組乳鐵蛋白分子大小處有免疫反應條帶，如圖1A中泳道1-4所示。對兩份凝膠進行銀染分析，結果表明這些乳鐵蛋白變體純度在95％以上，每種蛋白質在預計分子量80kDa處見有單一條帶。參見圖1B泳道1-4。因此，乳鐵蛋白變體的大小和免疫反應性與野生型重組乳鐵蛋白沒有區(qū)別。
C實施例2鐵結合缺陷型乳鐵蛋白變體有著與野生型重組人乳鐵蛋白相似的腸受體結合性能根據丙氨酸和酪氨酸的相似性，可以推定，鐵結合乳鐵蛋白變體中從酪氨酸到丙氨酸的單氨基酸取代只會引起很小的蛋白質結構變化。因此，鐵結合缺陷型變體除鐵結合性能外的活性，應當與野生型重組人乳鐵蛋白的活性相似。申請人以及其它研究者以前就已經指出，在人腸細胞中有特異性和可飽和的鐵飽和乳鐵蛋白受體存在。Iyer等，1993,Eur.J.Clin.Nutr.47:232-241；Cox等，1979,Biochem.Biophys.Acta.558:129-141；Hu等，1988,Biochem.J.249:435-441；Gislason等，1995,J.Pediatr.Gastroent,Nutr.21:37-43；Mikogmi等，1994,Am.J.Physiol.267:G1-G8；Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。因此，用競爭性受體結合測定乳鐵蛋白變體的先決條件是必須先建立不含鐵的重組乳鐵蛋白對鐵飽和重組乳鐵蛋白的相對受體結合動力學實驗方法。
競爭性受體結合測定法如已有文獻所述進行。Ward等，1995,Biotechnology13:498-503。在0-20倍摩爾過量的未標記的脫輔基或鐵飽和重組人乳鐵蛋白存在下，使生物素化鐵飽和重組人乳鐵蛋白(0.4μM)與人腸Caco-2細胞膜一起培育，并進行生物素/親和素微量滴定試驗。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。該測定結果見圖2A。令人驚奇的是，脫輔基的和鐵飽和的乳鐵蛋白均表現出相同的代替生物素化鐵飽和乳鐵蛋白與人腸Caco-2細胞膜結合的能力，這表明兩種形式的乳鐵蛋白與乳鐵蛋白腸受體的親和性是相似的。曾經提出過乳鐵蛋白通過這些受體將鐵輸送給腸細胞，但是不含鐵和鐵飽和的乳鐵蛋白這種相似的對相應受體結合的親和性提示，乳鐵蛋白通過這些受體輸送鐵的能力主要取決于腸腔內鐵飽和的與不含鐵的乳鐵蛋白的相對量。
在確定了脫輔基乳鐵蛋白對其腸受體的親和性之后，如上所述進行乳鐵蛋白變體的競爭性受體結合測定法，與野生型乳鐵蛋白比較它們的功能活性。該分析結果見圖2B、2C和2D。所有三個鐵結合缺陷型變體在特異性抑制無鐵生物素化乳鐵蛋白與Coao-2膜結合能力上，與野生型蛋白相比沒有明顯區(qū)別(＜2倍差)。這些結果表明，酪氨酸殘基的突變不破壞該蛋白的鐵非依賴型受體結合功能活性。
D實施例3乳鐵蛋白氨基和羧基端葉結構中參與鐵結合的酪氨酸殘基突變將選擇性地破壞蛋白突變葉的鐵結合性能為了確認乳鐵蛋白一或兩葉中的兩個酪氨酸殘基突變足以破壞突變葉結構的鐵結合能力，用59FeCl3進行鐵飽和分析。
分析結果如圖3所示。在4倍過量的鐵存在下，野生型重組乳鐵蛋白如預計的那樣在鐵/蛋白質摩爾比為2∶0時飽和。當羧基端鐵結合功能完整的MN-2Y在摩爾比1∶1處飽和時，氨基端完整的MN-2Y在摩爾比低于1∶1處飽和，這表明在pH7.0時，該乳鐵蛋白變體可能損失一些鐵。因此，乳鐵蛋白氨基端或羧基端各半中參與鐵結合的酪氨酸殘基的破壞只選擇性地破壞突變葉的鐵結合能力。另外，該分析的結果表明，乳鐵蛋白中參與鐵結合的所有四個酪氨酸殘基的突變會有效地消除該蛋白質的鐵結合能力。
E實施例4乳鐵蛋白的氨基端和羧基端葉結構之間的協同性對該蛋白質特有的鐵結合穩(wěn)定性有作用經分子大小、免疫反應性和受體結合分析測定，確定鐵結合缺陷型乳鐵蛋白變體與野生型重組乳鐵蛋白相似后，分析這些乳鐵蛋白變體的pH依賴型鐵釋放情況，以確定兩葉結構對乳鐵蛋白的鐵結合穩(wěn)定性的作用。
用59FeCl3使乳鐵蛋白變體飽和，并用pH7-2的緩沖液、4℃對其透析48小時。用液體閃爍計數法測定仍與乳鐵蛋白變體結合的鐵的量。該分析結果見圖4。含有完整羧基端鐵結合葉的MN-2Y的鐵釋放曲線與重組乳鐵蛋白的鐵釋放曲線相似(鐵釋放在pH5.0時開始，在pH2.0時結束)。相反，含有完整氨基端鐵結合葉的MC-2Y的pH依賴性鐵釋放是明顯不同的。該變體的鐵釋放在pH7.0時開始，這與MC-2Y低于1∶1鐵飽和度一致(圖4)。另外，MC-2Y的鐵釋放在pH5.0時結束。這些結果表明，乳鐵蛋白的氨基端葉和羧基端葉結構在鐵結合pH穩(wěn)定性上不同的，而野生型蛋白質的特點是需要有功能性鐵結合羧基端來賦予氨基端結構域增強的pH穩(wěn)定性。根據這些結論，可以得出結論，即乳鐵蛋白的兩個半部之間的相互協同作用(主要由羧基端葉驅動)形成了該蛋白質特有的鐵結合pH穩(wěn)定性。
本說明書中引用的所有的文獻均結合入本文作為參考。
權利要求
1．一個編碼乳鐵蛋白變體或其部分的核酸序列，其中所述部分包括乳鐵蛋白至少一個鐵結合位點的對應序列，且其中乳鐵蛋白變體或其部分有改進的鐵結合性能。
2．一個編碼選自MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y的乳鐵蛋白變體的核酸序列。
3．一個重組載體，該載體包括(a)一個啟動子；(b)權利要求1所述的編碼乳鐵蛋白變體或其部分的DNA；和(c)轉錄和翻譯起始和終止序列；其中所述載體可生產乳鐵蛋白變體并以加工蛋白形式表達乳鐵蛋白變體。
4．一種適合在真核細胞中表達乳鐵蛋白變體或其部分的載體，其中所述載體包括權利要求1所述的編碼乳鐵蛋白變體或其部分的DNA，以及所述DNA在所述細胞中表達所必需的調控元件。
5．一個載體，該載體包括(a)權利要求1所述的編碼乳鐵蛋白變體或其部分的核酸；和(b)一個啟動子，以及轉錄和翻譯的起始和終止序列；其中所述載體用來在真核細胞中表達人乳鐵蛋白。
6．一個選自p26MN-2Y、p26MC-2Y和p26MNC-4Y的載體。
7．一種包含權利要求5所述的載體的轉化的真核細胞。
8．根據權利要求7所述的真核細胞，其中所述細胞選自真菌、哺乳動物和昆蟲細胞。
9．根據權利要求8所述的真核細胞，其中所述真核細胞是選自米曲霉、黑曲霉、構巢曲霉和泡盛曲霉的真菌細胞。
10．一種包含權利要求6所述的載體的轉化的真核細胞。
11．根據權利要求10所述的真核細胞，其中所述細胞選自真菌、哺乳動物和昆蟲細胞。
12．根據權利要求11所述的真核細胞，其中所述真核細胞是選自米曲霉、黑曲霉、構巢曲霉和泡盛曲霉的真菌細胞。
13．一種制備權利要求1所述的乳鐵蛋白變體或其部分的方法，該方法包括下列步驟(a)用含有ⅰ)權利要求1所述的核酸；和ⅱ)一個啟動子，以及轉錄和翻譯起始和終止序列的載體轉化真核細胞，其中所述載體適合在真核細胞中表達乳鐵蛋白變體或其部分；和(b)在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培育所述轉化的真核細胞，直至生成乳鐵蛋白變體蛋白分泌入營養(yǎng)培養(yǎng)基中，然后將其從培養(yǎng)基中分離出來。
14．權利要求1所述的核酸編碼的乳鐵蛋白變體或其部分。
15．一種選自MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y的乳鐵蛋白變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼鐵結合能力改進的乳鐵蛋白變體或其部分的重組核酸以及包含所述重組核酸的載體。本發(fā)明還涉及生產這些載體以及含有這些載體的轉化細胞的方法。也提供在各種真核或原核細胞中生產乳鐵蛋白變體及其部分的方法。最后,本發(fā)明涉及由本發(fā)明核酸編碼、用本發(fā)明方法生產的乳鐵蛋白及其變體。因此,本發(fā)明提供一種經濟有效的生產重組乳鐵蛋白變體和其部分的方法。
文檔編號C07K14/79GK1224359SQ97196156
公開日1999年7月28日 申請日期1997年6月2日 優(yōu)先權日1997年6月2日
發(fā)明者O·M·康尼利, P·P·沃德 申請人:貝勒醫(yī)學院