專利名稱：一種從乳清液中分離乳鐵傳遞蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自于動(dòng)物的乳鐵傳遞蛋白的獲得方法，尤其是關(guān)于從乳清液中分離乳鐵傳遞蛋白的方法。
背景技術(shù)：
鐵傳遞蛋白族(Transferrins)是一組具有類似結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的糖蛋白質(zhì)。其類似性包括所有的鐵傳遞蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)都由單鏈多肽形成兩個(gè)相似但不均一鐵結(jié)合部位(一分子蛋白質(zhì)結(jié)合兩分子Fe3+)以及含有多聚糖(Glycan)以及它們分子量大約在76000-81000道爾頓的范圍內(nèi)。鐵傳遞蛋白廣泛地分布在脊椎動(dòng)物的生理液體和細(xì)胞中，例如乳汁、唾液、膽汁、胰液、眼淚和血漿等。
血清鐵傳遞蛋白(Serum Transferrin)、卵清鐵傳遞蛋白(Ovatransferrin)和乳鐵傳遞蛋白(Lactoferrin)是鐵傳遞蛋白族的主要成員。鐵傳遞蛋白最初被命名是因?yàn)槠湓阼F代謝中的傳遞和儲(chǔ)存功能。隨著近二十年來對(duì)鐵傳遞蛋白的廣泛研究，已發(fā)現(xiàn)了該蛋白具有除了結(jié)合鐵以外的多樣化結(jié)合能力以及除了傳遞鐵以外的多種生理或生物學(xué)功能。其中，人血清鐵傳遞蛋白、人乳和牛乳傳遞蛋白的氨基酸順序(一級(jí)結(jié)構(gòu))已確定。此外，乳鐵傳遞蛋白的完整立體結(jié)構(gòu)(高級(jí)結(jié)構(gòu))以及牛乳鐵傳遞蛋白重要部份的立體結(jié)構(gòu)也已確定。
眾所周知，用母(人)乳喂養(yǎng)的嬰兒更健康?；瘜W(xué)綜合分析表明母(人)乳中各種活性物質(zhì)的含量非常高，其中，人乳中的鐵傳遞蛋白質(zhì)是牛乳中的15倍。但商業(yè)的食用鐵傳遞蛋白制劑則只能來自牛乳。由于牛乳鐵傳遞蛋白殘留在奶酪或干酪生產(chǎn)后的乳清廢液中，所以從乳清液中提取和純化這種蛋白質(zhì)的技術(shù)也成為研究的焦點(diǎn)。
近十幾年來，世界各地的實(shí)驗(yàn)室對(duì)乳鐵傳遞蛋白的功能，特別是生物功能進(jìn)行了廣泛的研究。使人感到迷惑不解的是該蛋白的生物學(xué)功能是如此之多樣化。許多新的功能正不斷地發(fā)現(xiàn)。表1歸納和羅列了那些該蛋白已被引例的生物學(xué)功能[徐躍(2000)，生物工程進(jìn)展，20卷，6期，34-42頁]。
表1乳鐵傳遞蛋白的生物學(xué)功能

基于乳鐵傳遞蛋白的生理和生物學(xué)功能，它的應(yīng)用范圍列于表2中。乳鐵傳遞蛋白在保健品或功能食品范圍內(nèi)的應(yīng)用前景非常光明。目前，乳鐵傳遞蛋白主要用于嬰兒食品，其次的使用范圍將會(huì)是滋補(bǔ)品，化妝品(特別是防曬和處理青春痘)和飼料添加劑(例如，用于防豬腹泄)。
表2乳鐵傳遞蛋白預(yù)期的應(yīng)用范圍

有關(guān)乳鐵傳遞蛋白的分離方法，常用的主要包含兩大類方法即膜分離和色層分離技術(shù)。膜分離技術(shù)是當(dāng)今廣受重視和采用的一項(xiàng)新技術(shù)。根據(jù)膜孔徑大小，分離技術(shù)又可分為微過濾(Microfiltration，0.1-10μm)、超過濾(Ultrafiltration，5-400nm)、毫微過濾(Nanofiltration，1-5nm)和反滲透(Reverseosmosis，0.1-1nm)。在食品和生物工程領(lǐng)域中，超過濾主要用于不同分子量蛋白質(zhì)之間和蛋白質(zhì)與其他小分子之間的分離。乳鐵傳遞蛋白的分子量已知為8萬道爾頓，所以用分子量截留值為5-8萬道爾頓的超濾膜[N.Kothe et al，US Patent 4,644,056，(1987)]，或截留值為1萬和5萬道爾頓的超濾膜兩次分離[GH.Scott & DO Lucas，US Patent 4,834,974(1989)]可以將乳清液中的乳鐵傳遞蛋白與其他低分子量蛋白質(zhì)、乳糖和無機(jī)鹽分開。然而，膜分離技術(shù)的選擇性較低，所以用該方法只能得到低純度的蛋白制劑。
如要制備高純度的乳鐵傳遞蛋白，就需使用色層分離。現(xiàn)階段，可以有效地分離乳鐵傳遞蛋白的色層分離技術(shù)是陽離子交換層析。由于乳鐵傳遞蛋白的等電點(diǎn)為pH8.0左右，所以當(dāng)把環(huán)境pH調(diào)到低于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電而能吸附到陽離子交換劑上。陽離子交換劑的活性基團(tuán)大多使用弱酸型，即羧甲基(-OCH2COO-)；也可使用強(qiáng)酸型活性基團(tuán)像磺丙基(-CH2CH2CH2SO3-)，但羧甲基的分離效果更佳。離子交換劑的母體可以是交聯(lián)葡聚糖凝膠或纖維素。用羧甲基交聯(lián)葡聚糖凝膠樹酯從牛奶乳清液中提取乳鐵傳遞蛋白的得率為86％，分離的蛋白質(zhì)純度為95％。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，可用于分離乳鐵傳遞蛋白的層析分離技術(shù)包括銅螯合層析、凝膠層析、磷酸纖維素樹酯[Yoshida，S.and Xiuyun，Y.(1991)J.Dairy Sci.74，1439-1444；Dionysius，DA.et al，(1991)Aust.J.Dairy Technol.46，72-76；Shimazaki，K.andYoshimoto，Y.(1988)Japanese J.Dairy Food Sci.37，105；A1-Mashikhi，S.A.，etal.(1988)J.Dairy Sci.71，1747；A1-Mashikhi，S.A.and Nakai，S.(1987)J.DairySci.70，2486；Foley，AA.and Bates，GW.(1987)Anal.Biochem.162，296-300；Chen，JP and Wang，CH(1991)J.Food Sci.50，701-13.]。
然而，由于乳鐵傳遞蛋白在乳清中的含量很低(大約100-200毫克/升)，奶酪工廠日產(chǎn)乳清的量極大，一天數(shù)千噸屬中等規(guī)模。所以用色層分離技術(shù)直接處理如此大的液量成本很高。此外，乳清是制造乳清濃縮蛋白和乳糖的原料，當(dāng)乳清經(jīng)過色層分離柱處理后，將不可避免地影響這些產(chǎn)品的生產(chǎn)。
因此，一種低成本、低投資，快速和完整的生產(chǎn)工藝，用于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)高純度乳鐵傳遞蛋白的方法，是市場(chǎng)生產(chǎn)中期待已久待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種從乳清液中分離乳鐵傳遞蛋白的方法，該方法是使用一步磷酸鈣親和沉淀法將微量的乳鐵傳遞蛋白選擇性地從乳清液中預(yù)先沉淀分離。沉淀物用緩沖液或生理鹽水進(jìn)行抽提。抽提液或用分子量截留值為5萬道爾頓的超濾膜分離和濃縮后噴霧或冷凍干燥，可以制備乳鐵傳遞蛋白含量為40-50％的制劑，或?qū)⒊瑸V濃縮液上離子交換柱進(jìn)一步分離和純化，然后噴霧或冷凍干燥可以制備乳鐵傳遞蛋白含量達(dá)90-95％的制劑。
本發(fā)明從乳清液中分離乳鐵傳遞蛋白的工藝流程參見圖1。
本發(fā)明從乳清液中分離乳鐵傳遞蛋白的方法，包括下列步驟1、采用一步磷酸鈣親和沉淀法將乳鐵傳遞蛋白從乳清液中預(yù)先沉淀下來，沉淀物用離心機(jī)、板框壓濾機(jī)、真空過濾機(jī)或其它過濾機(jī)械分離。即在1升乳清液中加入1-80毫摩爾氧化鈣和1-10毫摩爾磷酸鈉，用NaOH將pH調(diào)節(jié)至6.0-7.5，攪拌，過濾得含乳鐵傳遞蛋白的磷酸鈣沉淀泥，經(jīng)噴霧或低溫真空干燥或冷凍干燥得沉淀粉，低溫-10℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。乳鐵傳遞蛋白從乳清液轉(zhuǎn)移至沉淀中的轉(zhuǎn)移率可達(dá)70-75％；2、將沉淀粉或含乳鐵傳遞蛋白的磷酸鈣沉淀泥用緩沖液或鹽水抽提，得含乳鐵傳遞蛋白的抽提液，抽提率可達(dá)85-96％，緩沖液濃度0.1-1摩爾/升，鹽水濃度0.5-5重量％，緩沖液或鹽水的pH值為6-8，沉淀物與所述濃度的緩沖液或鹽水用量的重量比為1∶5-10，抽提時(shí)間20-60分鐘，緩沖液可選自磷酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽緩沖液或它們的任意二種的混合物。
3、含乳鐵傳遞蛋白的抽提液用分子量截留值為5萬道爾頓的超濾膜分離，濃縮得濃縮液，濃縮液可直接噴霧或冷凍干燥，制得含量為40-50％的乳鐵傳遞蛋白粉產(chǎn)物?？偖a(chǎn)率為60-72％。
4、濃縮液也可用陽離子交換柱進(jìn)一步純化，采用常用的羧甲基陽離子交換柱或交聯(lián)葡聚糖凝膠樹脂的離子交換柱。又因乳鐵傳遞蛋白是堿性蛋白，在pH3.7時(shí)帶較強(qiáng)的正電荷，需用離子強(qiáng)度較高的洗脫液洗脫。純化后再噴霧或冷凍干燥，即制得含量為90-95％的乳鐵傳遞蛋白粉產(chǎn)物。總產(chǎn)率為57-65％。
有關(guān)鈣與乳鐵傳遞蛋白結(jié)合的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道(Y.Xu(2000)LactoferrinStructure，F(xiàn)unction and Applications，(edited by Shimazaki，KI et al.)，p.47-52，Elsevier，Amsterdam，New York)。鈣與乳鐵傳遞蛋白結(jié)合顯然是磷酸鈣與乳鐵傳遞蛋白共沉淀的基礎(chǔ)，本發(fā)明方法中乳鐵傳遞蛋白在pH調(diào)至6.0-7.5的情況下結(jié)合鈣，然而鈣與磷酸根形成磷酸鈣，最終形成乳鐵傳遞蛋白與磷酸鈣的共沉淀。(見圖2)。
將本發(fā)明磷酸鈣沉淀物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(見圖3)，圖3顯示磷酸鈣沉淀物含有一條與標(biāo)準(zhǔn)乳鐵傳遞蛋白分子量相等的蛋白質(zhì)譜帶，通過對(duì)沉淀物的鑒定證實(shí)了沉淀物中是含有乳鐵傳遞蛋白的。又將磷酸鈣沉淀物電泳進(jìn)行品紅試劑的染色(見圖4)，表明這條譜帶是糖蛋白。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白和標(biāo)準(zhǔn)乳過氧化酶的鑒定進(jìn)一步排除了是其他蛋白質(zhì)的可能性。
對(duì)該蛋白質(zhì)譜帶的氨基酸序列分析標(biāo)明從氨基末端起的10個(gè)氨基酸殘基是Ala-Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg-Trp-Cys-Thr，它們與文獻(xiàn)上(參見Pierce，A.等，Eur.J.Biochem，196，177-184，1991)報(bào)道的乳鐵傳遞蛋白相吻合。
又另外用標(biāo)準(zhǔn)乳鐵傳遞蛋白的溶液進(jìn)行磷酸鈣共沉淀反應(yīng)后，得到的標(biāo)準(zhǔn)乳鐵傳遞蛋白的磷酸鈣沉淀物與沉淀物分離后的上清液進(jìn)行電泳分析(見圖5)，表明蛋白質(zhì)譜帶從溶液中已轉(zhuǎn)移至沉淀物中。以上這些實(shí)驗(yàn)清楚地證明磷酸鈣可以有效地將乳鐵傳遞蛋白沉淀下來。
乳鐵傳遞蛋白的含量可以用凝膠電泳加掃描進(jìn)行定量。首先制備1毫克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)純?nèi)殍F傳遞蛋白溶液，將3微升的標(biāo)準(zhǔn)純?nèi)殍F傳遞蛋白溶液和8微升的本發(fā)明的樣品上凝膠電泳分離，然后凝膠上染色的標(biāo)準(zhǔn)和樣品的乳鐵傳遞蛋白質(zhì)譜帶用光密度計(jì)(使用600nm波長(zhǎng)，島津雙波長(zhǎng)TCL掃描儀CS910)掃描得到吸收峰面積，因標(biāo)準(zhǔn)的乳鐵傳遞蛋白濃度是1毫克/毫升，計(jì)算機(jī)根據(jù)吸收峰面積可自動(dòng)計(jì)算出樣品中乳鐵傳遞蛋白質(zhì)的含量。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)由于乳鐵傳遞蛋白在乳清中的含量極低，而乳清的處理量極大且易腐，本發(fā)明使用的一步磷酸鈣親和沉淀法可以將微量的乳鐵傳遞蛋白有選擇地和快速地從乳清中預(yù)先沉淀下來，這樣工廠中分離和提純的操作量瞬間減少150-200倍，也就是說使得為乳鐵傳遞蛋白后加工所需的超濾膜和離子交換設(shè)備的投資可大大減少。
本發(fā)明將易腐敗的乳清液體轉(zhuǎn)化成易儲(chǔ)藏的沉淀干粉。用這種含乳鐵傳遞蛋白的沉淀干粉作為原料生產(chǎn)蛋白制劑使工廠更易管理。也解決了尤其在夏天由于乳清易腐敗而引起的乳鐵傳遞蛋白制劑的得率和質(zhì)量容易波動(dòng)的問題。按需要，可生產(chǎn)含量為40-50％或高含量達(dá)90-95％的乳鐵傳遞蛋白產(chǎn)物。同時(shí)本發(fā)明方法也不影響乳清中的其他蛋白質(zhì)和乳糖及它們的生產(chǎn)工藝。因此本發(fā)明方法與目前已有的從乳清中分離獲得乳鐵傳遞蛋白的方法來比較，本法具有低成本、低投資，管理容易，快速和完整的生產(chǎn)工藝，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等特點(diǎn)，是適用于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)高純度乳鐵傳遞蛋白的方法。


圖1是本發(fā)明從乳清液中分離乳鐵傳遞蛋白的工藝流程2是磷酸鈣與乳鐵傳遞蛋白共沉淀的機(jī)理示意圖，圖中(A)乳鐵傳遞蛋白+鈣離子+磷酸根，pH6.0以下；(B)pH調(diào)至6.0-7.5，鈣離子首先通過結(jié)合使乳鐵傳遞蛋白形成四聯(lián)體，然后磷酸根與鈣鍵合；
(c)乳鐵傳遞蛋白-鈣離子-磷酸根鍵合形成復(fù)合物，最終沉淀。
圖3是本發(fā)明采用磷酸鈣親和沉淀法分離得的磷酸鈣沉淀物的電泳分析，圖中1本發(fā)明從乳清液中分離得到的磷酸鈣沉淀物；2標(biāo)準(zhǔn)乳鐵傳遞蛋白；3標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白；4乳清上清液；5標(biāo)準(zhǔn)乳過氧化酶。
MW分子量，Da道爾頓單位。
圖4是本發(fā)明采用磷酸鈣親和沉淀法分離得的磷酸鈣沉淀物電泳的品紅染色，圖中1標(biāo)準(zhǔn)乳過氧化酶；2本發(fā)明從乳清液中分離得到的磷酸鈣沉淀物；3標(biāo)準(zhǔn)乳鐵傳遞蛋白。
圖5是標(biāo)準(zhǔn)乳鐵傳遞蛋白的磷酸鈣沉淀物的電泳分析，圖中1標(biāo)準(zhǔn)乳鐵傳遞蛋白的磷酸鈣沉淀物；2沉淀物分離后的上清液。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 從乳清液中分離制備乳鐵傳遞蛋白來自奶酪工廠的切達(dá)干酪乳清液先用離心分離機(jī)脫脂。脫脂切達(dá)干酪乳清液中乳鐵傳遞蛋白含量為93毫克/升。在420升脫脂切達(dá)干酪乳清液中加入食用級(jí)的CaCl23.4公斤和NaH2PO4·2H2O 0.62公斤，然后邊攪拌邊用6當(dāng)量的氫氧化鈉將pH值調(diào)至7.5。攪拌5分鐘后，靜置10分鐘。懸浮液用液固離心機(jī)(或板框壓濾機(jī)，或轉(zhuǎn)鼓式真空過濾機(jī)或其他過濾機(jī)械)分離得到38.2公斤磷酸鈣沉淀泥。澄清液送入乳清蛋白和乳糖生產(chǎn)車間。沉淀泥用冷凍干燥(或低溫真空干燥，或加80公斤水后噴霧干燥)，得8.4公斤磷酸鈣沉淀粉(其電泳分析等鑒定見圖3和圖4)，低溫(-10℃)儲(chǔ)藏備用。每公斤沉淀粉含乳鐵傳遞蛋白3348毫克，乳清液中72％的乳鐵傳遞蛋白轉(zhuǎn)移至磷酸鈣沉淀中。8.4公斤磷酸鈣沉淀粉用84公斤pH6.0，0.5摩爾/升磷酸鈉緩沖液攪拌抽提20分鐘后過濾。每公斤抽提液含乳鐵傳遞蛋白319.7毫克，抽提得率95.5％。84公斤抽提液用分子量截留值為5萬道爾頓的超濾膜分離和濃縮10倍，然后在濃縮液中加80公斤水，第二次超濾和濃縮10倍。二次超濾可去除大量分子量低于5萬道爾頓雜蛋白和其他雜質(zhì)。8.4升濃縮液冷凍干燥后得63.94克乳鐵傳遞蛋白制劑，純度42％，總產(chǎn)率為68.8％。
實(shí)施例2 從乳清液中分離制備乳鐵傳遞蛋白生干酪乳清液中乳鐵傳遞蛋白含量為124.9毫克/升。在540升生干酪乳清液中加入CaCl24.5公斤和NaH2PO4·2H2O 0.8公斤，然后邊攪拌邊用6當(dāng)量的氫氧化鈉將pH值調(diào)至6.5。攪拌5分鐘后，靜置10分鐘。懸浮液用液固離心機(jī)(或板框壓濾機(jī)，或轉(zhuǎn)鼓式真空過濾機(jī)或其他過濾機(jī)械)分離得到15公斤磷酸鈣沉淀泥。澄清液送入乳清蛋白和乳糖生產(chǎn)車間。沉淀泥用冷凍干燥(或低溫真空干燥，或加40公斤水后噴霧干燥)，得3.4公斤磷酸鈣沉淀粉，低溫(-10℃)儲(chǔ)藏備用。每公斤沉淀粉含乳鐵傳遞蛋白14.5克，乳清液中73％的乳鐵傳遞蛋白轉(zhuǎn)移至磷酸鈣沉淀中。3.4公斤磷酸鈣沉淀粉用34公斤pH8.0，1％鹽水?dāng)嚢璩樘?0分鐘后過濾。每公斤抽提液含乳鐵傳遞蛋白1236.9毫克，抽提得率85.3％。34公斤抽提液用分子量截留值為5萬道爾頓的超濾膜二次超濾并濃縮10倍，3.4升濃縮液冷凍干燥后得91.42克乳鐵傳遞蛋白制劑，純度46％，總產(chǎn)率62.2％。
實(shí)施例3 高純度乳鐵傳遞蛋白的制備用0.05摩爾/升濃度，pH3.7的醋酸緩沖液平衡羧甲基交聯(lián)葡聚糖凝膠樹脂陽離子交換柱(或一種商業(yè)化的羧甲基陽離子交換柱，Carboxymethyl-ProductiveTM)。將30毫升濃縮液(由實(shí)施例1制得)從柱頂部泵入，而后用0.7摩爾/升的氯化鈉醋酸緩沖液(pH3.8)梯度洗脫，洗脫液的流速為2毫升/分鐘。收集從120至170毫升的液體，總共50毫升，乳鐵傳遞蛋白柱分離得率在90％以上。將收集的液體用滲析膜去離子，然后冷凍干燥。該產(chǎn)品的乳鐵傳遞蛋白純度為95％，總產(chǎn)率為61.9％。
實(shí)施例4 本發(fā)明磷酸鈣沉淀物的電泳分析實(shí)驗(yàn)取實(shí)施例3制得的磷酸鈣沉淀物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，使用商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)電泳儀，凝膠板，緩沖液(Gradipore產(chǎn)品和操作程序)。固定溶液含乙醇50％，醋酸10％和水40％。染色水溶液含考馬斯藍(lán)0.5％和酰胺染料10B 0.5％。3％的醋酸溶液用于脫色。凝膠上染色的蛋白質(zhì)譜帶可用光密度計(jì)(島津雙波長(zhǎng)TCL掃描儀CS910)掃描進(jìn)行定量分析。
實(shí)施例5 本發(fā)明方法獲得的乳鐵傳遞蛋白的氨基酸序列分析將實(shí)施例3制得的乳鐵傳遞蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳制成乳鐵傳遞蛋白的單一譜帶，然后用蛋白質(zhì)印跡法(Bio-Rad的儀器和標(biāo)準(zhǔn)操作程序)將乳鐵傳遞蛋白的單一譜帶轉(zhuǎn)移至聚二氟乙烯膜上。取下膜上的乳鐵蛋白譜帶后放入Applied-Biosystems-470A型全自動(dòng)蛋白質(zhì)序列分析儀測(cè)定該蛋白質(zhì)從氨基末端起的10個(gè)氨基酸殘基，它們是Ala-Pro-Arg-Lys-Asn-Val-Arg-Trp-Cys-Thr，與文獻(xiàn)報(bào)道相同。
權(quán)利要求
1.一種從乳清液中分離乳鐵傳遞蛋白的方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)采用一步磷酸鈣親和沉淀法將乳鐵傳遞蛋白從乳清液中預(yù)先沉淀分離，即在1升乳清液中加入1-80毫摩爾氯化鈣和1-10毫摩爾磷酸鈉，調(diào)節(jié)pH為6.0-7.5，攪拌，過濾得含乳鐵傳遞蛋白的磷酸鈣沉淀泥，經(jīng)噴霧或低溫真空干燥或冷凍干燥得沉淀粉；(2)將沉淀粉用緩沖液或鹽水抽提，得含乳鐵傳遞蛋白的抽提液，緩沖液濃度為0.1-1摩爾/升，鹽水濃度為0.5-5重量％，緩沖液或鹽水的pH值為6-8，沉淀物與所述濃度的緩沖液或鹽水用量的重量比為1∶5-10，抽提時(shí)間為20-60分鐘；(3)含乳鐵傳遞蛋白的抽提液用分子量截留值為5萬道爾頓的超濾膜分離，濃縮得濃縮液；(4)濃縮液用陽離子交換柱進(jìn)一步純化，再噴霧或冷凍干燥，制得含量為90-95％的乳鐵傳遞蛋白粉。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述緩沖液是選自磷酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽緩沖液或它們的任意二種的混合物。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述采用磷酸鈣親和沉淀法所得的含乳鐵傳遞蛋白的磷酸鈣沉淀泥也可直接用緩沖液或鹽水抽提。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述含乳鐵傳遞蛋白的抽提液經(jīng)超濾膜分離，濃縮得的濃縮液，也可直接通過噴霧或冷凍干燥，制得含量為40-50的乳鐵傳遞蛋白粉。
全文摘要
一種從乳清液中分離乳鐵傳遞蛋白的方法,包括下列步驟:(1)采用一步磷酸鈣親和沉淀法將微量的乳鐵傳遞蛋白選擇性地從乳清液中預(yù)先沉淀分離,得含乳鐵傳遞蛋白的沉淀粉;(2)沉淀粉用緩沖液或鹽水抽提得含乳鐵傳遞蛋白的抽提液;(3)抽提液用分子量截留值為5萬道爾頓的超濾膜分離和濃縮,噴霧或冷凍干燥得含量為40－50%的乳鐵傳遞蛋白粉產(chǎn)物;(4)濃縮液也可用陽離子交換柱作進(jìn)一步純化,再噴霧或冷凍干燥得含量為90－95%的乳鐵傳遞蛋白粉產(chǎn)物。本發(fā)明方法具有低成本,低投資、管理容易,快速和完整的生產(chǎn)工藝,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等特點(diǎn),是適用于大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)高純度乳鐵傳遞蛋白的方法。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1375504SQ0210737
公開日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2002年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月13日
發(fā)明者徐躍 申請(qǐng)人:徐躍