一種褐煤生物肥及其生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種褐煤生物肥及其生產(chǎn)方法。通過對(duì)新疆阜康市和沙灣煤礦區(qū)域煤樣樣品中進(jìn)行低階煤降解菌的篩選，獲得具有較強(qiáng)液化活性的菌株，經(jīng)過進(jìn)一步篩選、馴化選育，獲得兩種DavidiellatassianaCGMCC?No.7440和灰平鏈霉菌（Streptomycesgriseoplanus）CGMCC?No.8194。通過對(duì)所獲菌株進(jìn)行形態(tài)特征及相應(yīng)序列測定分析，初步確定了其分類地位和屬性，利用獲得兩種菌種降解低階煤，以褐煤和秸稈等農(nóng)業(yè)下腳料作為輔料，制備獲得降解褐煤生產(chǎn)生物有機(jī)肥，經(jīng)作物試種，并在棉花、水稻種植使用具有穩(wěn)定而顯著的增產(chǎn)增效的技術(shù)效果。
【專利說明】一種褐煤生物肥及其生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物肥料制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的，本發(fā)明涉及一種利用微生物降解褐煤生產(chǎn)生物肥及其生產(chǎn)方法的應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]中國有豐富的褐煤資源。褐煤是一種低階煤，低階煤是處于低變質(zhì)階段的煤，根據(jù)中國煤層煤分類GB/T17607分類，低階煤的定義是Qgr.maf〈24 MJ/kg的煤。褐煤易風(fēng)化自燃、發(fā)熱量低、含水量、含氧量及揮發(fā)分較高的年輕煤種，芳香族碳含量較低，并含有少量的氮和硫等元素。褐煤直接燃燒熱效率低，工業(yè)應(yīng)用價(jià)值低，長期露天堆放，不僅造成能源的浪費(fèi)，而且容易造成環(huán)境污染。因此，如何合理開發(fā)和充分利用褐煤將是一個(gè)值得深入研究的課題。
[0003]我國褐煤儲(chǔ)量如此豐富，凡有煤礦的地方就有風(fēng)化煤，它是一種含有大量的腐植酸的礦物，腐植酸總含量一般在30-70%之間，最高可達(dá)80%以上，用作熱源實(shí)在可惜，褐煤中的無機(jī)組分也可被植物利用。褐煤的有機(jī)組分可經(jīng)微生物降解。目前有的用于改良土壤質(zhì)地，提高土壤孔隙度、降低PH值、增加有機(jī)質(zhì)、腐植酸含量以及鈣、鎂等礦質(zhì)元素的含量，進(jìn)一步提高土壤肥力，但是這種不經(jīng)過發(fā)酵處理直接加入風(fēng)化煤，由于風(fēng)化煤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，腐植酸呈結(jié)合狀態(tài)存在，一般水溶性和生理活性很低，不易被植物吸收，直接使用效果很差。所以用褐煤制造的肥料，成分較全，不會(huì)形成殘留廢物，是一種利用微生物制造腐植酸肥料的理想原料。現(xiàn)有技術(shù)中利用黃孢原毛平革菌，芽孢桿菌等進(jìn)行褐煤生物肥生產(chǎn)的報(bào)道、研究較多，但 是利用Davidiella tassiana和灰平鏈霉菌(51 treptomycesgriseoplanus )菌種進(jìn)行褐煤生物肥的生產(chǎn)研究還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于現(xiàn)有技術(shù)目前褐煤產(chǎn)量多、傳統(tǒng)利用價(jià)值低、長期堆放造成環(huán)境污染的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，旨在要解決的問題是利用提供的微生物Davidiella iassiaaa和灰平鏈霉菌iStreptomyces降解褐煤生產(chǎn)生物肥，此生物肥是一種具有生物降解作用的風(fēng)化煤生物有機(jī)肥，從而可提高有機(jī)肥的生物活性，提高有機(jī)肥的利用率，達(dá)到增產(chǎn)增收和改良土壤，獲得良好的技術(shù)效果，具有廣泛的實(shí)用性和價(jià)值。
[0005]本發(fā)明采用主要的技術(shù)方案:
通過對(duì)新疆阜康市和沙灣煤礦區(qū)域煤樣樣品中進(jìn)行低階煤降解菌的篩選，獲得具有較強(qiáng)液化活性的的菌株，經(jīng)過進(jìn)一步篩選、馴化選育，獲得兩株編號(hào)為RM-1和RM-201的菌株。通過對(duì)所獲菌株進(jìn)行形態(tài)特征及相應(yīng)序列測定分析，初步確定了其分類地位和屬性，利用獲得兩種菌種降解低階煤，以褐煤和秸桿等農(nóng)業(yè)下腳料作為輔料，制備獲得降解褐煤生產(chǎn)生物有機(jī)肥，經(jīng)作物試種使用具有穩(wěn)定而顯著的增產(chǎn)增效的技術(shù)效果。
[0006]本發(fā)明具體提供一種褐煤生物肥的制備方法，％按照重量百分比計(jì)，以褐煤為利用原料，以玉米秸桿、棉花秸桿農(nóng)作物秸桿為輔料，將褐煤粉碎至50目以下，將輔料長度粉碎至2mm以下，在煤粉中加入輔料組成配料，具體配比為褐煤40%-50%，20%-25%玉米秸桿，10%-15% 棉花秸桿，調(diào)整水分至 30-50%，然后按 v/w WMDavidiella tassiana CGMCCN0.7440 和灰平鏈霉菌 iStreptomyces griseoplanus ) CGMCC N0.8194 發(fā)酵液各 10% 接入上述配料中，攪拌均勻，調(diào)整配料pH為6.5至7.5，28° C保溫發(fā)酵培養(yǎng)5_7天后，經(jīng)干燥后粉碎制備獲得褐煤生物有機(jī)肥。
[0007]本發(fā)明獲得經(jīng)過上述制備方法獲得的褐煤生物有機(jī)肥，％按照重量百分比計(jì)，褐煤生物有機(jī)肥組分由40%-50%褐煤、20%-25%玉米秸桿和10%-15%棉花秸桿組成的農(nóng)作物秸桿、水分 30-50% 組成，% 以 v/w 計(jì)各接入 10% 飽 Davidiella tassiana CGMCC N0.7440 的發(fā)酵液和 10% 的灰平鏈霉菌iStreptomyces griseoplanus、CGMCC N0.8194 發(fā)酵液。
[0008]同時(shí),本發(fā)明提供制備褐煤生物有機(jī)肥的優(yōu)良菌種tassiana CGMCCN0.7440 和灰平鏈霉菌 iStreptomyces griseoplanus) CGMCC N0.8194。
[0009]本發(fā)明中，采用的菌種發(fā)酵液是將tassiana CGMCC N0.7440和灰平鏈霉菌iStreptomyces griseoplanus、CGMCC N0.8194分別接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)48-72小時(shí)后得到的菌培養(yǎng)液。
[0010]本發(fā)明采用的兩種低階煤降解菌已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101。MlDavidiella tassiana的編號(hào)為RM-1，保藏號(hào)為CGMCC N0.7440，保藏日期為2013年4月9日；菌株灰平鏈霉MkStreptomyces griseoplanus)的編號(hào)為 RM-201,保藏日期為 2013 年 9 月 16 日，保藏號(hào)為CGMCC N0.8194。上述兩種降解菌，通過在新疆阜康和沙灣煤礦區(qū)域的煤樣樣品中分離、篩選和培養(yǎng)，獲得一批作為可降解低階煤的微生物菌株，從中篩選出編號(hào)為RM-1和RM-201的菌株，降解褐煤生產(chǎn)生物肥具有穩(wěn)定而顯著的效果，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于Da vi di ella iassiaaa - 口灰平鏈霉菌griseoplanus、。
[0011]進(jìn)一步,本發(fā)明提供了兩種菌種tassiana CGMCC N0.7440和灰平鏈霉菌griseoplanus、CGMCC N0.8194 的保存培養(yǎng)條件。
[0012]Davidiella tassiana CGMCC N0.7440 培養(yǎng)條件:CDA 固體培養(yǎng)基:蔗糖 3.0%，酵母提取物 0.5%，K2HPO4 0.1%, MgSO4.7Η20 0.05%, KCl 0.05%，NaNO30.3%，F(xiàn)eSO4.7Η20 0.001%,瓊脂2%。培養(yǎng)條件:溫度25° C，pH:6.5，培養(yǎng)時(shí)間:24_48h。在其CDA培養(yǎng)基斜面上25° C條件下，培養(yǎng)24-48小時(shí)，后采用無菌的脫脂牛奶為保護(hù)劑，真空冷凍干燥后低溫保存；平時(shí)使用保存在CDA固體培養(yǎng)基的斜面上，4° C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0013]灰平鏈霉菌(51 trep tomyces griseoplanus )培養(yǎng)條件:NA固體培養(yǎng)基:牛肉膏
0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%。培養(yǎng)條件:溫度28。C，pH:7.0,培養(yǎng)時(shí)間:24_48h。在其NA培養(yǎng)基斜面上28° C條件下，培養(yǎng)24-48小時(shí)，后采用無菌的脫脂牛奶為保護(hù)劑，真空冷凍干燥后低溫保存；平時(shí)使用保存在NA固體培養(yǎng)基的斜面上，4° C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0014]通過實(shí)施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達(dá)到以下有益效果:
本發(fā)明提供了分離得到的兩種 菌種tassiana CGMCC N0.7440和灰平鏈霉菌griseoplanus^) CGMCC N0.8194,它們都是低階煤降解菌。通過應(yīng)用提供的菌種以及褐煤和秸桿等農(nóng)業(yè)下腳料作為輔料，降解褐煤生產(chǎn)生物肥，使用褐煤生物有機(jī)肥的棉花產(chǎn)量增產(chǎn)明顯，增產(chǎn)達(dá)到了 37.1% ;褐煤生物有機(jī)肥對(duì)水稻增產(chǎn)效果明顯，比對(duì)照增產(chǎn)17% ;棉花從長勢(shì)上看，經(jīng)施用本發(fā)明褐煤生物有機(jī)肥的棉花根莖粗壯，葉片鮮綠油亮，葉厚，棉桃個(gè)大，病蟲害也明顯減少，農(nóng)藥用量只有對(duì)照的45%，產(chǎn)量比對(duì)照的高出43.82%，獲得穩(wěn)定而顯著的效果。發(fā)酵過程不使用化學(xué)溶劑，不會(huì)產(chǎn)生污染環(huán)境的二次廢物，實(shí)現(xiàn)能源的可持續(xù)利用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1 顯不為tassi ana CGMCC N0.7440 的菌落形態(tài)圖。
[0016]圖2 顯不為灰平鏈霉菌griseoplanus^ CGMCC N0.8194 的菌落形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】 [0017]下面，舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。
[0018]本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設(shè)備:
本發(fā)明采用的煤樣:沙爾湖褐煤。
[0019]培養(yǎng)基及其它材料:培養(yǎng)基選用:CDA固體培養(yǎng)基、NA固體培養(yǎng)基。
[0020]主要儀器與試劑:MSSPX-250型生化培養(yǎng)箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，Sff-CJ-1FB型單人雙面凈化工作臺(tái)，E360K離心機(jī)，恒溫?fù)u床HWY-1OOt5PCR儀Eppendorf No:5345,電泳儀 Bio-Rad Mode 200/2.0，凝膠成像儀 United-Bio, GK-330C plus, PCR 預(yù)混液{TaKaRaBiotechnology),其余試劑均為分析純。
[0021 ] 本發(fā)明中選用的所有原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)條件和方法都為本領(lǐng)域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的％都為重量百分比，除非特別指出除外。
[0022]實(shí)施例一:褐煤生物有機(jī)肥的制備
%按照重量百分比計(jì)，以褐煤為利用原料，以玉米秸桿、棉花秸桿農(nóng)作物秸桿為輔料，將褐煤粉碎至50目以下，將輔料長度粉碎至2mm以下，在煤粉中加入輔料組成配料，具體配比為褐煤40%-50%，20%-25%玉米秸桿，10%-15%棉花秸桿，調(diào)整水分至30_50%，然后將Davidiella tassi ana CGMCC N0.7440 和灰平鏈霉菌griseoplanus )CGMCCN0.8194發(fā)酵液各按v/w計(jì)10%接入上述配料中，攪拌均勻，調(diào)整配料pH為6.5至7.5，28。C保溫發(fā)酵培養(yǎng)5-7天后，經(jīng)干燥后粉碎制備獲得褐煤生物有機(jī)肥。
[0023]經(jīng)過上述制備方法獲得的褐煤生物有機(jī)肥，％按照重量百分比計(jì)，褐煤生物有機(jī)肥組分由褐煤40%-50%，20%-25%玉米秸桿和10%-15%棉花秸桿組成的農(nóng)作物秸桿，水分30-50%，各按 10% 添加的tassiana CGMCC N0.7440 的發(fā)酵液和 10% 的灰平鏈霉菌iStreptomyces griseoplanus、CGMCC N0.8194 發(fā)酵液。
[0024]上述制備的褐煤生物有機(jī)肥采用的菌種發(fā)酵液是將tassiana CGMCCN0.7440 和灰平鏈霉菌 iStreptomyces griseoplanus) CGMCC N0.8194 分別接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)48-72小時(shí)后得到的菌培養(yǎng)液。
[0025]上述兩種低階煤降解菌已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101。W^Davidiella tassiana的編號(hào)為RM-1，保藏號(hào)為CGMCC N0.7440，保藏日期為2013年4月9日；菌株灰平鏈霉MkStreptomyces griseoplanus)的編號(hào)為 RM-201,保藏日期為 2013 年 9 月 16 日，保藏號(hào)為CGMCC N0.8194。上述兩種降解菌，通過在新疆阜康和沙灣煤礦區(qū)域的煤樣樣品中分離、篩選和培養(yǎng)，獲得一批作為可降解低階煤的微生物菌株，從中篩選出編號(hào)為RM-1和RM-201的菌株，降解褐煤生產(chǎn)生物肥具有穩(wěn)定而顯著的效果，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于Da vi di ella iassiaaa - 口灰平鏈霉菌griseoplanus、。
[0026]實(shí)施例二-,Davidiella tassiana CGMCC N0.7440 的分離篩選、分類及鑒定 (I)菌種的分離和篩選
通過在新疆阜康市煤礦區(qū)域的煤樣樣品中分離、篩選和培養(yǎng)，獲得一批作為可降解新疆低階煤的微生物菌株，通過進(jìn)一步篩選，篩選的具體步驟是:取Ig礦煤樣樣品，加入無菌7jC,分別稀釋成10°、IO-1以及10_2三個(gè)梯度濃度，均勻涂布于CDA固體培養(yǎng)基上，25°C，靜置培養(yǎng)，待菌落充分生長后，挑選不同形態(tài)的菌落重新接種到CDA固體培養(yǎng)基進(jìn)行純化，如此反復(fù)純化5代，經(jīng)過平板篩選，共分離獲得7株褐煤降解菌株；經(jīng)過進(jìn)一步復(fù)篩，得到降解菌株RM-1。從中篩選出一株編號(hào)為RM-1的菌株，將菌株接種到CDA固體培養(yǎng)基上，靜置于25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h,待菌株長滿整個(gè)培養(yǎng)基后,均勻加入一層硝酸處理過的煤粉,可見RM-1菌株可將新疆低階煤降解，通過應(yīng)用沙爾湖褐煤，哈密大南湖長焰煤等具有同樣的效果，在RM-1菌絲體表面產(chǎn)生黑色液滴。降解沙爾湖褐煤具有穩(wěn)定而顯著的效果，培養(yǎng)72小時(shí)其能夠明顯的降解褐煤產(chǎn)生黑色液滴，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其降解效果較為穩(wěn)定。經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于tassiana類。
[0027]具體的,本發(fā)明提供的一種低階煤降解菌編號(hào)為RM_1。該菌株已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編=100101。保藏日期是2013年4月9日，保藏號(hào)是CGMCC N0.7440。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為。該菌株最適生長條件為:溫度25° C，培養(yǎng)基為CDA,培養(yǎng)條件:PH:6.5，培養(yǎng)時(shí)間:24-8h。在CDA固體培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)48h，菌落特征為直徑Icm左右的黃綠色菌落，呈近似圓`形，表面呈短茸毛狀，有丘狀隆起褶皺，邊緣呈纖毛狀，質(zhì)地疏松，易挑起，參見附圖1 ;依照《真菌鑒定手冊(cè)》，對(duì)編號(hào)為RM-1菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定，生理生化檢測確定編號(hào)為RM-1舊株為Davidiella tassiana中的成員。通過BLAST同源比對(duì)，菌株RM-1的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析后，菌株RM-1與Davidiellatassiana處于最小分支，是其近似種；菌株ITS序列提交至GeneBank中獲得基因登錄號(hào)為:KF002787。因而將編號(hào)為RM-1菌株確定為tassimm。
[0028](2) PCR擴(kuò)增拮抗菌ITS序列及其測序
挑取少量單菌落，放入盛有25 μ L無菌水的EP管中，100° C煮沸8-10 min，后迅速放入冰水混合物中5 min。離心10000 r/min、5 min,4° C保存，用時(shí)取上清。PCR擴(kuò)增ITS序列。ITS序列分析，以提取到的細(xì)胞總DNA為模板，利用引物:
上游引物 ITSl:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；
下游引物 ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0029]PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ L，含有24 μ L premix Taq,引物I I μ L，引物2 I μ L，模板 2 μ L，無菌水 22 μ L。擴(kuò)增條件:94° C 4 min, 94° C 55 s，53° C 30 s，72° C 90s，30個(gè)循環(huán)；72° C 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物(約500 bp)經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測序。
[0030]將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，經(jīng)測序后確認(rèn)該片段實(shí)驗(yàn)長度為486bp，序列參見附后的基因序列表:SEQUENCE LISTING I。
[0031](3) ITS序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析
將測序得到的ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行BLAST分析，從中獲取相近的ITS序列，菌株ITS序列提交利用GeneBank中的BankIt軟件進(jìn)行在線提交，獲得基因登錄號(hào)KF002787 ;將RM-1的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析后，菌株RM-1與Da Vi di ella tassi ana之間進(jìn)化距離最短，是Da vi di ella tassi ana的近似種。結(jié)合RM-1的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生理生化特性，將菌株RM-1確定鑒定為Davidiella tassiana。
[0032]實(shí)施例三:灰平鏈霉菌griseoplanus)CGMCC N0.8194 的分離、篩選、分類及鑒定
(I)菌種的分離和篩選:通過在新疆沙灣煤礦區(qū)域的煤樣樣品中分離、篩選和培養(yǎng)，獲得一批作為可降解新疆低階煤的微生物菌株，通過進(jìn)一步篩選，篩選的具體步驟是:取Ig礦煤樣樣品，加入無菌水，分別稀釋成100、10-1以及10-2三個(gè)梯度濃度，均勻涂布于NA固體培養(yǎng)基上，280C，靜置培養(yǎng)，待菌落充分生長后，挑選不同形態(tài)的菌落重新接種到NA固體培養(yǎng)基進(jìn)行純化，如此反復(fù)純化5代，經(jīng)過平板篩選，共分離獲得7株褐煤降解菌株；經(jīng)過進(jìn)一步復(fù)篩，得到降解菌株RM-201。從中篩選出一株編號(hào)為RM-201的菌株，將菌株接種到NA固體培養(yǎng)基上，靜置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h，待菌株長滿整個(gè)培養(yǎng)基后，均勻加入一層硝酸處理過的煤粉，可見觀-201菌株可將新疆低階煤降解，通過應(yīng)用沙爾湖褐煤，哈密大南湖長焰煤等具有同樣的效果，在RM-201菌絲體表面產(chǎn)生黑色液滴。降解沙爾湖褐煤具有穩(wěn)定而顯著的效果，培養(yǎng)72小時(shí)其能夠明顯的降解褐煤產(chǎn)生黑色液滴，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其降解效果較為穩(wěn)定。經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于灰平鏈霉菌iStreptomycesgriseoplanus)。
[0033]具體的，本發(fā)明提供的一種低階煤降解菌灰平鏈霉菌iStreptomycesgri seoplanus ),編號(hào)為RM-201。該菌株已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101。保藏日期是2013年9月16日，保藏號(hào)是CGMCC N0.8194。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為灰平鏈霉菌gri seoplanus ) ?該菌株最適生長條件為:溫度28° C，培養(yǎng)基為NA，培養(yǎng)條件:pH:7.0,培養(yǎng)時(shí)間:24_8h。在NA固體培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)48h，菌落特征為直徑3mm左右的白色菌落，呈近似圓形，表面有顯著的疣狀突起，質(zhì)地疏松，易挑起，參見附圖2;依照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)編號(hào)為觀-201菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定，生理生化檢測確定編號(hào)為RM-201菌株為灰平鏈霉菌中的成員。菌株16S序列提交至GeneBank中獲得基因登錄號(hào)為:KF002788。因而將編號(hào)為RM-201菌株確定為灰平鏈霉菌(Sirepio焊cmgriseoplanus)。
[0034](2) PCR擴(kuò)增降解菌16S序列及其測序:挑取少量單菌落，放入盛有25 μ L無菌水的EP管中，100° C煮沸8-10 min,后迅速放入冰水混合物中5 min。離心10000 r/min、5 min，4° C保存，用時(shí)取上清。PCR擴(kuò)增16S序列。16S序列分析，以提取到的細(xì)胞總DNA為模板，利用引物:
上游引物 27F:5' - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
下游引物 1492R:5' - TTAAGGATGGTGATGCCGCA-3'。
[0035]PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ L，含有24 μ L premix Taq,引物I I μ L，引物2 I μ L，模板 2 μ L，無菌水 22 μ L。擴(kuò)增條件:94° C 4 min, 94° C 55 s，53° C 30 s，72° C 90s，30個(gè)循環(huán)；72° C 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物(約1500 bp)經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測序。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，經(jīng)測序后確認(rèn)該片段實(shí)驗(yàn)長度為800bp，基因序列具體參見附后的序列表:SEQUENCE LISTING 2。
[0036]灰平鏈霉菌最適生長條件為:溫度28° C，培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件:pH:7.0,培養(yǎng)時(shí)間:24-48h。在NA固體培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)48h，菌落特征為直徑3mm左右的白色菌落，呈近似圓形，表面有顯著的疣狀突起，質(zhì)地疏松，易挑起；依照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)編號(hào)為觀-201菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定，生理生化檢測確定編號(hào)為RM-201菌株為Sirepio焊griseoplanus中的成員。通過BLAST同源比對(duì)，菌株RM-1的16S序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析后，菌株RM-201與Streptomycesgriseoplanus處于最小分支，是其近似種；菌株16S序列提交至GeneBank中獲得基因登錄號(hào)為:KF002788。結(jié)合菌種RM-201的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生理生化特性，將菌株RM-201確定鑒定為灰平鏈霉菌 kStreptomyces gri seoplanus ) ?
[0037]實(shí)施例四:褐煤生物有機(jī)肥的應(yīng)用
選取棉花作為指示作物，進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。將按上述實(shí)施例一提供的褐煤生物有機(jī)肥，按施用量80g/m2的標(biāo)準(zhǔn)使用。選取施肥植株與對(duì)照植株各50盆，置于室溫自然光下進(jìn)行培養(yǎng)。出苗15天后施肥植株比對(duì)照植株葉片更加鮮綠，葉片更加厚實(shí)；棉桿直徑平均粗20% ；株高平均高出15% ;出苗率高30%。
[0038]實(shí)施例五:褐煤生物有機(jī)肥的應(yīng)用
將按上述實(shí)施例一提供的褐煤生物有機(jī)肥，經(jīng)在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)五師團(tuán)場的棉花示范園使用，與當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)的施肥方式相比，在同等管理和同畝株的前提下，采用溝施方式施肥，棉田每畝底肥用本發(fā)明有機(jī)肥200公斤，對(duì)照的用市場上的有機(jī)肥200公斤。追肥時(shí)，示范園用用本發(fā)明有機(jī)肥60公斤，對(duì)照的用有機(jī)肥60公斤。棉花從長勢(shì)上看，示范園的根莖粗壯，葉片鮮綠油亮，葉厚，棉桃個(gè)大，病蟲害也明顯減少，農(nóng)藥用量只有對(duì)照的45%，產(chǎn)量比對(duì)照的高出43.82%。
[0039]實(shí)施例六:褐煤生物有機(jī)肥在大田棉花種植生產(chǎn)中的應(yīng)用試驗(yàn)
將按上述實(shí)施例一提供的褐煤生物有機(jī)肥，經(jīng)在新疆阿克蘇地區(qū)阿瓦提棉花示范基地進(jìn)行了示范試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對(duì)照相比，使用褐煤生物有機(jī)肥的棉花產(chǎn)量增產(chǎn)明顯，增產(chǎn)達(dá)到了 37.1%，取得了十分理想的效果。
[0040]一、材料與方法
1、試驗(yàn)地點(diǎn)及土壤條件:新疆阿克蘇地區(qū)阿瓦提棉花示范基地。土壤條件適中，肥力中等,土地平整,灌水方便。
[0041]2、試驗(yàn)材料:a.棉花品種采用常見棉花品系。b.肥料采用按照本發(fā)明技術(shù)方案制備的褐煤生物有機(jī)肥。
[0042]3、方法:設(shè)置I個(gè)處理和I個(gè)對(duì)照(CK)，每個(gè)小區(qū)面積相等為IOm2 (5mX2m),各處理除施肥有差異外，其他田間管理措施保持一致。
[0043]處理:常規(guī)施肥+褐煤生物有機(jī)肥120g做基肥；
對(duì)照(CK):常規(guī)施肥；
其中:常規(guī)施肥為農(nóng)家肥2噸/畝做基肥，追施尿素200g/小區(qū)。
[0044]二、田間管理及調(diào)查
經(jīng)播種、追肥，處理組和對(duì)照組小區(qū)各用尿素200g ;在間苗、除草，打藥采用常見的方式。按照棉花生長期進(jìn)行調(diào)查。
[0045]三、結(jié)果與分析
1、生理指標(biāo)分析:由數(shù)據(jù)分析可以看出:通過多次調(diào)查的結(jié)果中，使用褐煤生物有機(jī)肥的株高和根均好于對(duì)照；其中，處理組的棉花比對(duì)照組的根長3.7cm，且田間表現(xiàn)為根系發(fā)達(dá)，側(cè)根多；處理組的棉花比對(duì)照組的植株高5.4cm，說明褐煤生物有機(jī)肥能促進(jìn)棉花生長發(fā)育，生長快，具有強(qiáng)根壯苗的作用。且田間表現(xiàn)為使用本發(fā)明褐煤生物有機(jī)肥的棉花比對(duì)照葉色濃綠，植株長勢(shì)旺盛。
[0046]2、產(chǎn)量分析:數(shù)據(jù)分析可以看出:使用褐煤生物有機(jī)肥的處理與對(duì)照相比，平均單株重量比對(duì)照高15.3g，增產(chǎn)效果顯著，高達(dá)37.1%。
[0047]3、效益分析:數(shù)據(jù)分析表明:使用褐煤生物有機(jī)肥的棉花比對(duì)照組的經(jīng)濟(jì)效益可觀，增收顯著，畝增效益達(dá)307.1元。
[0048]四、結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)對(duì)棉花的一個(gè)生長周期進(jìn)行了跟蹤試驗(yàn)(5月2日-9月20日)從各項(xiàng)生理指標(biāo)來看，使用褐`煤生物有機(jī)肥的處理明顯好于對(duì)照，主要表現(xiàn)如下。
[0049]褐煤生物有機(jī)肥對(duì)促進(jìn)棉花根系生長和側(cè)根發(fā)達(dá)作用明顯；褐煤生物有機(jī)肥的棉花株高比對(duì)照高5.4cm ;褐煤生物有機(jī)肥的棉花比對(duì)照增產(chǎn)效果明顯，增產(chǎn)達(dá)37.1% ;褐煤生物有機(jī)肥的棉花比對(duì)照畝增效益307.1元?？梢?，通過本實(shí)驗(yàn)表明:褐煤生物有機(jī)肥對(duì)棉花增產(chǎn)顯著，效益好，建議大面積推廣使用。
[0050]實(shí)施例七:褐煤生物有機(jī)肥在水稻大田種植生產(chǎn)中的應(yīng)用試驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?選取不同的有機(jī)肥施用在隨機(jī)選取的地塊里，通過有機(jī)肥料示范試驗(yàn)選取一種在不同地塊有機(jī)水稻穩(wěn)定增產(chǎn)的有機(jī)肥料，為農(nóng)場有機(jī)水稻在肥料選擇上提供一定的依據(jù)。
[0051]選用本發(fā)明提供的技術(shù)方案制備獲得褐煤生物有機(jī)肥、常見的阿姆斯肥、碧野肥和千代田肥四種有機(jī)肥，將以上四種有機(jī)肥料隨機(jī)施用在不同的地塊中，使用相同的種子，底肥和追肥都是示范有機(jī)肥，每一種有機(jī)肥與同一地塊的對(duì)照進(jìn)行比較:各種對(duì)照的底肥都是施倍得有機(jī)肥，熱孜萬家地塊和黎明家地塊追肥都是東力有機(jī)肥料，聞豐福家地塊和聞雄家地塊追肥都是綠增有機(jī)肥，從而選出一種穩(wěn)定增產(chǎn)的有機(jī)肥料，各種肥料選取三點(diǎn)室內(nèi)考種取其平均數(shù)，經(jīng)濟(jì)性狀表現(xiàn)結(jié)果表1。
[0052]表1:經(jīng)濟(jì)性狀表現(xiàn)結(jié)果表
【權(quán)利要求】
1.一種褐煤生物肥的制備方法，其特征在于，％按照重量百分比計(jì)，以褐煤為利用原料，以玉米秸桿、棉花秸桿農(nóng)作物秸桿為輔料，將褐煤粉碎至50目以下，將輔料長度粉碎至2mm以下，在煤粉中加入輔料組成配料，具體配比為褐煤40%-50%，20%-25%玉米秸桿，10%-15% 棉花秸桿，調(diào)整水分至 30-50%，然后將tassiana CGMCC N0.7440 和灰平鏈霉菌(印griseoplanus) CGMCC N0.8194發(fā)酵液各按v/w計(jì)10%接入上述配料中，攪拌均勻，調(diào)整配料pH為6.5至7.5，28° C保溫發(fā)酵培養(yǎng)5_7天后，經(jīng)干燥后粉碎制備獲得褐煤生物有機(jī)肥。
2.一種褐煤生物有機(jī)肥，其特征在于，％按照重量百分比計(jì)，褐煤生物有機(jī)肥組分由褐煤40%-50%，20%-25%玉米秸桿和10%-15%棉花秸桿組成的農(nóng)作物秸桿，水分30-50%，%以v/w計(jì)各接入10%的Davidiella tassiana CGMCC N0.7440的發(fā)酵液和10%的灰平鏈霉菌(Streptomyces griseoplanus) CGMCC N0.8194 發(fā)酵液組成。
3.一種低階煤降解菌ifeVidiella tassiana RM-1,該低階煤降解菌Davidiellatassiana RM-1 的保藏號(hào)為 CGMCC N0.7440。
4.一種灰平鏈霉菌(griseoplanus)]M-2QI,該低階煤降解菌灰平鏈霉HStreptomyces griseoplanus) RM-201 的保藏號(hào)為 CGMCC N0.8194。
5.一種如權(quán)利要求2所述的褐煤生物有機(jī)肥在水稻種植生產(chǎn)中的應(yīng)用。
6.—種如權(quán)利要求2所述`的褐煤生物有機(jī)肥在棉花種植生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C05F17/00GK103724060SQ201310748587
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】郜琳, 楊雪松, 何茂, 史應(yīng)武, 馮曉霄, 高雁, 楊紅梅, 張濤, 尤陸花 申請(qǐng)人:新疆科林思德新能源有限責(zé)任公司