一種秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種高效的秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)方法。包括取樣、鑒定小孢子發(fā)育時期、低溫預處理、幼穗滅菌、花藥接種、在25±2℃下進行靜止暗培養(yǎng)至胚性愈傷組織直徑達2-3mm，之后經過再分化階段形成完整的單倍體或雙單倍體再生植株。雙單倍體既是良好的育種材料，可直接用于新品種的選育或品種改良，大大縮短育種年限，提高選擇效率，也是進行AFLP、RFLP和RAPD等分子標記和遺傳圖譜繪制和進行物種進化、遺傳分析、植物基因克隆篩選和基因工程育種等研究的理想材料。
【專利說明】一種秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)方法，主要用于秈粳雜交水稻育種、分子生物學研究和基因工程研究。
【背景技術】
[0002]水稻花藥培養(yǎng)技術在水稻育種中具有重要作用。該技術是將發(fā)育到一定階段的花藥接種至人工培養(yǎng)基上，在一定的光照溫度條件下進行離體培養(yǎng)，誘導小孢子形成愈傷組織進而分化出完整的單倍體再生植株。之后經過人工加倍或自然加倍產生雙單倍體植株(DH植株)。它們在遺傳上具有絕對的純合性。在水稻育種實踐中，利用花藥培養(yǎng)可以快速獲得純系，大大縮短育種周期，提高選擇效率，降低育種成本。在遺傳育種理論研究中，通過花藥培養(yǎng)獲得的DH群體是進行AFLP、RFLP和RAPD等分子標記和遺傳圖譜繪制研究的良好材料，也是進行物種進化研究、遺傳分析和植物基因克隆篩選的理想材料。此外，從一些特殊材料中誘導獲得的單倍體具有特異的染色體組成，如單體、三體和易位系等，譬如對遠緣雜交種Fl進行花藥培養(yǎng)可以得到異源附加系、代換系和異位系等，這些材料都是非常好的染色體工程材料。
[0003]在秈粳雜交水稻育種研究方面，花藥培養(yǎng)技術亦有重要的應用。秈粳雜交易產生超親變異，蘊含著巨大的遺傳潛力，早已被水稻育種家關注，是我國選育超高產雜交水稻的有效技術路線之一。但秈粳雜交屬于遠緣雜交范疇，存在著不親和、結實率低、雜種后代高度不育等問題，因此秈粳雜種優(yōu)勢利用進展緩慢，仍是當代水稻育種面臨的難題。花藥培養(yǎng)技術可以克服遠緣雜交的生殖障礙，快速穩(wěn)定秈粳雜交的優(yōu)良性狀和超親優(yōu)勢，解決水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢難以直接利用的問題。同時，利用秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)技術可以快速有效地篩選恢復系、提純三系不育系。然而，目前有關秈粳雜交稻的花藥培養(yǎng)研究較少，且愈傷組織誘導率低(僅為30%左右)，綠苗分化率低(僅為20%左右)。這嚴重阻礙著花培技術在秈粳雜交水稻育種實踐中的應用。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明解決的技術問題是提供一種高效的秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)方法，有效地分離花藥、進行花藥離體培養(yǎng)獲得再生植株。該方法可用于秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)獲得單倍體、雙單倍體等育種材料，也為其他作物的花藥培養(yǎng)提供參考。
[0005]本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:
一種秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)方法包括以下步驟:將小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的秈粳雜交水稻花藥從花器中分離出來，之后在適宜的生長條件下進行花藥離體培養(yǎng)，獲得再生植株。具體步驟如下:
(I)取樣與預處理
于秈粳雜交水稻孕穗期，選取葉枕距為8-12cm的健壯植株，取幼穗，保留兩片葉和葉鞘。用流水沖洗幼穗，70%酒精進行表面消毒，然后用濕紗布包裹幼穗，放入保鮮袋中，最后置于4-6°C低溫預處理。
[0006](2)外植體滅菌
取出預處理后的幼穗，先用70%酒精進行表面消毒，之后剝去外鞘，幼穗用20%次氯酸鈉滅菌20分鐘，最后用無菌水沖洗干凈。
[0007](3)接種與胚性愈傷組織誘導
在無菌條件下，將花藥接種于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，在25±2°C的溫度范圍內暗培養(yǎng)，直至胚性愈傷組織直徑達2-3毫米。
[0008](4)分化培養(yǎng)與植株再生
將直徑達2-3毫米的胚性愈傷組織轉接入分化培養(yǎng)基上，在25±2°C的溫度范圍內和12小時75001x光照環(huán)境下進行分化培養(yǎng)，直至形成株高9-11厘米、根葉芽俱全的再生植株。
[0009](5)馴化與移栽
打開具有完整再生植株的培養(yǎng)瓶瓶蓋，加入適量自來水，置于室溫下煉苗、馴化2-3天。之后洗去根部殘留的培養(yǎng)基，將再生植株移栽入大田，再進行4-6天緩苗。
[0010](6)染色體鑒定
參照楊旭和代西梅《簡易 壓片法觀察水稻有絲分裂和減數分裂行為》(《安徽農業(yè)科學》，2009，37 (14) =6325-6327)的方法對再生植株進行體細胞染色體計數，確定其倍性。
[0011](7)田間鑒定
通過對花培植株當代(H1)的田間觀察，從植株的株高、株型、葉型、花器、育性特征可以區(qū)別鑒定出單倍體、二倍體和多倍體。其中單倍體通過留宿根進行秋水仙素處理可加倍形成二倍體。而對其中的二倍體通過花培植株二代(H2 )進行株系田間鑒定，株系內表現一致的則為雙單倍體，反之不是。
[0012]本發(fā)明的積極效果:
(I)利用本發(fā)明進行秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)兩步即可成苗，即經過花藥接種誘導愈傷和愈傷分化成苗兩個步驟可獲得單倍體和雙單倍體再生植株。本發(fā)明顯著提高了秈粳雜交水稻的花培效率，胚性愈傷組織誘導率為82.1%，胚性愈傷組織分化率為86.7%。雙單倍體可作為育種材料，也可用于遺傳分析、遺傳圖譜繪制等理論研究。
[0013](2)利用本發(fā)明方法可快速獲得純系和突變體，在水稻育種中具有重要意義。不僅可以，提高育種效率，而且可以提供新的種質資源，使新品種在抗性和品質等方面得到顯著提高。第一，傳統(tǒng)育種通過自交來獲得純系作為育種材料，需要6-7年甚至更長的時間才能實現，而應用本發(fā)明獲得的雙單倍體中性狀優(yōu)良的個體當代即可直接作為育種材料用于新品種的培育，大大縮短育種年限。第二，花粉小孢子基因型豐富、發(fā)育同步、群體數量大，因此通過花藥培養(yǎng)可以獲得基因型十分豐富的純合的育種材料，顯隱性基因可以在當代完全表達，可以顯著提高選擇效率。第四、提供了一種快速有效的恢復系篩選和三系不育系提純復壯的途徑。第三，與傳統(tǒng)育種相比，花藥培養(yǎng)或將其與其他育種手段如輻射誘變育種等相結合更易發(fā)生基因突變，因此它是種質創(chuàng)新的有效途徑之一，為育種開辟新種質。最后，利用本發(fā)明獲得的雙單倍體是絕對純合的，因此是進行分子輔助育種和基因工程育種的理想材料。
[0014](3)利用本發(fā)明方法可以有效解決水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢難以直接利用的問題。在水稻育種中，秈粳雜交易產生超親變異，蘊含著巨大的遺傳潛力，早已被水稻育種家關注，是我國選育超高產雜交水稻的有效技術路線之一。但秈粳雜交屬于遠緣雜交范疇，存在著結實率低、雜種后代高度不育等問題，因此秈粳雜種優(yōu)勢利用進展緩慢，仍是當代水稻育種面臨的難題?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術可以克服遠緣雜交的生殖障礙，快速穩(wěn)定秈粳雜交的優(yōu)良性狀和超親優(yōu)勢，解決水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢難以直接利用的問題。同時，利用秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)技術可以快速有效地篩選恢復系、提純三系不育系。
[0015](4)利用本發(fā)明方法獲得的雙單倍體在遺傳上是純合的，可避免二倍體由于來自雙未的兩條染色體在DNA喊基序列的細微差異，從而大大提聞基因定位標圖的準確性；也是進行AFLP、RFLP和RAH)等分子標記和遺傳圖譜繪制研究以及物種進化研究、遺傳分析和植物基因克隆篩選等的理想材料。
[0016](5)本發(fā)明是以對秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)影響因素(包括基因型、小孢子發(fā)育時期、溫度處理和培養(yǎng)基成分等)的系統(tǒng)研究為工作基礎?；ǚ坌℃咦泳哂袉伪缎?、結構簡單、基因型豐富、發(fā)育同步和群體數量大等優(yōu)點，因此對花藥進行離體培養(yǎng)可以快速獲得多種基因型的單倍體或雙單倍體材料，且與傳統(tǒng)育種相比更易發(fā)生基因突變，擴大水稻基因池，提供新種質。
[0017]總之，本方法具有堅實的理論依據，科學性強、方法較簡便，易于操作和實際應用，在育種實踐和理論研究方面都具有顯著意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明實施例秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)的流程圖。
[0019]圖2為本發(fā)明實施例秈粳雜交水稻發(fā)育處于單核靠邊期的小孢子示意圖。
[0020]圖3為本發(fā)明實施例秈粳雜交水稻的部分染色體計數示意圖，圖中n = 12 (1000X)。
[0021]圖4為本發(fā)明實施例秈粳雜交水稻的另一部分的染色體計數示意圖，圖中2n=24(1000 X)。 [0022]圖5為本發(fā)明實施例秈粳雜交水稻花藥離體發(fā)育過程和植株再生過程示意圖，供
實審審查員參考。
[0023]圖中:A、接種后置于暗室培養(yǎng)；B、胚性愈傷組織；C、在光照條件下對胚性愈傷組織進行分化培養(yǎng)；D、分化培養(yǎng)5-7天后，形成肉眼可見的芽點；E、培養(yǎng)25天后形成的完整再生植株；F、室內常溫煉苗、馴化。
[0024]圖6為本發(fā)明實施例秈粳雜交水稻移栽定植后的再生植株示意圖，供實審審查員參考。
【具體實施方式】
[0025]單倍體及雙單倍體在作物遺傳理論研究和育種實踐中均具有重要意義和廣闊的應用前景。單倍體材料的獲得途徑包括自然發(fā)生及人工誘導。前者發(fā)生頻率極低，后者以花藥培養(yǎng)應用最為廣泛?；ㄋ幣囵B(yǎng)是以從花器中分離出的花藥作為外植體進行離體培養(yǎng)，誘導小孢子細胞進行離體雄核發(fā)育，形成胚性愈傷組織，之后經過再分化獲得單倍體或雙單倍體的一種方法。在秈粳雜交水稻育種中利用花藥培養(yǎng)技術可以快速獲得多種基因型的秈粳雜交水稻的單倍體或雙單倍體育種材料，也更易發(fā)生基因突變，獲得新種質。我們應用本發(fā)明的方法，獲得了單倍體和雙單倍體水稻育種材料。
[0026]本實施例即以由中國水稻研究所和浙江農科種業(yè)有限公司聯合選育的秈粳雜交水稻‘春優(yōu)84’為供試材料，在所述供試材料基礎上采用本發(fā)明方法獲取了秈粳雜交水稻‘春優(yōu)84’的單倍體和雙單倍體。具體實施過程由以下步驟組成:取樣與預處理、外植體滅菌、接種與胚性愈傷組織誘導、分化培養(yǎng)與植株再生、馴化與移栽；然后本發(fā)明實施例獲得的產物可通過染色體鑒定、田間鑒定來確定并證明其實施效果。
[0027]所述取樣與預處理進行以下步驟:
(I)在孕穗期，于晴天上午9:00~10:00或傍晚，選取葉枕距為8-12cm的健壯植株幼穗(花藥伸長至1/2-2/3穎花)，保留上部兩片葉和鞘。采用顯微鏡鏡檢的方法鑒定小孢子發(fā)育時期。即將花藥從穎花中剝出，置于載玻片上，滴蒸餾水浸沒花藥，用鑷子輕軋花藥使小孢子游離出來，去除殘留的花藥組織，蓋上蓋玻片，在OLYMPUS顯微鏡下鑒定小孢子發(fā)育時期并拍照。選取小孢子發(fā)育處于單核靠邊期(圖2)的幼穗用于花藥培養(yǎng)。
[0028]將幼穗沖洗干凈，用70%酒精表面消毒，之后用濕紗布包裹，放置于保鮮袋內，在4-6 °C下低溫預處理7d。
[0029]所述外植體滅菌進行以下步驟:
取出預處理后的幼穗，置于超凈工作臺上，在無菌條件下先用70%酒精進行表面消毒，之后剝去外鞘,然后用20%次氯酸鈉溶液滅菌20 min,最后用無菌水沖洗4次，每次30~60s。
[0030]所述接種與胚性愈傷組織誘導進行以下步驟:
在無菌條件下，采用剪穎抖花藥法，將花藥接種于配方為M8+15mg/L PAA+3 mg/LNAA+3mg/L KT+0.5mg/L 6_BA+5%蔗糖+0.8%瓊脂，pH值為5.8的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。即在保證花藥完整的情況下將穎花從幼穗上剪下，然后用鑷子夾起穎花頂端，敲擊培養(yǎng)瓶口處，將花藥抖落入直徑為65_、裝有愈傷誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內。之后將其置于25±2°C的溫度下暗培養(yǎng)，直至誘導獲得的胚性愈傷組織直徑達2-3mm。每瓶接種花藥150個，共計接種50瓶。共計獲得胚性愈傷組織6159塊，胚性愈傷組織誘導率為82.1%。胚性愈傷組織誘導率=形成胚性愈傷組織的花藥數/接種花藥總數X 100%。
[0031]所述分化培養(yǎng)與植株再生進行以下步驟:
將直徑達2-3mm的胚性愈傷組織轉接入配方為MS+1.5 NAA+4mg/L KT+0.5mg/L6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂、pH值為5.8的分化培養(yǎng)基上，于25±2°C、lOOOlx、12h光照條件下進行分化培養(yǎng)，直至形成株高達IOcm左右的完整再生植株。共獲得再生植株5340叢，綠苗分化率為86.7%。綠苗分化率=有綠苗分化的胚性愈傷組織數/胚性愈傷組織總數 X 100%o
[0032]所述馴化與移栽進行以下步驟:
打開具有完整再生植株的培養(yǎng)瓶蓋子，加入適量自來水，置于溫室下煉苗、馴化3d左右。之后除去根部殘留的培養(yǎng)基，將再生植株移栽入大田。如遇惡劣天氣如高溫烈日或低溫天氣，則搭遮陽網遮陽或塑料膜保溫，4-6天緩苗后，移除即可，之后花培植株健壯生長。
[0033]所述染色體鑒定進行以下步驟:
參照楊旭和代西梅《簡易壓片法觀察水稻有絲分裂和減數分裂行為》(《安徽農業(yè)科學》，2009，37 (14):6325-6327)的方法對再生植株進行體細胞染色體計數，確定其倍性(圖5-6)。隨機抽取100株再生植株進行染色體計數，結果顯示其中17株單倍體，83株二倍體。
[0034]所述田間鑒定進行以下步驟:
通過對花培植株當代(H1)的田間觀察，從植株的株高、株型、葉型、花器、育性等特征可以區(qū)別鑒定出單倍體、二倍體和多倍體等。其中單倍體通過留宿根進行秋水仙素處理可加倍形成二倍體。而對其中的二倍體通過花培植株二代(H2)進行株系田間鑒定，株系內表現一致的則為雙單倍體，反之不是。對花培植株當代(H1)隨機抽查100株，發(fā)現其中9株單倍體，88株二倍體，3株其他倍性植株。88株二倍體中65株為雙單倍體。
[0035]本發(fā)明實施例采用秈粳雜交水稻‘春優(yōu)84’經過5次重復實驗，其中胚性愈傷組織誘導率在68.9°r 85.3%之間，雙單倍體占綠苗分化率為80.69T 90.2%之間，大幅度提高了秈粳雜交水稻的培養(yǎng)成功率和效率。
[0036]本發(fā)明實施例所述培養(yǎng)方法適用于各種秈粳雜交水稻的花藥培養(yǎng)方法，例如:浙優(yōu)18、春優(yōu)618、甬優(yōu)9、甬優(yōu)12、甬優(yōu)15、甬優(yōu)17、甬優(yōu)538、甬優(yōu)1540、甬優(yōu)1640和甬優(yōu)2640 等。
[0037]應用本發(fā)明獲得的雙單倍體，其中性狀優(yōu)良的可直接作為育種材料，進行新品種培育或改良品種，而采用傳統(tǒng)育種手段需要自交6~7代才能夠獲得純系，因此利用本發(fā)明獲得雙單倍體能夠大大縮短育種年限。本發(fā)明也提供了一種快速有效的恢復系篩選和三系不育系提純復壯的途徑。同時，因為雙單倍體具有純合性，顯隱性基因當代就可以得到完全表達，所以可以提高目標性狀的選擇效率。此外，雙單倍體群體是穩(wěn)定純合的群體，因此該群體是進行AFLP、RFLP和RAH)等分子標記和遺傳圖譜繪制、物種進化、遺傳分析、植物基因克隆篩選和基因工 育種等研究的優(yōu)良材料，可大大提高基因定位標圖的準確性，同時又可以穩(wěn)定保存以進行長時間連續(xù)研究。
【權利要求】
1.一種秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)方法，其特征是由下列步驟組成:取樣與預處理、外植體滅菌、接種與胚性愈傷組織誘導、分化培養(yǎng)與植株再生、馴化與移栽； 所述取樣與預處理包括:在秈粳雜交水稻孕穗期，選取葉枕距為8-12cm的健壯植株幼穗，保留兩片葉和葉鞘，用流水沖洗幼穗，70%酒精進行表面消毒，用濕紗布包裹幼穗，放入保鮮袋中并置于4-6°C低溫預處理； 所述外植體滅菌包括:取出預處理后的幼穗，用70%酒精進行表面消毒，剝去外鞘，幼穗用20%次氯酸鈉滅菌20分鐘，無菌水沖洗干凈；所述接種與胚性愈傷組織誘導包括:在無菌條件下，將花藥接種于胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，于25±2°C溫度環(huán)境下暗培養(yǎng)，直至誘導獲得的胚性愈傷組織直徑達2-3毫米；所述分化培養(yǎng)與植株再生包括:將直徑達2-3毫米的胚性愈傷組織轉接入分化培養(yǎng)基上，于25±2°C溫度和12小時75001x光照環(huán)境下進行分化培養(yǎng)，直至形成株高9-11厘米、根葉芽俱全的再生植株； 所述馴化與移栽包括:打開具有完整再生植株的培養(yǎng)瓶，加入適量自來水，置于室溫下煉苗、馴化2-3天，洗去根部殘留的培養(yǎng)基，將再生植株移栽入大田，4-6天緩苗。
2.根據權利要求1所述的秈粳雜交水稻花藥培養(yǎng)方法，其特征是:所述胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基為 M8+15mg/L PAA+3 mg/L NAA+3mg/L KT+0.5mg/L 6_BA+5% 蔗糖+0.8% 瓊脂，胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;所述分化培養(yǎng)基為MS+1.5 NAA+4mg/L KT+0.5mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊 脂，分化培養(yǎng)基的pH值為5.8。
【文檔編號】A01H4/00GK103782908SQ201410013142
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權日:2014年1月13日
【發(fā)明者】詹艷, 余守武, 阮關海, 阮曉麗, 陳珊宇, 黃益峰, 閆川, 曹棟棟, 洪曉富, 陳合云 申請人:浙江農科種業(yè)有限公司