專利名稱:分子標記鑒定雜交水稻紅蓮種子的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及分子標記檢測技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種分子標記鑒定紅蓮型雜交水稻種子的方法,適用紅蓮6號種子的純度鑒定。
背景技術(shù):
植物在漫長的進化過程中通過自然突變或重組在細胞內(nèi)積累了大量的變異,從而導(dǎo)致同一種內(nèi)不同株系或品系的差異。這種差異在遺傳水平即表現(xiàn)為彼此間某些DNA片段的不同。當這種變異與某一特定的基因緊密連鎖時,即可作為該基因的特有的分子標簽。如果將這些DNA片段通過體外擴增、電泳、顯色,就會形成人們?nèi)庋劭梢姷木哂胁煌笮〉膸?。這些不同品系間具有相對差異的帶型即我們通常所說的分子標記,它對某一個品種而言,具有唯一性。利用分子標記進行品種選擇或品種鑒定是當前植物生物技術(shù)育種的主要內(nèi)容。它具有準確、快速、不受季節(jié)限制等優(yōu)點,因而在生產(chǎn)中被廣為采用。
分子標記輔助選擇育種是現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)的育種技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物,它使傳統(tǒng)遺傳育種學中粗放、經(jīng)驗型的育種技術(shù)向現(xiàn)代精細、定向選擇轉(zhuǎn)變,使育種變得更加具有可操作性。如果我們知道某一標簽的DNA序列,那么就可以通過簡單的PCR擴增技術(shù)或者RFLP/AFLP技術(shù),跟蹤特定的有利基因。由于分子標記具有唯一性,而且可借助PCR技術(shù)等方法,具有操作非常簡單、結(jié)果可靠、效率高、不依賴表型等優(yōu)點,在遺傳育種、種子純度鑒定上已被廣泛應(yīng)用,具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
楊子賢等結(jié)合分子標記輔助選擇將水稻抗白葉枯基因Xa21和Bt基因同時倒入9311中,在BC3F3家系中篩到8個含純合的Xa21和Bt基因,其中兩個與9311核背景具有90%的相似率,并表現(xiàn)出很高的白葉枯和螟蟲抗性(楊子賢,姜恭好,徐才國,何予卿。利用分子標記輔助選擇改良9311對白葉枯病和螟蟲的抗性。分子植物育種,2004,2(4)473-480)。譚彩霞等利用水稻品種特青與Lemont雜交組合的F2單株無性系群體,進行2年有重復(fù)的抗水稻紋枯病QTLs定位,在特青的第9號染色體和Lemont的第11號染色體上分別定位到了2個主效抗紋枯病QTL位點qSB-9和qSB-11,并以二者緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇,將兩個位點在子代中進行累積,獲得比兩親本抗性提高兩個數(shù)量級的材料。(譚彩霞,紀雪梅,楊勇,潘興元,左示敏,張亞芳,鄒軍煌,陳宗祥,朱立煌,潘學彪。水稻回交世代中兩個抗紋枯病主效數(shù)量基因的鑒定與標記輔助選擇。遺傳學報,2005,132(4)400-406)。
雜交種子純度的鑒定主要是根據(jù)特定組合雙親即不育系和恢復(fù)系中各自特異的分子標記組合來達到鑒定純度的目的。水稻中,何光華等利用RAPD技術(shù)在野敗型珍汕97A和珍汕97B葉綠體基因組篩選到一條特異的差異擴增條帶,并通過測序之后發(fā)現(xiàn)該序列位于葉綠體tRNA-Leu gene的上游,其中A較B中多了一段包含AGAAAA六堿基的重復(fù)片段單元,據(jù)此序列將其轉(zhuǎn)換成SCAR標記后,該片段在5個野敗不育系中可以穩(wěn)定擴增,而保持系中沒有。因此,他們認為該片段可以作為篩選野敗型不育系的特異性分子標記(He GH,Hou L,Xiao YH,Luo XY,Niu GQ,Yang GW,Pei Y.A common sequence difference between cytoplasmic male sterile linesand their maintainer lines existing in rice(Oryza sativa L.)chloroplast tRNA-Leu generegion.Euphytica,2003,131269-274)。此外,日本的Ichii等也利用野敗型不育系珍汕97A和保持系珍汕97B進行大規(guī)模的RAPD篩選,在二者之間發(fā)現(xiàn)一條1.6Kb的差異性擴增帶,該片段為不育系所特有,而保持系缺乏。進一步提取不育系、保持系和恢復(fù)系的線粒體基因組DNA進行PCR驗證,發(fā)現(xiàn)該片段為不育系線粒體所特有,而保持系和恢復(fù)系線粒體均不含此片段。對雜種F1和F2的驗證表明該片段與不育株共分離,說明該標記的確為野敗型不育系所特有。但若以該標記引物對DA型不育系線粒體DNA進行擴增,其擴增帶為兩條,一條為0.7Kb,一條為1Kb,與野敗型的不同(Ichii M,Hong DL,Ohara Y,Zhao CM,Taketa S.Characterization of CMSand maintainer lines in indica rice (Oryza sativa L.)based on RAPD marker analysis.Euphytica,2003,129249-252)。
以上的兩種方法均建立在野敗型不育系珍汕97A中特異性擴增的DNA片段基礎(chǔ)之上,只能跟蹤具有與珍汕97A完全相同的細胞質(zhì),主要適用于野敗型雜種的純度鑒定。
紅蓮型細胞質(zhì)雄性不育屬于配子體型細胞質(zhì)雄性不育,遺傳上有別于傳統(tǒng)的野敗型。易平等也于2002年克隆了紅蓮型細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orfH79(Yi Ping,Wang Li,Sun Qingping,ZhuYingguo.Discovery of mitochondrial chimeric-geneassociated with cytoplasmic male sterility of HL-rice,Chinese Science Bulletin,2002,47744-747);該分子標記對紅蓮型具有專一性,但是,包臺型不育系同樣含有一個類似于orfH79的分子標記orf79(Kadowaki KT,Suzuki T,Azama S.A chimeric genecontaining the 5 portion of atp6 is associated with cytoplasmic male-sterility of rice.MolGen Genet,1990,22410-16),兩者的大小完全一致;因此,僅憑orfH79不能區(qū)分紅蓮和包臺型細胞質(zhì)。鑒于此,申請人利用RAPD/SCAR技術(shù)發(fā)展了紅蓮的配子體細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的另一特異分子標記spl。該標記只存在于紅蓮,而不存在于包臺和野敗。結(jié)合這兩個分子標記,可準確快速鑒定出攜帶紅蓮型細胞質(zhì)的雜交種子。
對紅蓮型細胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)基因精細定位過程中,申請人發(fā)展了一系列秈稻9311的特異分子標記,其中SBD07、SBD01等(Liu XQ,Xu X,Tan YP,Li SQ,HuJ,Huang JY,Yang DC,Li YS,Zhu YG.Inheritance and molecular mapping of twofertility-restoring loci for Honglian gametophytic cytoplasmic male sterility in rice(Oryzasativa L.).Mol Gen Genomics,2004,271586-594)與9311中紅蓮恢復(fù)基因Rf6緊密連鎖,具有特異性。紅蓮型雜交稻紅蓮6號由紅蓮不育系粵泰A和恢復(fù)系9311配組而成,這些分子標記雜交組合紅蓮6號和恢復(fù)系9311中擴增出現(xiàn)特異性條帶,因此可以將其作為恢復(fù)系9311特異的分子標記對雜交組合紅蓮6號進行鑒定。進一步結(jié)合SSR(McCouch SR,Teytelman L. Xu YB,Lobos KB,Clare K et al.Development andMapping of 2240 New SSR Markers for Rice(Oryza sativa L.).DNA Research,2002,9257-279)和紅蓮粵泰A中的特異性分子標記即可將紅蓮型不育系粵泰A、保持系粵泰B、雜交組合紅蓮6號、恢復(fù)系9311以及其他與紅蓮6號相似的雜交種子區(qū)分開來。但目前利用這些分子標記用于紅蓮型雜交稻種子純度鑒定還沒有公開的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種分子標記鑒定雜交水稻紅蓮種子的方法,該方法省時、省力,方法簡單,操作方便,鑒定快速準確可靠,工作效率高。為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明涉及以下技術(shù)措施1、PCR引物設(shè)計(1)紅蓮6號母本粵泰A特異分子標記的PCR引物設(shè)計標記I基于紅蓮型水稻細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orfH79的全長,引物如下正向引物F5’-ATG ACA AAT CTG CTC CGA TG-3’反向引物R5’-CTT ACT TAG GAA AGA CTA C-3’標記II基于紅蓮型水稻線粒體特異DNA片段spl,引物如下
正向引物F5′-GAG GTC CAC ATC CTT CAA TC-3’反向引物R5′-GAG GTC CAC AAA CCA CTG-3’(2)紅蓮6號父本9311特異分子標記的PCR引物設(shè)計標記III基于恢復(fù)系9311特異的DNA片段,引物如下正向引物F5’-AGG TGC ACA CAA TCA GGT-3’反向引物R5’-CTA ATC TCC TTC GGC TTG-3’標記IV正向引物F5’-AAT CGA ATC TGG ATA TCT TG-3’反向引物R5’-CTT CTA CCT AGC TAC CGA GA-3’2、大規(guī)模微量DNA的提取DNA的快速、簡便提取方法的發(fā)展是分子標記在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用的前提條件,為了促進該方法在生產(chǎn)上的開發(fā)應(yīng)用,發(fā)展了一套簡單高效、低成本的DNA提取方法,其流程是(1)將待檢測的水稻種子用清水漂洗3遍,除去浮在水面的秕谷后,將飽滿的種子按體積1∶2(谷∶水)的比例加入48-52℃的熱水在30-35℃浸泡24h后,濾干,再次用清水漂洗2遍,按體積1∶2的比例加入50℃的水,在30-35℃浸泡24h,然后濾干、洗凈。在37-39℃催芽12h,待芽長至0.5-1cm即可用于DNA提取。
(2)每顆水稻種子上取一段長0.5-1cm的幼芽,放入一事先貼好標簽的1.5ml離心管中,加入100μl CTAB提取液,放入1顆干凈的小鋼珠(直徑2mm),用組織搗碎器(Geno/Grinder 2000)高速搗碎2min,然后再加入400μlCTAB提取液,65℃水浴25-30min;(3)加入500μl氯仿/異戊醇(24∶1)于水浴后的離心管中,混勻,離心機上10000rpm離心5min,取上清300μl轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管;(4)加入600μl無水乙醇(-20℃預(yù)冷),混勻,冰上放置20min,12000rpm離心15min,倒掉上清液,將離心管倒置10min使酒精晾干,然后溶于30μl無菌水,分光光度計測定每個樣品的DNA濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
3、標準PCR擴增體系的建立標準的PCR擴增反應(yīng)體系為10μl,組成如下總DNA/50ng 0.5μl
10×PCR buffer/pH8.3 1μl25mM MgCl20.5μl10mM dNTP 0.5μl一單位Taq酶 0.5μl5pM的引物F0.5μl5pM的引物R0.5μl去離子無菌水/ddH2O 6μl反應(yīng)混合物用礦物油(Sigma M5904,分子生物學專用)覆蓋,PCR反應(yīng)程序如下標記I,標記III,標記IV1cycle 94℃ 5min30cycle 94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1.5min1cycle 72℃ 5minstore 4℃ 10min;標記II1cycle 94℃ 5min30cycle 94℃ 1min;58℃ 1min;72℃ 1.5min1cycle 72℃ 5minstore 4℃ 10min;4、擴增DNA片段檢測與真假雜種鑒定首先是擴增片段在1.0%的瓊脂糖膠(標記IV,3.0%)上電泳,根據(jù)擴增片段的帶型鑒定所檢測的種子是否為陽性,即真雜種(1)紅蓮6號母本粵泰A特異分子標記的鑒定標記I對照紅蓮型不育系粵泰A,包臺型不育系包源A和紅蓮6號均有一條240bp的特異性擴增帶,為陽性;紅蓮型保持系粵泰B、包臺型保持系包源B和恢復(fù)系9311,明恢63和兩優(yōu)1193無任何擴增帶,為陰性(圖1)。
標記II對照紅蓮型不育系粵泰A和紅蓮6號均有一條2176bp的特異性擴增帶,為陽性;紅蓮型保持系粵泰B、包臺型不育系包源A、包臺型保持系包源B和恢復(fù)系9311,明恢63和兩優(yōu)1193無任何擴增帶,為陰性(圖1)。
綜上所述,被檢測材料的兩引物擴增的帶型均與紅蓮型不育系粵泰A相一致時,該被檢測材料含有配子體紅蓮型細胞質(zhì),為陽性,鑒定結(jié)果可靠;被檢測材料無任何擴增帶,該材料不含紅蓮型細胞質(zhì),為陰性(圖1)。
(2)紅蓮6號父本9311特異分子標記的鑒定標記III對照恢復(fù)系9311,紅蓮型雜交F1代紅蓮6號具有1.95kb的特異性擴增帶,為陽性;紅蓮型不育系粵泰A,保持系粵泰B,包臺型不育系包源A,包臺型保持系包源B和恢復(fù)系9311,明恢63和兩優(yōu)1193無任何擴增帶,為陰性(圖1)。
標記IV對照恢復(fù)系9311,紅蓮型不育系粵泰A分別具有不同大小的單一條帶,而其雜交F1代為雙帶,具有兩者的條帶,只有具有這種雙帶的被檢測材料表現(xiàn)為陽性,否則為陰性(圖5)。
綜合紅蓮6號父、母本特異分子標記的鑒定結(jié)果,只有同時具有不育系粵泰A和恢復(fù)系9311中特異分子標記的紅蓮6號種子才是真雜種,否則就是假雜種。
本發(fā)明與傳統(tǒng)雜交育種方法相比具有以下優(yōu)點和效果(1)快速、準確、可靠核酸提取加上PCR反應(yīng),總共僅需3-4小時。
(2)設(shè)備簡單,只需要PCR儀、臺式離心機等即可,普通的分子生物學實驗室皆可完成。
(3)方法簡便、操作方便PCR反應(yīng)不需要特別的技術(shù)培訓(xùn),一般的中專畢業(yè)生或經(jīng)過短暫培訓(xùn)的實驗員均可獨立操作。
(4)高通量的樣品檢測一次PCR反應(yīng)可以檢測96個材料。
(5)具有可預(yù)測性、大幅度提高純度鑒定效率傳統(tǒng)的純度鑒定需要田間種植,從種植到開花需要至少3個月的時間,冬天在海南,費用高、時間長,利用分子標記鑒定紅蓮6號純度可以隨時取樣進行,縮短了檢測時間,贏得市場。
圖1標記I、II、III的PCR擴增篩選驗證示意圖標記I擴增條帶240bp,只有帶配子體細胞質(zhì)的粵泰A、紅蓮6號、包源A具有,其他材料無此條帶;標記II擴增2176bp,僅含紅蓮型細胞質(zhì)的粵泰A、紅蓮6號有,其他材料均陰性;標記III擴增1950bp,僅含9311核基因的材料包括9311和紅蓮6號具有,其他材料均陰性。
圖2用標記I對鑒定材料的PCR擴增篩選驗證示意圖MMarker,DNA分子量標記DL2000;1-23鑒定材料編號標記I擴增檢測待測材料,圖中23個材料,其中1號為陰性,非配子體細胞質(zhì)類型,其余為陽性圖3用標記II對鑒定材料的PCR擴增篩選驗證示意圖MMarker,DNA分子量標記DL2000;1-23鑒定材料編號標記II擴增檢測待測材料,23個檢測材料中除1、12、22號為陰性,不含紅蓮型配子體細胞質(zhì)外,其余為陽性圖4用標記III對鑒定材料的PCR擴增篩選驗證示意圖MMarker,DNA分子量標記DL2000;1-23鑒定材料編號標記III擴增檢測待測材料,圖中23個材料,其中21號為陰性,不含有9311標記,其余為陽性圖5標記IV對不同親本與紅蓮6號的特異性PCR擴增示意圖粵泰A、粵泰B、明恢63、兩優(yōu)1193、包源A、包源B只有一條250bp的條帶;9311有一條約220bp的條帶;紅蓮6號具有與粵泰A和9311相同的2條特異帶圖6標記IV PCR擴增鑒定紅蓮6號種子的純度示意圖MMarker,DNA分子量標記DL2000;1-23鑒定材料編號紅蓮6號具有與粵泰A和9311相同的2條特異帶;含有粵泰A,9311任一親本的只具有兩者之一的條帶具體實施方案四分子標記快速定性鑒定紅蓮6號種子純度的方法,其具體步驟如下1、PCR引物設(shè)計(2)特異的細胞質(zhì)雄性不育基因擴增的PCR引物設(shè)計標記I基于水稻線粒體基因組內(nèi)的紅蓮型細胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orfH79(YiPing,Wang Li,Sun Qingping,ZhuYingguo.Discovery of mitochondrial chimeric-geneassociated with cytoplasmic male sterility of HL-rice,Chinese Science Bulletin,2002,47744-747)的全長,引物如下正向引物F5’-ATG ACA AAT CTG CTC CGA TG-3’反向引物R5’-CTT ACT TAG GAA AGA CTA C-3’標記II基于水稻線粒體基因組內(nèi)的紅蓮型細胞質(zhì)特異DNA片段spl,引物如下正向引物F5′-GAG GTC CAC ATC CTT CAA TC-3’反向引物R5′-GAG GTC CAC AAA CCA CTG-3’(2)恢復(fù)系特異片段的PCR引物設(shè)計標記III基于恢復(fù)系9311特異的DNA片段,引物如下正向引物F5’-AGG TGC ACA CAA TCA GGT-3’反向引物R5’-CTA ATC TCC TTC GGC TTG-3’標記IV正向引物F5’-AAT CGA ATC TGG ATA TCT TG-3’反向引物R5’-CTT CTA CCT AGC TAC CGA GA-3’
2、微量DNA的快速提取(1)將待檢測的水稻種子用清水漂洗3遍,除去浮在水面的秕谷后,將飽滿的種子按體積1∶2(谷∶水)的比例加入48-52℃的熱水在30-35℃浸泡24h后,濾干,用清水漂洗2遍,按體積1∶2的比例加入48-52℃的熱水在30-35℃浸泡24h,然后濾干、洗凈。在38℃催芽12h,待芽長至0.5-1cm即可用于DNA提取。
(2)每顆種子上取一段長0.5-1cm的水稻幼芽,放入1.5ml離心管中,貼好標簽、編號,加入100μl CTAB提取液,放入1顆干凈的小鋼珠(直徑2mm),用組織搗碎器(Geno/Grinder 2000)高速搗碎2min,然后再加入400μl CTAB提取液,65℃水浴25-30min;(3)加入500μl氯仿/異戊醇(24∶1)于水浴后的離心管中,混勻,離心機上10000rpm離心5min,取上清300μl轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管;(4)加入600μl無水乙醇(-20℃預(yù)冷),混勻,冰上放置20min,12000rpm離心15min,倒掉上清液,將離心管倒置10min使酒精晾干,然后溶于30μl無菌水,分光光度計測定每個樣品的DNA濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
3、PCR擴增篩選標準的PCR擴增反應(yīng)體系為10μl,組成如下總DNA/50ng 0.5μl10×PCR buffer/pH8.31μl25mM MgCl20.5μl10mM dNTP 0.5μl一單位Taq酶 0.5μl5pM的引物F 0.5μl5pM的引物R 0.5μl去離子無菌水/ddH2O 6μl反應(yīng)混合物用礦物油(Sigma M5904,分子生物學專用)覆蓋,PCR反應(yīng)程序如下標記I,標記III,標記IV1cycle 94℃ 5min30cycle94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1.5min1cycle 72℃ 5min
store 4℃ 10min;標記II1cycle 94℃ 5min30cycle94℃ 1min;58℃ 1min;72℃ 1.5min1cycle 72℃ 5minstore 4℃ 10min;4、擴增DNA片段檢測與真假雜種鑒定首先將每個編號4個標記的擴增片段在1.0%的瓊脂糖膠(標記IV,3.0%)上電泳,根據(jù)4個標記擴增片段的帶型鑒定所檢測的種子是否為陽性,即真雜種,然后計算種子的純度(1)紅蓮6號母本粵泰A特異分子標記的鑒定標記I對照紅蓮型不育系粵泰A,包臺型不育系包源A和紅蓮6號均有一條240bp的特異性擴增帶,為陽性;紅蓮型保持系粵泰B、包臺型保持系包源B和恢復(fù)系9311,明恢63和兩優(yōu)1193無任何擴增帶,為陰性(圖1)。
標記II對照紅蓮型不育系粵泰A和紅蓮6號均有一條2176bp的特異性擴增帶,為陽性;紅蓮型保持系粵泰B、包臺型不育系包源A、包臺型保持系包源B和恢復(fù)系9311,明恢63和兩優(yōu)1193無任何擴增帶,為陰性(圖1)。
綜上所述,被檢測材料的兩引物擴增的帶型均與紅蓮型不育系粵泰A相一致時,該被檢測材料含有配子體紅蓮型細胞質(zhì),為陽性,鑒定結(jié)果可靠;被檢測材料無任何擴增帶,該材料不含紅蓮型細胞質(zhì),為陰性(圖1)。
(2)紅蓮6號父本9311特異分子標記的鑒定標記III對照恢復(fù)系9311,紅蓮型雜交F1代紅蓮6號具有1.95kb的特異性擴增帶,為陽性;紅蓮型不育系粵泰A,保持系粵泰B,包臺型不育系包源A,包臺型保持系包源B和恢復(fù)系9311,明恢63和兩優(yōu)1193無任何擴增帶,為陰性(圖1)。
標記IV對照恢復(fù)系9311,紅蓮型不育系粵泰A分別具有不同大小的單一條帶,而其雜交F1代為雙帶,具有兩者的條帶,只有具有這種雙帶的被檢測材料表現(xiàn)為陽性,否則為陰性(圖5)。
綜合紅蓮6號父、母本特異分子標記的鑒定結(jié)果,只有同時具有不育系粵泰A和恢復(fù)系9311中特異分子標記的紅蓮6號種子才是真雜種,否則就是假雜種。
(3)紅蓮6號種子的純度確定綜合4個標記的帶型,如果4個標記的帶型與兩個親本的帶型完全一致,那么就斷定該粒種子是真雜種;凡4個標記的帶型只要有1個與親本的帶型不一致,就斷定該粒種子是假雜種。根據(jù)帶型統(tǒng)計假雜種的數(shù)量,除以所檢測的種子的數(shù)量乘以100%即得到所鑒定的紅蓮6號種子的純度。
在本次檢測實例中,1號單株沒有標記I、II的擴增帶(圖2、圖3),標記IV只有一條擴增帶(圖6);12號單株擴增的標記II(圖3)與標記IV帶型(圖6)與親本的標準帶型不一致;21號單株標記III(圖4)沒有擴增帶;22號單株標記II(圖3)沒有擴增帶,標記IV帶型(圖6)與雙親的標準帶型不一致;說明這4個單株的基因型與粵泰A和9311存在差異,因此,這4個單株是假雜種。
權(quán)利要求
1.一種分子標記鑒定雜交水稻紅蓮種子的方法,其特征它包括下列步驟A、PCR引物設(shè)計標記I正向引物F5’-ATG ACA AAT CTG CTC CGA TG-3’;反向引物R5’-CTT ACT TAG GAA AGA CTA C-3’;標記II正向引物F5′-GAG GTC CAC ATC CTT CAA TC-3’;反向引物R5′-GAG GTC CAC AAA CCA CTG-3’;標記III正向引物F5’-AGG TGC ACA CAA TCA GGT-3’;反向引物R5’-CTA ATC TCC TTC GGC TTG-3’;標記IV正向引物F5’-AAT CGA ATC TGG ATA TCT TG-3’;反向引物R5’-CTT CTA CCT AGC TAC CGA GA-3’;B、DNA的提取首先是將待檢測的水稻種子用清水漂洗3遍,除去浮在水面的秕谷后,將種子按體積1∶2/谷∶水的比例加入48-52℃的水,在30-35℃浸泡24h后,濾干,再次用清水漂洗2遍,按體積1∶2的比例加入50℃的熱水在30-35℃浸泡24h,然后濾干、洗凈,在37-39℃下催芽12h,待芽長至0.5-1cm即可用于DNA提??;其次是在水稻種子上取一段長0.5-1cm的幼芽,放入貼好標簽的1.5ml離心管中,加入100μl CTAB提取液,放入1顆小鋼珠,用組織搗碎器搗碎2min,然后再加入400μl CTAB提取液,65℃水浴25-30min;第三是加入500μl氯仿/異戊醇/24∶1于水浴后的離心管中,混勻,離心機上10000rpm離心5min,取上清300μl轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管;第四是加入600μl無水乙醇/-20℃預(yù)冷,混勻,冰上放置20min,12000rpm離心15min,倒掉上清液,將離心管倒置10min使酒精晾干,然后溶于30μl無菌水,分光光度計測定樣品的DNA濃度,-20℃保存?zhèn)溆?;C、PCR擴增體系的建立標準的PCR擴增反應(yīng)體系為10μl,組成如下總DNA/50ng 0.5μl10×PCR buffer/pH8.31μl25mM MgCl20.5μl10mM dNTP 0.5μl一單位Taq酶 0.5μl5pM的引物F 0.5μl5pM的引物R 0.5μl去離子無菌水/ddH2O 6μl;反應(yīng)混合物用礦物油覆蓋,PCR反應(yīng)程序如下標記I、標記III、標記IV1cycle94℃ 5min30cycle94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1.5min1cycle72℃ 5minstore4℃10min;標記II1cycle94℃ 5min30cycle94℃ 1min;58℃ 1min;72℃ 1.5min1cycle72℃ 5minstore4℃10min;D、擴增DNA片段檢測與雜種鑒定擴增片段在1.0%/標記IV,3.0%的瓊脂糖膠上電泳,根據(jù)擴增片段的帶型鑒定所檢測的種子a.紅蓮6號母本粵泰A的特異標記的鑒定標記I對照紅蓮型不育系粵泰A、包臺型不育系包源A和紅蓮6號均有一條240bp的特異性擴增帶,為陽性;紅蓮型保持系粵泰B、包臺型保持系包源B和恢復(fù)系9311,明恢63和兩優(yōu)1193無任何擴增帶,為陰性;標記II對照紅蓮型不育系粵泰A和紅蓮6號均有一條2176bp的特異性擴增帶,為陽性;紅蓮型保持系粵泰B、包臺型不育系包源A、包臺型保持系包源B和恢復(fù)系9311、明恢63和兩優(yōu)1193無任何擴增帶,為陰性;b、紅蓮6號父本9311特異標記的鑒定標記III對照恢復(fù)系9311,紅蓮型雜交F1代紅蓮6號具有1.95kb的特異性擴增帶,為陽性;紅蓮型不育系粵泰A、保持系粵泰B、包臺型不育系包源A、包臺型保持系包源B、恢復(fù)系明恢63和兩優(yōu)1193無任何擴增帶,為陰性;被檢測材料的擴增帶型與9311一致,為陽性;標記IV對照恢復(fù)系9311、紅蓮型不育系粵泰A分別有一條帶,其雜交組合紅蓮6號同時含雙親的兩條帶,這種雙帶的被檢測材料為陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分子標記鑒定雜交水稻紅蓮種子的方法。包括下列步驟,首先是相關(guān)分子標記PCR引物設(shè)計;其次是DNA的提??;第三是標準PCR擴增體系的建立;第四是擴增DNA片段檢測分析。本發(fā)明方法簡便,操作方便,該方法以紅蓮型細胞質(zhì)、紅蓮型不育系粵泰A結(jié)合恢復(fù)系9311的特異分子標記,可快速、準確、可靠地通過實驗手段鑒定雜交水稻紅蓮6號的種子純度,降低種子銷售過程中因種子純度不夠而可能招致減產(chǎn)的風險。
文檔編號C12P19/00GK1944668SQ200610019799
公開日2007年4月11日 申請日期2006年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月3日
發(fā)明者李紹清, 譚艷平, 朱英國 申請人:武漢大學