專利名稱：一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)雜交水稻種子純度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳學(xué)領(lǐng)域，公開了一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)雜交水稻種子純度的方法。
背景技術(shù)：
種子純度是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的問題之一，它關(guān)系到國家糧食安全，是種子產(chǎn)業(yè)化開發(fā)中最重要、最核心的內(nèi)容，因而也關(guān)系種子企業(yè)生死存亡。大部分農(nóng)作物種子純度要求都在95%以上，甚至為99. 9% (表1)，因而，需要大量統(tǒng)計(jì)抽樣才能獲得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，工作量十分巨大。例如合格的雜交稻品種純度要求達(dá)到96%，則意味著100個(gè)植株最多只允許4個(gè)雜株，那么要使檢測(cè)結(jié)果可靠，至少應(yīng)該檢測(cè)500粒種子，工作量是巨大的。另外，由于技術(shù)缺陷，各種種子純度檢測(cè)方法還存在受環(huán)境影響、速度慢、費(fèi)用高等問題，影響到了鑒定的準(zhǔn)確性、種子及時(shí)上市、成本等重要問題。表I農(nóng)作物種子純度標(biāo)準(zhǔn)(GB4404. 1-2008)
^原種(％)大田用種# m大剛手中
大(%)_竹大_(%)(%>
常規(guī)種99 9 9θ7θ常規(guī)種99~09δΓθ~
不育系油菜親本99.098.0
水輛保持系49 H 99.9雜交種85.0
恢復(fù)系常規(guī)種99.095.0
雜交種96.0親木-毛籽99.097.0
常規(guī)種 99.9 97.0 職、薄■99.0
膜包衣)
自交種 99.9 99.0雜交種95.0
96.0 小麥常規(guī)種99.999.0
雙父種
__三交Ι41___95. O 大麥常規(guī)種__99. 9W O種子純度檢測(cè)經(jīng)歷了從田間表型鑒定到實(shí)驗(yàn)室分子標(biāo)記鑒定的發(fā)展。田W表型鑒定的操作過程是這樣的從生產(chǎn)的種子中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的種子，田間種植并觀察性狀，通過與品種的真實(shí)性狀比較，鑒定出雜株。例如，由100個(gè)植株構(gòu)成的鑒定群體中，發(fā)現(xiàn)2株株高和3株顏色明顯不同于該品種真實(shí)性狀的植株，則該品種的純度為(2+3)/100=95%。田間鑒定的缺陷是明顯的一是需要種植一個(gè)季節(jié)，周期長、占地多、費(fèi)用高，而種子從生產(chǎn)到銷售的時(shí)間只有2-3個(gè)月時(shí)間，田間鑒定周期嚴(yán)重影響了種子銷售上市。二是植株性狀常受環(huán)境影響，如在高肥力條件下，植株更高大，從而誤判為雜株，使鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。分子標(biāo)記鑒定種子純度在很大程度上克服了以上問題，其理論依據(jù)可以簡(jiǎn)單描述為利用雜株與品種間特定分子的不同，鑒定雜株，計(jì)算種子純度。依據(jù)分子標(biāo)記的類型不同，可分為蛋白質(zhì)(如同工酶等)和DNA分子標(biāo)記鑒定。蛋白質(zhì)分子標(biāo)記鑒定也有明顯的缺陷，一是蛋白表達(dá)同樣受環(huán)境影響，使鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確；二是可用于鑒定的蛋白分子標(biāo)記不多，使這種技術(shù)難以用于區(qū)分親緣關(guān)系較近的品種。DNA分子標(biāo)記是根據(jù)雜株與正常品種在DNA水平上的序列差異進(jìn)行鑒定的，該技術(shù)在很大程度上克服了以上幾種鑒定方法的不足。首先，DNA序列差異不再依賴于環(huán)境，因此，鑒定結(jié)果是準(zhǔn)確的；第二，從理論上講，任何雜株與正常品種DNA都存在差異，因此，可用于鑒定任意品種；第三，由于種子、幼苗、成株期的DNA都是一樣的，因此，鑒定不再需要田間種子，只需要室內(nèi)簡(jiǎn)單發(fā)芽提取DNA即可，縮短了檢測(cè)周期，為種子推廣贏得了時(shí)間。然而，企業(yè)可能需要檢測(cè)多個(gè)生產(chǎn)地點(diǎn)或生產(chǎn)者的種子是否合格，檢測(cè)工作量巨大，即使是利用DNA分子標(biāo)記檢測(cè)，常常也會(huì)由于工作量大而無法及時(shí)完成檢測(cè)，同時(shí)，巨大的工作量也伴隨著檢測(cè)成本過高的問題。例如，國家法律規(guī)定，雜交水稻種子的純度不得低于96%，因此，若要求在95%的概率保證下，種子純度誤差不超過1%，則每個(gè)樣本需要抽檢3000粒種子才能達(dá)到要求，若檢測(cè)100個(gè)樣本，則需要提取DNA、PCR、電泳分別為3000*100=30萬次。在檢測(cè)人員和設(shè)備有限的情況下，幾乎是不可能在在種子包裝與銷售前完成檢測(cè)工作，嚴(yán)重影響上市。在此情況下，只能減少抽樣量，以達(dá)到減少工作量的目的。例如，一般企業(yè)抽檢100粒種子，在此情況下，若依舊要求純度誤差不過1%，那么對(duì)結(jié)果的把握度(概率保證)僅為15%左右。所以，即使得到了檢測(cè)結(jié)果，并沒有把握判斷該批次的種子是否合格，給市場(chǎng)銷售帶來巨大風(fēng)險(xiǎn)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種能夠準(zhǔn)確、快速檢測(cè)雜交種子純度的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)雜交水稻種子純度的方法，包括以下步驟根據(jù)種子純度要求，計(jì)算抽樣樣本量；等量抽樣并混合提取DNA或分別提取DNA后再等量混合；按檢測(cè)位點(diǎn)的堿基序列，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增檢測(cè)位點(diǎn)；回收并純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；利用擴(kuò)增產(chǎn)物建庫并進(jìn)行高通量測(cè)序；根據(jù)檢測(cè)位點(diǎn)序列比例，計(jì)算種子純度。本發(fā)明提供更優(yōu)選的技術(shù)方案是一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)雜交水稻種子純度的方法，包括以下步驟(I)計(jì)算最小抽樣樣本量根據(jù)商品種子純度要求、設(shè)定的概率保障和允許的誤差，確定最小的樣本抽樣量；(2) DNA提取對(duì)每一植株，選取相同部位的等量材料混合后提取DNA ;或者，提取每一植株的DNA，再對(duì)DNA進(jìn)行定量抽取后再等量混合；(3)擴(kuò)增并回收檢測(cè)位點(diǎn)按檢測(cè)位點(diǎn)的堿基序列，設(shè)計(jì)引物，對(duì)檢測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)包含等位位點(diǎn)的差異序列，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化；(4)建庫與高通量測(cè)測(cè)序按高通量測(cè)序流程分別構(gòu)建親本基因DNA文庫，ePCR并高通量測(cè)序；(5)種子純度的確定根據(jù)測(cè)序的結(jié)果，獲得父本與母本序列的片段數(shù)，由此推算種子純度。本發(fā)明實(shí)施例的有益效果是(I)減少了工作量，加快了檢測(cè)速度。采用分子標(biāo)記檢測(cè)，若I個(gè)樣本抽樣3000個(gè)植株，則DNA提取、PCR擴(kuò)增與電泳檢測(cè)都需要做3000次，因此工作量大，速度慢，常常無法在種子收獲到包裝上市短短兩三個(gè)月內(nèi)完成。采用本方案，不論每一樣本抽樣多少植株，均將這些植株等量混合成I個(gè)樣品，DNA提取、建庫和測(cè)序時(shí)都只做I次，工作量大為減少，同時(shí)速度大為加快，很好地滿足了種子及時(shí)上市銷售的要求。(2)提高了準(zhǔn)確率。如上所述，分子標(biāo)記檢測(cè)由于工作量大，常常只能減少每一樣本中抽樣的植株數(shù)，達(dá)到加快進(jìn)度的目的，這就導(dǎo)致了檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確的情況。采用本方案，現(xiàn)有高通量測(cè)序通量都在100G以上，即使檢測(cè)的基因序列長達(dá)1K，也可檢測(cè)到超過I億條序列，每2條序列可代表I個(gè)植株，則可檢測(cè)超過5000萬個(gè)植株。如此大的樣本容量，我們幾乎可以在每一樣本中抽取任意多的植株進(jìn)行檢測(cè)，很好地保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。(3)保持了 DNA檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。本技術(shù)方案應(yīng)歸于DNA分子標(biāo)記檢測(cè)范疇。因此，與田間檢測(cè)和蛋白質(zhì)分子標(biāo)記檢測(cè)比較，他們具有不受環(huán)境影響，不受季節(jié)限制，不占用土地等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的突出特點(diǎn)是很好地滿足了商品雜交種子純度檢測(cè)中對(duì)檢測(cè)速度與準(zhǔn)確性的要求。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例提供的雜交水稻品種“科優(yōu)73”種子純度檢測(cè)示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例I雜交水稻品種“科優(yōu)73”種子純度檢測(cè)方法(參見圖I)(I) “科優(yōu)73”雜交種子抽樣
“科優(yōu)73”是一種選育的雜交水稻新品種，并申請(qǐng)了新品種保護(hù)，其父本為R7723，母本為金科1A。對(duì)127份批次的“科優(yōu)73”種子純度抽樣分析。利用DPS(Data ProcessingSystem:數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。)2000軟件中的“二項(xiàng)分布總體均數(shù)置信區(qū)間”功能，計(jì)算出抽樣樣本需要達(dá)到3000個(gè)樣本才能滿足檢測(cè)的誤差不超過1%的要求。因此利用種子抽樣器，按隨機(jī)取樣的原則，從每一批次的種子中，大約抽取4500粒種子。(2)種子發(fā)芽、樣品混合與DNA提取將5層報(bào)紙鋪于40cmX 80cm的瓷盤中，加少量水分至報(bào)紙完全濕潤但不露明水為止。將4500粒種子均勻撒播于瓷盤中，用另一瓷盤將其蓋住以保持水分。于室內(nèi)(溫度約30°C左右)自然發(fā)芽，期間檢查并適當(dāng)補(bǔ)充水份。種子發(fā)芽生長至第7-10天時(shí)，已有I片葉片長出，此時(shí)選取3000個(gè)小苗，每棵小苗取I片葉片，將葉片疊放整齊，統(tǒng)一切取大致相等的量混合。按植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，天更，北京)操作手冊(cè)分離純化基因組DNA,利用ND2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定樣品濃度與純度。共獲得127份混合DNA樣品，分別代表了 127個(gè)抽樣樣本。(3) PCR擴(kuò)增與回收父本R7723與母本金科IA在株高基因HD不同，父本為高桿，含有該基因的顯性基因，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 1，而母本為矮桿，含有該基因的隱性基因，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 2。其中，顯性與隱性位點(diǎn)為單堿基突變，即在第203個(gè)堿基位點(diǎn)，R7723中為T，而金科IA中為G。利用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HD基因在R7723與金科IA之間的差異位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)時(shí)采用軟件的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行。其中，Sense Primer (正向引物)為序列表中的SEQ ID NO. 3ο Antisense Primer(反向引物)為序列表中的SEQ ID NO. 4，獲得的PCR產(chǎn)物為272bp，為序列表中的SEQ ID NO. 5 (與R7723完全匹配)和SEQ ID NO. 6 (與金科 IA 完全匹配)。PCR 擴(kuò)增體系按試劑盒 DreamTaq Green PCR Master Mix(2X) (K1081,Fermentas)推薦比例配比，即PCR混合物501、模板15ng、引物21(濃度0. 5M/1)，加去離子水 至總體積為1001。擴(kuò)增程序如下94°C預(yù)變性4分鐘；94°C，I分鐘，54°C，I分鐘，72°C，2分鐘，循環(huán)20次；72°C延伸8分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)并用PCR產(chǎn)物按瓊脂糖凝膠回收試劑盒(K0691，F(xiàn)ermentas)操作手冊(cè)回收并純化目的DNA片段。(4)建庫與高通量測(cè)序由于PCR產(chǎn)物不足400bp長度，因此，對(duì)獲得的127份DNA擴(kuò)增產(chǎn)物按SOLiD 5500高通量測(cè)序操作手冊(cè)中的擴(kuò)增子串聯(lián)法進(jìn)行建庫。建庫過程中，采用BarCoding(條形碼)對(duì)樣品進(jìn)行區(qū)分，共采用64個(gè)條形碼。測(cè)序時(shí)共占用2個(gè)測(cè)序通道，獲得數(shù)據(jù)22. 7G，平均每個(gè)樣本獲得數(shù)據(jù)O. 18G，127個(gè)樣本的變異幅度為O. 15G-0. 21G。加上接頭等序列，每500bp可代表I個(gè)檢測(cè)片斷，則平均每個(gè)樣本被檢測(cè)到了 37. 48萬次，127個(gè)樣本的變異幅度為31. 45萬次-44. 04萬次。如此大的檢測(cè)頻率保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。(5)種子純度的計(jì)算按完全匹配的原則，將R7723中與金科IA中的差異序列與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，在每一個(gè)樣本中分別獲得與R7723和金科IA完全匹配的片段數(shù)量。按種子純度=2x/(x+y) X 100% (x與y分別代表R7723與金科IA檢測(cè)到的片段數(shù)量)計(jì)算每一樣本的種子純度。按上述公式計(jì)算，這127個(gè)品種的平均純度為98. 67%，變異幅度為94. 72%_99. 98%。共有4個(gè)樣本的純度低于96%，為不合格種子，應(yīng)轉(zhuǎn)為商品糧食銷售，其余123個(gè)樣本純度均大于96%，可以進(jìn)入正常的種子銷售環(huán)節(jié)。實(shí)施例2本實(shí)施例的檢測(cè)方法與實(shí)施例I基本相同，所不同的是步驟(2)中DNA提取的步驟是種子發(fā)芽生長至第7-10天時(shí)，已有I片葉片長出，此時(shí)選取3000個(gè)小苗，每棵小苗取I片葉片，按植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，天更，北京)操作手冊(cè)分離純化基因組DNA，提取每一葉片的DNA，再對(duì)DNA進(jìn)行定量抽取后再等量混合；利用ND2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定樣品濃度與純度。共獲得127份混合DNA樣品，分別代表了 127個(gè)抽樣樣本。以上所述的實(shí)施例，只是本發(fā)明較優(yōu)選的具體實(shí)施方式
的一種，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)進(jìn)行的通常變化和替換都應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)雜交水稻種子純度的方法，其特征在于，包括以下步驟根據(jù)種子純度要求，計(jì)算抽樣樣本量；等量抽樣并混合提取DNA或分別提取DNA后再等量混合；按檢測(cè)位點(diǎn)的堿基序列，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增檢測(cè)位點(diǎn)；回收并純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；利用擴(kuò)增產(chǎn)物建庫并進(jìn)行高通量測(cè)序；根據(jù)檢測(cè)位點(diǎn)序列比例,計(jì)算種子純度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)雜交水稻種子純度的方法，其特征在于，包括以下步驟 (O計(jì)算最小抽樣樣本量根據(jù)商品種子純度要求、設(shè)定的概率保障和允許的誤差，確定最小的樣本抽樣量； (2)DNA提取對(duì)每一植株，選取相同部位的等量材料混合后提取DNA ;或者，提取每一植株的DNA，再對(duì)DNA進(jìn)行定量抽取后再等量混合； (3 )擴(kuò)增并回收檢測(cè)位點(diǎn)按檢測(cè)位點(diǎn)的堿基序列，設(shè)計(jì)引物，對(duì)檢測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)包含等位位點(diǎn)的差異序列，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化； (4)建庫與高通量測(cè)測(cè)序按高通量測(cè)序流程分別構(gòu)建親本基因DNA文庫，ePCR并高通量測(cè)序； (5)種子純度的確定根據(jù)測(cè)序的結(jié)果，獲得父本與母本序列的片段數(shù)，由此推算種子純度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)雜交水稻種子純度的方法，包括以下步驟根據(jù)種子純度要求，計(jì)算抽樣樣本量。等量抽樣并混合提取DNA或分別提取DNA后再等量混合。按檢測(cè)位點(diǎn)的堿基序列，設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增檢測(cè)位點(diǎn)。回收并純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。利用擴(kuò)增產(chǎn)物建庫并進(jìn)行高通量測(cè)序。根據(jù)檢測(cè)位點(diǎn)序列比例，計(jì)算種子純度。本發(fā)明的突出特點(diǎn)是很好地滿足了商品雜交種子純度檢測(cè)中對(duì)檢測(cè)速度與準(zhǔn)確性的要求。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102912010SQ20121021081
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月25日
發(fā)明者彭海, 張靜, 周俊飛 申請(qǐng)人:海南廣陵高科實(shí)業(yè)有限公司, 江漢大學(xué)