一種促進(jìn)塊菌菌根苗交叉感染的培養(yǎng)基質(zhì)及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)塊菌菌根苗交叉感染的培養(yǎng)基質(zhì)及其使用方法，所述培養(yǎng)基質(zhì)包括泥炭土和珍珠巖，所述泥炭土與珍珠巖的體積比為2:1~3:1。本發(fā)明所述培養(yǎng)基質(zhì)能夠?yàn)榉N子發(fā)芽和幼苗的根系生長提供充足的營養(yǎng)，疏松、透氣性和保水性好有利于根系的發(fā)育，從而促進(jìn)塊菌菌根苗交叉感染效果，且原料易得，制備方法簡單；通過采用與本發(fā)明所述培養(yǎng)基質(zhì)配套使用的塊菌菌根苗交叉感染方法，可大量節(jié)約菌種量，并促進(jìn)塊菌菌根苗感染的效果，比現(xiàn)有的接種方式大大縮短感染所需時間。
【專利說明】一種促進(jìn)塊菌菌根苗交叉感染的培養(yǎng)基質(zhì)及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于塊菌的培育種植領(lǐng)域，涉及一種促進(jìn)塊菌菌根苗交叉感染的培養(yǎng)基質(zhì)及其使用方法。
技術(shù)背景
[0002]商業(yè)塊菌(truffle)作為世界頂級食材，在歐洲備受推崇。上世紀(jì)60年代開始，法國國家農(nóng)業(yè)研究所 Institut National de la Recherche Agronomique (INRA)，與意大利的科學(xué)家聯(lián)合開展了塊菌栽培研究工作，以拯救歐洲的塊菌產(chǎn)業(yè)。兩國科學(xué)家在做了大量卓有成效的研究工作之后，獲得了突破性的進(jìn)展，成功培育出了塊菌的菌根苗，并且掌握了大量擴(kuò)繁高品質(zhì)塊菌菌根苗的技術(shù)。直到1975年，意大利科學(xué)家，在世界上首次采用溫室培育塊菌菌根苗營造的塊菌人工林，產(chǎn)生了黑孢塊菌。這個結(jié)果無論在塊菌產(chǎn)業(yè)上，甚至在整個菌物學(xué)，菌根真菌栽培研究上，都是十分重大的進(jìn)展，同時也標(biāo)志著人工的方式，將可能使塊菌產(chǎn)業(yè)化。1979年，同樣的結(jié)果在法國也被完成。之后，法國科學(xué)家和意大利科學(xué)家發(fā)育了，用iTuber meIanosporum)子囊孢子接種橡樹和榛子的技術(shù),開始了塊菌產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。國內(nèi)90年代開始塊菌栽培技術(shù)的研究，目前已有零星報(bào)道，從宿主植物的篩選，菌根苗接種技術(shù)，到檢測技術(shù)已經(jīng)在很多科研單位實(shí)現(xiàn)，為塊菌產(chǎn)業(yè)化奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。但是常規(guī)的接種技術(shù)都是用孢子粉對單顆無菌苗接種，耗用菌種量較大，對于珍稀的塊菌種子，特別是歐洲塊菌，價(jià)格就過于昂貴。交叉感染技術(shù)可以有效節(jié)約菌種，但目前將交叉感染技術(shù)用于培育塊菌菌根苗的研究還比較少，目前還未有專門用于塊菌菌根苗交叉感染的培養(yǎng)基質(zhì)，交叉感染的效果也還有待提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對上述問題，本發(fā)明提出了一種促進(jìn)塊菌菌根苗交叉感染的培養(yǎng)基質(zhì)。
`[0004]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種促進(jìn)塊菌菌根苗交叉感染的培養(yǎng)基質(zhì)，包括泥炭土和珍珠巖，所述泥炭土與珍珠巖的體積比為2:廣3:1。該培養(yǎng)基質(zhì)通過泥炭土與珍珠巖的合理配比，利用泥炭土中豐富的腐殖質(zhì)可以為塊菌和樹苗的生長尤其是樹根的發(fā)育提供大量的營養(yǎng)，同時泥炭土具有疏松、透氣的特點(diǎn)，有利于須根的生長，從而有利于樹苗之間的交叉感染，提高感染率并縮短感染時間；添加適量的珍珠巖還可以進(jìn)一步提高培養(yǎng)基質(zhì)的疏松、透氣性，并能夠提高培養(yǎng)基質(zhì)的保水性。
[0005]作為可選方式，所述培養(yǎng)基質(zhì)中泥炭土與珍珠巖的體積比為7:3。
[0006]作為可選方式，所述培養(yǎng)基質(zhì)中還含有生根粉,所述生根粉的質(zhì)量占培養(yǎng)基質(zhì)總質(zhì)量的0.0 pr0.1%。通過添加適量的生根粉，可以進(jìn)一步促進(jìn)宿主植株根系的發(fā)展，提高交叉感染效果。
[0007]作為可選方式，所述培養(yǎng)基質(zhì)中還含有保水劑，所述保水劑的干重占培養(yǎng)基質(zhì)總質(zhì)量的59TlO%。通過添加保水劑可進(jìn)一步提升培養(yǎng)基質(zhì)的保水性，使培養(yǎng)基質(zhì)具有更好的吸收存儲并緩慢釋放水分的功能。
[0008]作為可選方式，所述培養(yǎng)基質(zhì)的制備方法為:按照配比將原料混合均勻，在126°C下滅菌3個小時，自然冷卻，在無菌環(huán)境中放置一周后待用。
[0009]本發(fā)明還提供了上述培養(yǎng)基質(zhì)的使用方法，即將其用于塊菌菌根苗的交叉感染接種，具體步驟包括:
1)宿主植物種子的收集與處理:收集并挑選優(yōu)質(zhì)的宿主植物種子進(jìn)行清洗和滅菌處
理；
2)塊菌菌種的收集與處理:收集成熟的塊菌子實(shí)體,清洗滅菌后,加水粉碎成孢子懸浮
液；
3)培養(yǎng)基質(zhì)的滅菌處理；
4)播種及接種:將經(jīng)步驟I)處理后的宿主植物種子和經(jīng)步驟2)處理后的塊菌菌種混合播種到滅菌處理后的培養(yǎng)基質(zhì)中，用無菌水一次灌透，放置無菌培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度控制在25.1-28.5°C，每周澆水 2-3 次；
5)菌根苗的培育:培養(yǎng)2~4個月后取出部分樹苗進(jìn)行移栽，將其余的樹苗保留在培養(yǎng)基質(zhì)中，并重新播入經(jīng)步驟I)處理后的宿主植物種子，繼續(xù)培養(yǎng)2~4個月后，重復(fù)上述移栽和播種操作。
[0010]在上述方法中，通過保留部分樹苗，然后播入新的宿主植物種子，可以使保留的菌根苗交叉感染新生的樹苗，從而大量節(jié)約菌種，上述步驟5)可以循環(huán)操作從而持續(xù)培養(yǎng)菌根苗；而采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基質(zhì)可以有效提高感染效果，并保證營養(yǎng)供應(yīng)。
[0011]作為可選方式，在上述方法中，所述步驟4)和5)中還可以在播種培養(yǎng)2個月后，采用尿素質(zhì)量百分含量為0.1%的尿素稀溶液澆灌一次。通過施加少量尿素可以促進(jìn)樹苗根系的發(fā)展，有利于提聞感染率。
[0012]作為可選方式，在上述方法中，所述取出移栽部分的樹苗占樹苗總數(shù)的一半，所述移出的樹苗與保留的樹苗相間隔。間隔取苗有利于交叉感染的進(jìn)行，保留一半的樹苗也更有利于交叉感染，且有利于持續(xù)產(chǎn)出菌根苗。
[0013]作為可選方式，在上述方法中，在所述步驟2)中將所述孢子懸浮液與發(fā)好水的保水劑混合然后不斷添加無菌水，直到保水劑達(dá)到飽和的吸水能力，使孢子懸浮液將被均勻地吸附到保水劑表面。使塊菌菌種被均勻地吸附到保水劑表面有利于菌種充分利用保水劑中的水分。作為進(jìn)一步的可選方式，所述步驟4)具體為:在底部有孔的播種盆內(nèi)鋪墊5cm厚的滅菌培養(yǎng)基質(zhì)，然后鋪墊一層2-3cm厚的吸附了塊菌孢子的保水劑，在保水劑上覆蓋一層3cm厚的滅菌培養(yǎng)基質(zhì)，然后播入處理好的宿主植物種子，最后在種子表面覆蓋一層2cm厚的滅菌培養(yǎng)基質(zhì)，用無菌水一次灌透，放置無菌培養(yǎng)室培養(yǎng)。溫度控制在25.1-28.5°C，每周澆水2-3次。菌種與宿主種子分層布置，使菌種位于宿主種子的下層更有利于菌種感染宿主的根系，提聞菌種的利用率。
[0014]作為可選方式，在上述方法中，所述步驟I)中的宿主植物種子包括榛子種子和松樹種子，榛子種子和松樹種子的數(shù)量比例為1:400"!: 600 ;所述步驟5)中取出移栽部分的樹苗均為松樹苗，榛子樹苗全部保留，重新播入的宿主植物種子均為松樹種子。榛子樹苗根系發(fā)達(dá)，根系生長快，且易存活，在播種并保留少量榛子樹苗，作為接種源更有利于交叉感染。[0015]作為可選方式，在上述方法中，所述步驟I)中宿主植物種子的收集與處理方法具體為:收集良種的松樹種子，以及當(dāng)年優(yōu)質(zhì)的榛子種子，松樹種子用水除去空殼后晾干，裝在玻璃罐中常溫儲藏備用；榛子種子用水除去不飽滿和霉?fàn)€的種子后，裝于瓶中3-8°C低溫冷藏；將兩種種子用0.1%的高錳酸鉀液浸泡處理30min后，用自來水沖洗去表面殘留的高錳酸鉀溶液,然后再用清水浸泡1-3天,再對榛子種子脫殼并在50ppm的赤霉酸(GA)溶液中再浸泡20小時。
[0016]作為可選方式，在上述方法中，所述步驟2)中的塊菌菌種的收集與處理方法具體為:在塊菌成熟的季節(jié)收集成熟、直徑在3-5cm、無損傷、香味相對較濃的歐洲夏塊菌和歐洲黑孢塊菌子實(shí)體，洗干凈，晾干后，在75%的酒精內(nèi)浸泡3min，然后在酒精燈上漂燒滅菌，保存于3-5°C的溫度下備用；將塊菌用打漿機(jī)添加無菌水均勻打漿，制成塊菌孢子懸浮液。
[0017]作為可選方式，本發(fā)明所述塊菌為中華塊菌、印度塊菌、歐洲夏塊菌和歐洲黑孢塊菌中的任意一種。
[0018]作為可選方式，所述宿主植株為云南松，華山松，滇榛或櫟類等常見的塊菌宿主植株中的至少一種。
[0019]本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0020]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明所述培養(yǎng)基質(zhì)能夠?yàn)榉N子發(fā)育和幼苗及根系生長提供充足的營養(yǎng)，疏松、透氣性和保水性好有利于根系的發(fā)展，從而促進(jìn)塊菌菌根苗交叉感染效果，大大縮短感染所需時間，且原料易得，制備方法簡單。
[0021]本發(fā)明所述培養(yǎng)基質(zhì)的使用方法，可有效節(jié)約菌種，并促進(jìn)塊菌菌根苗交叉感染的效果。
[0022]【具體實(shí)施方式】:
以下通過實(shí)施例的【具體實(shí)施方式】再對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)當(dāng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。在不脫離本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)做的任何修改，以及根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的等同替換或者改進(jìn)，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。以下實(shí)施例中所用的泥炭土、珍珠巖、保水劑均為市售商品。以下實(shí)施例中所用的云南松，華山松，滇榛或櫟樹等宿主植株種子以及中華塊菌和印度塊菌菌種均采集自涼山州冕寧縣和會東縣，歐洲夏塊菌和歐洲黑孢塊菌來源于意大利都靈，還可選用采至攀枝花的攀枝花塊菌菌種。本領(lǐng)域技術(shù)人員可靈活選用其他來源的原料。
[0023]實(shí)施例1制備培養(yǎng)基質(zhì)
分別按照泥炭土與珍珠巖的體積比為2:1、7:3和3:1的比例將兩者均勻混合，得到三種培養(yǎng)基質(zhì)分別編號為I號、2號、3號。
[0024]取上述培養(yǎng)基加入生根粉，混合均勻，控制生根粉的質(zhì)量占培養(yǎng)基質(zhì)總質(zhì)量的
0.1%~1%。制得一系列含生根粉的培養(yǎng)基質(zhì)，取其中泥炭土與珍珠巖的體積比為7:3，生根粉的質(zhì)量占培養(yǎng)基質(zhì)總質(zhì)量的百分比分別為0.01%、0.05%,0.1%的三種培養(yǎng)基質(zhì)分別編號為4號、5號、6號。
[0025]取上述含生根粉和不含生根粉的兩個系列的培養(yǎng)基質(zhì)加入保水劑，混合均勻，控制保水劑的質(zhì)量占培養(yǎng)基質(zhì)總質(zhì)量的59TlO%，得一系列含保水劑的培養(yǎng)基質(zhì)，取其中泥炭土與珍珠巖的體積比為7:3，保水劑的質(zhì)量占培養(yǎng)基質(zhì)總質(zhì)量的百分比分別為5%、7%、10%的三種培養(yǎng)基質(zhì)分別編號為7號、8號、9號。
[0026]作為可選方式，可將上述培養(yǎng)基質(zhì)在126°C下滅菌3個小時，自然冷卻，在無菌環(huán)境中放置一周后待用。
[0027]實(shí)施例2:
將實(shí)施例1中所述培養(yǎng)用于塊菌菌根苗的交叉感染接種，分別取1-9號培養(yǎng)基質(zhì)作為9個實(shí)驗(yàn)組，并分別取河沙:蛭石:珍珠巖=1:1:1 (體積比)的混合基質(zhì)和純泥炭土作為對照組I和對照組2，各組均按照以下具體步驟操作:
1)宿主植物種子的收集與處理:收集并挑選優(yōu)質(zhì)的宿主植物(本例中選擇云南松)種子進(jìn)行清洗和滅菌處理；
2)塊菌菌種的收集與處理:收集成熟的塊菌子實(shí)體,清洗滅菌后,加水粉碎成孢子懸浮
液；
3)培養(yǎng)基質(zhì)的滅菌處理:將上述培養(yǎng)基質(zhì)在126°C下滅菌3個小時，自然冷卻，在無菌環(huán)境中放置一周后待用，如果在制備時已做過滅菌處理，此處可不再進(jìn)行滅菌處理；
4)播種及接種:將經(jīng)步驟I)處理后的宿主植物種子和經(jīng)步驟2)處理后的塊菌菌種混合播種到滅菌處理后的培養(yǎng)基質(zhì)中，用無菌水一次灌透，放置無菌培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度控制在25.1-28.5°C，每周澆水 2-3 次；
5)菌根苗的培育:培養(yǎng)2~4個月(每個實(shí)驗(yàn)組和對照組均設(shè)3個平行試驗(yàn)，分別在培養(yǎng)
2、3、4個月后取苗移栽)后取出部分樹苗進(jìn)行移栽，將其余的樹苗保留在培養(yǎng)基質(zhì)中，并重新播入經(jīng)步驟I)處理后的宿主植物種子，繼續(xù)培養(yǎng)2~4個月后，重復(fù)上述移栽和播種操作。
[0028]對取出的樹苗的根系進(jìn)行觀察，并統(tǒng)計(jì)感染率(被感染的樹苗數(shù)量占被移出樹苗數(shù)量的比例)。觀察結(jié)果顯示9個實(shí)驗(yàn)組中的樹苗的根系均比兩個對照組的根系發(fā)達(dá)，說明本發(fā)明所述的培養(yǎng)基有利于宿主植株根系的生長發(fā)育。9個實(shí)驗(yàn)組的樹苗的根系發(fā)達(dá)程度由優(yōu)到劣的順序?yàn)?6號、5號、4號、9號、8號、7號、2號、3號、I號，對照組2中由于培養(yǎng)基質(zhì)太緊實(shí)不利于根系的生長，樹苗移出也比較困難。可見生根粉的加入有利于促進(jìn)根系生長，保水劑的加入也能在一定程度上促進(jìn)根系生長。對感染的菌根苗進(jìn)行觀察，肉眼可以看到須根膨大，二叉分枝或者叢狀分枝，顯微鏡下可以看到感染的根部表面不規(guī)則的三角形或多角型網(wǎng)紋，實(shí)驗(yàn)組的菌根苗與兩個對照組的菌根苗相比，菌株更為粗壯、健康。各組的感染率結(jié)果如表1所示。從表中可以看出感染率的變化趨勢與樹苗的根系發(fā)達(dá)程度的變化趨勢基本一致，采用本發(fā)明所述的各種培養(yǎng)基質(zhì)可使樹苗在短期內(nèi)迅速大面積感染，可大大縮短感染所需時間。各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過幾輪的反復(fù)移出和重新播種后感染率變化均不明顯，可保持穩(wěn)定的持續(xù)交叉感染。
[0029]表1各培養(yǎng)基質(zhì)對應(yīng)的感染率
【權(quán)利要求】
1.一種促進(jìn)塊菌菌根苗交叉感染的培養(yǎng)基質(zhì)，其特征在于，所述培養(yǎng)基質(zhì)包括泥炭土和珍珠巖，所述泥炭土與珍珠巖的體積比為2: f 3:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基質(zhì)，其特征在于，所述泥炭土與珍珠巖的體積比為7:3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基質(zhì)，其特征在于，還含有生根粉，所述生根粉的質(zhì)量占培養(yǎng)基質(zhì)總質(zhì)量的0.01%~0.1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一個所述的培養(yǎng)基質(zhì)的使用方法，其特征在于，將其用于塊菌菌根苗的交叉感染接種，具體步驟包括: O宿主植物種子的收集與處理:收集并挑選優(yōu)質(zhì)的宿主植物種子進(jìn)行清洗和滅菌處理； 2)塊菌菌種的收集與處理:收集成熟的塊菌子實(shí)體,清洗滅菌后,加水粉碎成孢子懸浮液； 3)培養(yǎng)基質(zhì)的滅菌處理，所述培養(yǎng)基質(zhì)為權(quán)利要求1-3中任意一個所述的培養(yǎng)基質(zhì)； 4)播種及接種:將經(jīng)步驟I)處理后的宿主植物種子和經(jīng)步驟2)處理后的塊菌菌種混合播種到滅菌處理后的培養(yǎng)基質(zhì)中，用無菌水一次灌透，放置無菌培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度控制在25.1-28.5°C，每周澆水 2-3 次； 5)菌根苗的培育:培養(yǎng)2~4個月后取出部分樹苗進(jìn)行移栽，將其余的樹苗保留在培養(yǎng)基質(zhì)中，并重新播入經(jīng)步驟I)處理后的宿主植物種子，繼續(xù)培養(yǎng)2~4個月后，重復(fù)上述移栽和播種操作。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基質(zhì)的使用方法，其特征在于，所述取出移栽部分的樹苗占樹苗總數(shù)的一半，所述移出的樹苗與保留的樹苗相間隔。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基質(zhì)的使用方法，其特征在于，在所述步驟2)中將所述孢子懸浮液與發(fā)好水的保水劑混合然后不斷添加無菌水，直到保水劑達(dá)到飽和的吸水能力，使孢子懸浮液將被均勻地吸附到保水劑表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基質(zhì)的使用方法，其特征在于，所述步驟4)具體為:在底部有孔的播種盆內(nèi)鋪墊5cm厚的滅菌培養(yǎng)基質(zhì)，然后鋪墊一層2-3cm厚的吸附了塊菌孢子的保水劑，在保水劑上覆蓋一層3cm厚的滅菌培養(yǎng)基質(zhì)，然后播入處理好的宿主植物種子，最后在種子表面覆蓋一層2cm厚的滅菌培養(yǎng)基質(zhì)，用無菌水一次灌透，放置無菌培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度控制在25.1-28.5°C，每周澆水2-3次。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基質(zhì)的使用方法，其特征在于，所述步驟I)中的宿主植物種子包括榛子種子和松樹種子，榛子種子和松樹種子的數(shù)量比例為1:400~1:600 ;所述步驟5)中取出移栽部分的樹苗均為松樹苗，榛子樹苗全部保留，重新播入的宿主植物種子均為松樹種子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)基質(zhì)的使用方法，其特征在于，所述步驟I)中宿主植物種子的收集與處理方法具體為:收集良種的松樹種子，以及當(dāng)年優(yōu)質(zhì)的榛子種子，松樹種子用水除去空殼后晾干，裝在玻璃罐中常溫儲藏備用；榛子種子用水除去不飽滿和霉?fàn)€的種子后，裝于瓶中3-8°C低溫冷藏；將兩種種子用0.1%的高錳酸鉀液浸泡處理30min后，用自來水沖洗去表面殘留的高錳酸鉀溶液，然后再用清水浸泡1-3天，再對榛子種子脫殼并在50ppm的赤霉酸(GA)溶液中再浸泡20小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基質(zhì)的使用方法，其特征在于，所述步驟2)中的塊菌菌種的收集與處理方法具體為:在塊菌成熟的季節(jié)收集成熟、直徑在3-5cm、無損傷、香味相對較濃的歐洲夏塊菌和歐洲黑孢塊菌子實(shí)體，洗干凈，晾干后，在75%的酒精內(nèi)浸泡3min，然后在酒精燈上漂燒滅菌，保存于3-5°C的溫度下備用；將塊菌用打漿機(jī)添加無菌水均勻打漿，制成塊菌 孢子懸浮液。
【文檔編號】A01C1/00GK103749154SQ201410013248
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】簡體平, 簡瑕, 林強(qiáng), 簡維忠, 冉曉瀟 申請人:攀枝花市豐盛源農(nóng)林開發(fā)有限公司