一種馬精子低溫保存稀釋液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的一種馬精子低溫保存稀釋液，無菌操作，將糖鹽溶液與脫脂奶1:1充分混勻，用1mol/L鹽酸調(diào)整溶液pH值至6.9，最后用25%的葡萄糖溶液或雙蒸水調(diào)整溶液滲透壓至300mOsm/L，即制得;其中將碳酸氫鈉0.336-0.374g、羥乙基哌嗪乙磺酸4.766-4.975g、葡萄糖16.213-16.543g、乳糖45.399-45.423g、氯化鈉1.258-1.543g、氯化鉀0.348-0.375g、磷酸二氫鉀0.068-0.086g、硫酸鎂0.120-0.145g、氯化鈣0.133-0.154g、磷酸氫鈉0.113-0.124g、頭孢曲松鈉2-2.5g、兩性霉素B500-600ug依次溶解于800ml雙蒸水中，再加雙蒸水定容至1000ml，在超凈臺中用0.22um濾器過濾糖鹽溶液，制得無菌糖鹽溶液。
【專利說明】一種馬精子低溫保存稀釋液
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物精子低溫保存液的制作，與常規(guī)方法比，該方法制備的精稀釋液有效延長了馬精子體外存活的時間。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是世界上馬匹數(shù)量最多的國家，存欄量達(dá)600多萬匹，但馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展則相對滯后，然而在產(chǎn)業(yè)發(fā)展之初，如何將我國馬匹的數(shù)量優(yōu)勢轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)業(yè)優(yōu)勢是我國馬業(yè)工作者面對的重要課題。引進(jìn)外血大規(guī)模的改良我國馬匹生產(chǎn)性能是行之有效的方法，但改良面臨兩個主要問題:第一，受馬精液在體外保存時間所限，人工授精只能局限于種公馬飼養(yǎng)所在地，無法實現(xiàn)大規(guī)模、長距離、跨區(qū)域的品種改良，致使本已稀缺的種公馬資源不能得到有效利用。第二，由于母馬生理特殊性，人工授精過程中一個發(fā)情周期內(nèi)需要間隔24小時左右輸2-3次精，而一匹公馬的采精頻率一般為72小時，受精液體外保存技術(shù)水平所限，生產(chǎn)中均采用多匹公馬精液輸入一個母馬體內(nèi)，致使改良后代系譜混亂。在國外馬業(yè)發(fā)達(dá)國家，由于已開發(fā)出成熟的鮮精保存稀釋液，實現(xiàn)了鮮精全國范圍的定時配送和隨時供應(yīng)，不僅種公馬利用效率高而且系譜準(zhǔn)確，但是從國外進(jìn)口馬精液稀釋液價格昂貴，成功受孕一匹馬在稀釋液上需投入成本100元左右，大規(guī)模使用成本很高，因此開發(fā)自主產(chǎn)權(quán)、低成本的馬專用精子低溫保存稀釋液具有很好的應(yīng)用前景。
[0003]精液稀釋液為精子提供一個適合的營養(yǎng)及酸堿度環(huán)境，使其能較長時間在體外存活并保持受精能力。精液稀釋液中主要包括能量物質(zhì)、維持滲透壓所需的鹽類，維持穩(wěn)定酸堿度所需的電解質(zhì)及抗生素類物質(zhì)。目前報道較多的稀釋液有INRA82、Kenney、EZ-Mixin 及三種商品 化的稀釋液 INRA96 (IMV, Franch)> Gent (AbfullundLabortechnik GmbH&C0., Tiefenbach, Germany)>M1 (Abfullund Labortechnik GmbH&C0.Tiefenbach, Germany)。其中以法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)明的INRA82和INRA96(已被法國IMV卡蘇公司商品化)保存效果最好，應(yīng)用最廣泛。
[0004]專利文獻(xiàn)檢索披露:I)青島德瑞駿發(fā)生物科技有限公司申請的《馬屬動物精液稀釋基礎(chǔ)液及其配制方法和使用方法(CN102578079A)》。該專利稀釋液的構(gòu)成和各組分含量與法國已公開馬精液稀釋液IRNA82基本相同。2)塔里木大學(xué)申請的《馬屬動物精液保存稀釋液及其生產(chǎn)方法和使用方法(CN101647427)》由雙蒸水與葡萄糖、甘氨酸、青霉素、鏈霉素、卵黃構(gòu)成。本發(fā)明在這之前，申請的《一種馬精子冷凍保存液及其冷凍方法(CN103120155A)))是我們實驗室多年研究馬精子冷凍稀釋液的成果之一，該專利稀釋液僅僅適用于馬精子冷凍。
[0005]本發(fā)明從2006年開始進(jìn)行馬精子低溫保存稀釋液的研究工作，曾先后嘗試了應(yīng)用脫脂馬奶、Kenney、EZ-Mixin, INRA82等稀釋液配方進(jìn)行馬精子體外保存實驗，體外保存時間和保存效果得到了不斷提高，但均未能達(dá)到理想效果。2009年我們曾用100mL雙蒸水，6.5g葡萄糖、0.5g甘氨酸，20%蛋黃、加青霉素和鏈霉素的稀釋液對馬精子進(jìn)行過冷凍和低溫保存實驗，當(dāng)時結(jié)果表明“葡萄糖+甘氨酸+蛋黃稀釋液”是一種馬精子冷凍液的替代方案，但并不適合用于馬精子的低溫保存。受動物精子可以在母畜子宮和輸卵管內(nèi)長時間存活并保持高效的授精能力的啟發(fā)，結(jié)合之前實驗結(jié)論，反復(fù)模擬雌性動物輸卵管生理環(huán)境配制精子低溫保存液，取得了良好的實驗結(jié)果，為進(jìn)一步確證本稀釋液的保存效果，2013年從法國卡蘇公司購進(jìn)了一批INRA96馬鮮精保存稀釋液，進(jìn)行對比試驗，結(jié)果顯示，本稀釋液效果好于INRA96稀釋液的保存效果，具有重要的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于:提供的馬精子低溫保存液與常規(guī)方法比，該配方更加科學(xué)合理，其操作方法簡單、穩(wěn)定，技術(shù)效果尤其顯著。
[0007]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種馬精子低溫保存稀釋液，分步實施:
[0008]脫脂牛奶的制備:
[0009]將雙蒸水與食用菜籽油1:1混合，置于70°C、水浴3min，劇烈搖動5min，常溫靜止至水、油分離，棄水，如此再重復(fù)2次，在4500rpm條件下，離心5min，收集油；將收集的油與新鮮牛奶1:6混合，搖勻后置于70°C、水浴5min,劇烈搖動5min,在4500rpm條件下,離心20min，回收中層奶至玻璃瓶中，密封后放入高壓滅菌鍋中，90°C滅菌30min，備用；
[0010]糖鹽溶液的配制:
[0011]將碳酸氫鈉0.336-0.374g、羥乙基哌嗪乙磺酸4.766-4.975g、葡萄糖16.213-16.543g、乳糖 45.399-45.423g、氯化鈉 1.258-1.543g、氯化鉀 0.348-0.375g、磷酸二氫鉀0.068-0.086g、硫酸鎂0.120-0.145g、氯化鈣0.133-0.154g、磷酸氫鈉0.113-0.124g、頭孢曲松鈉2-2.5g、兩性霉素B500_600ug依次溶解于800ml雙蒸水中，再用1000ml容量瓶加雙蒸水定容至1000ml，在嚴(yán)格滅菌的超凈工作臺中用0.22um濾器過濾糖鹽溶液，制得無菌糖鹽溶液。
[0012]稀釋液的配置:
[0013]無菌操作，將糖鹽溶液與脫脂奶1:1充分混勻，用lmol/L鹽酸調(diào)整溶液pH值至6.9，最后用25%的葡萄糖溶液或雙蒸水調(diào)整溶液滲透壓至300m0sm/L，制得馬精子低溫保存稀釋液。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)原理與作用:受動物精子可以在母畜子宮和輸卵管內(nèi)長時間存活并保持高效的受精能力的啟發(fā)，我們反復(fù)模擬雌性動物輸卵管生理環(huán)境配制了該稀釋液，該液為精子提供一個適合的營養(yǎng)及酸堿度環(huán)境，使其在體外獲得一個最佳的生存條件，利用生物樣本低溫環(huán)境下酶系低活性，消耗能量小的特點最大限度的延長了精子的體外存活。
[0015]本方法深層次挖掘各類化合物組合的生化特性，高效模擬雌性動物輸卵管生理特性，為馬精子體外存活創(chuàng)造了一個最佳的生理環(huán)境，這些技術(shù)改進(jìn)和創(chuàng)新對于馬精子低溫保存效果起著決定性作用，實驗驗證本方法明顯優(yōu)于現(xiàn)已報道馬精子低溫方法，并略高于國外進(jìn)口產(chǎn)品低溫保存效果，應(yīng)用該稀釋液馬精子在4°C保存168-196h后，活力仍可達(dá)到0.3以上，極大的提高了馬低溫精液人工授精的效率，彰顯技術(shù)進(jìn)步。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]下面結(jié)合附圖對發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0017]附圖1為馬精子保存后活力(motile)變化曲線圖；[0018]如圖所示:在三種不同行稀釋液中保存0-168小時后活力(motile)的變化。
[0019]附圖2為馬精子保存后直線前進(jìn)精子百分率(progressive motile)變化曲線圖；
[0020]如圖所示:在三種不同行稀釋液中保存0-168小時后直線前進(jìn)精子百分率(progressive motile)的變化。
[0021]附圖3為馬精子保存后精子運動速度(Path Velocity)變化曲線圖；
[0022]如圖所示:在三種不同行稀釋液中保存0-168小時后快速運動精子比例(RapidMotile)變化。
[0023]附圖4為馬精子保存后快速運動精子比例(Rapid Motile)變化曲線圖；
[0024]如圖所示:在三種不同行稀釋液中保存0-168小時后快速運動精子比例(RapidMotile)變化。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例對發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0026]實施例
[0027]一、稀釋液的配制
[0028]本稀釋液主要由 脫脂牛奶和糖鹽溶液構(gòu)成。
[0029]1、脫脂牛奶的制備
[0030]用雙蒸水與食用菜籽油1:1混合，70°C水浴3min，劇烈搖動5min，常溫靜止至水、油分離,去除水,如此再重復(fù)2次；4500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5min，收集油；將收集油與新鮮牛奶
I:6混合，搖勻后置于70°C、水浴5min，劇烈搖動5min，4500轉(zhuǎn)/分鐘，離心20min，回收中層奶至玻璃瓶中，密封后放入高壓滅菌鍋中90°C、滅菌30min，備用；
[0031]2、糖鹽溶液的配制
[0032]配制1:取碳酸氫鈉0.336g、輕乙基哌嗪乙磺酸4.766g、葡萄糖16.213g、乳糖45.399g、氯化鈉1.258g、氯化鉀0.348g、磷酸二氫鉀0.068g、硫酸鎂0.120g、氯化鈣0.133g、磷酸氫鈉0.113g、頭孢曲松鈉2g、兩性霉素B500ug依次溶解于800ml雙蒸水中，再用1000ml容量瓶加雙蒸水定容至1000ml，在嚴(yán)格滅菌的超凈工作臺中用0.22um濾器過濾糖鹽溶液，制得無菌糖鹽溶液；
[0033]或配制2:取碳酸氫鈉0.374g、輕乙基哌嗪乙磺酸4.975g、葡萄糖16.543g、乳糖45.423g、氯化鈉1.543g、氯化鉀0.375g、磷酸二氫鉀0.086g、硫酸鎂0.145g、氯化鈣
0.154g、磷酸氫鈉0.124g、頭孢曲松鈉2.5g、兩性霉素B600ug依次溶解于800ml雙蒸水中，再用1000ml容量瓶加雙蒸水定容至1000ml，在嚴(yán)格滅菌的超凈工作臺中用0.22um濾器過濾糖鹽溶液，制得無菌糖鹽溶液；
[0034]或配制3:取碳酸氫鈉0.350g、輕乙基哌嗪乙磺酸4.800g、葡萄糖16.300g、乳糖45.410g、氯化鈉1.300g、氯化鉀0.360g、磷酸二氫鉀0.070g、硫酸鎂0.130g、氯化鈣
0.140g、磷酸氫鈉0.118g、頭孢曲松鈉2.3g、兩性霉素B550ug依次溶解于800ml雙蒸水中，再用1000ml容量瓶加雙蒸水定容至1000ml，在嚴(yán)格滅菌的超凈工作臺中用0.22um濾器過濾糖鹽溶液，制得無菌糖鹽溶液。
[0035]3、稀釋液的配置:
[0036]無菌操作，將糖鹽溶液與脫脂奶1:1充分混勻，用lmol/L鹽酸調(diào)整溶液pH值至6.9，最后用25%的葡萄糖溶液或雙蒸水調(diào)整溶液滲透壓至300m0sm/L，制得馬精子低溫保存稀釋液。
[0037]二、稀釋液的使用方法
[0038]采精前20min，調(diào)整水浴鍋水溫至37°C，放入稀釋液及待裝精液的離心管預(yù)熱。
[0039]收集到精液后與預(yù)熱稀釋液1:1混合，待溫度降至22°C后，置于離心機(jī)中離心(750g離心力)20min,收集下層濃密精子，而后根據(jù)需要用稀釋液進(jìn)行稀釋(精子最終濃度不得高于8億/ml)，置于4°C恒溫冰箱保存。
[0040]三、藥品及設(shè)備來源
[0041]本稀釋液所用藥品中除脫脂牛奶為自制，兩性霉素購自上海生工生物有限責(zé)任公司，頭孢曲松鈉購自哈爾濱制藥六廠，其余藥品均購自sigma公司。
[0042]配置稀釋液所用到的儀器設(shè)備:SZ_93型號自動雙蒸水儀購自上海宇輝生化儀器有限公司，HERAEUS MULTIFUGEXR型離心機(jī)購自Thermo scientific公司、pH試紙購自杭州富陽特種紙業(yè)有限公司，LGJ-10臺式低溫干燥機(jī)購自鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司。BS-100冰點滲透壓測定儀購自上海復(fù)旦依達(dá)醫(yī)療器械有限公司
[0043]本方法精子采集的過程遵循自然規(guī)律，用人工假陰道誘導(dǎo)雄性動物射精，不會對動物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
[0044]本發(fā)明的技術(shù)效果驗證: [0045]本稀釋液與進(jìn)口液IRNA96 (圖中簡稱96液)相比，4°C保存0_168小時后精子活力(Motile)、直線前進(jìn)精子比例(Progressive Motile)、精子運動速率(path velocity)、快速運動精子比例(Rapid Motile)四個精子質(zhì)量參數(shù)兩中稀釋液間無差異。
[0046]從生產(chǎn)成本來看，本稀釋液每100mL成本約為10元人民幣，而相同體積INRA96市場售價為105元，相比之下具有明顯的價格優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用前景。
[0047]本稀釋液與INRA82稀釋液(CN102578079A專利類似液)相比，4°C保存0-168小時后精子活力(Motile)、直線前進(jìn)精子比例(Progressive Motile)、精子運動速率(pathvelocity)、快速運動精子比例(Rapid Motile)四個精子質(zhì)量參數(shù),本稀釋液保存48小時后均顯著高于INRA82稀釋液，這一數(shù)據(jù)充分展現(xiàn)了本稀釋液的技術(shù)優(yōu)勢。
【權(quán)利要求】
1.一種馬精子低溫保存稀釋液，其特征在于:分步實施: 脫脂牛奶的制備: 將雙蒸水與食用菜籽油1:1混合，置于70°C、水浴3min，劇烈搖動5min，常溫靜止至水、油分離，棄水，如此再重復(fù)2次，在4500rpm條件下，離心5min，收集油；將收集的油與新鮮牛奶1:6混合,搖勻后置于70°C、水浴5min,劇烈搖動5min,在4500rpm條件下,離心20min，回收中層奶至玻璃瓶中，密封后放入高壓滅菌鍋中，90°C滅菌30min，備用； 糖鹽溶液的配制: 將碳酸氫鈉0.336-0.374g、羥乙基哌嗪乙磺酸4.766-4.975g、葡萄糖16.213-16.543g、乳糖 45.399-45.423g、氯化鈉 1.258-1.543g、氯化鉀 0.348-0.375g、磷酸二氫鉀0.068-0.086g、硫酸鎂0.120-0.145g、氯化鈣0.133-0.154g、磷酸氫鈉0.113-0.124g、頭孢曲松鈉2-2.5g、兩性霉素B 500-600 Ug依次溶解于800ml雙蒸水中，再用1000ml容量瓶加雙蒸水定容至1000ml，在嚴(yán)格滅菌的超凈工作臺中用0.22um濾器過濾糖鹽溶液，制得無菌糖鹽溶液； 稀釋液的配置: 無菌操作，將糖鹽溶液與脫脂奶1:1充分混勻，用lmol/L鹽酸調(diào)整溶液pH值至6.9，最后用25%的葡萄糖溶液或雙蒸水調(diào)整溶液滲透壓至300 mOsm/L，制得馬精子低溫保存稀釋液。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所·述的稀釋液，其特征在于:稀釋液選用的原料均為市售產(chǎn)品。
【文檔編號】A01N1/02GK103843758SQ201410057055
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月19日
【發(fā)明者】毋狀元, 鄭新寶, 霍飛, 陳靜波, 董紅, 張國庭, 羅永明, 李海, 徐文慧, 于偉浩 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院畜牧研究所