柑桔接穗預(yù)處理促使復(fù)合感染病原脫除的技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了柑桔接穗預(yù)處理促使復(fù)合感染病原脫除的技術(shù)，采集柑桔枝條，將柑桔枝條修剪去掉葉片和葉柄，用次氯酸鈉(NaClO)水溶液表面消毒；對(duì)表面消毒后的柑桔枝條接穗進(jìn)行分子檢測(cè)；當(dāng)檢測(cè)過的柑桔枝條感染HLB和CTV病毒時(shí)，對(duì)接穗材料進(jìn)行藥劑脫毒處理，獲得無病毒芽，完成柑桔接穗預(yù)處理脫毒的步驟。本發(fā)明的有益效果是通過小分子殺細(xì)菌三氯生（TCL）及幾種抗生素處理，獲得脫除柑桔衰退?。–TV）和柑桔黃龍病（HLB）病原的無病毒莖尖材料。脫毒效率高，效果好。為進(jìn)一步莖尖微芽嫁接或嫩芽嫁接提供了無病毒的莖尖材料。
【專利說明】柑桔接穗預(yù)處理促使復(fù)合感染病原脫除的技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于無病毒良種繁育【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及柑桔接穗預(yù)處理促使復(fù)合感染病原脫除的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]柑桔脫毒技術(shù)是實(shí)現(xiàn)無病毒良種繁育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是果樹栽培、育種及引種推廣領(lǐng)域中必備的配套技術(shù)。伴隨著氣候變化及國內(nèi)外柑桔品種引進(jìn)和交流的增多，柑桔病毒及類似病毒的感染日趨嚴(yán)重，復(fù)合感染情況加劇，因此，研究新型、高效、實(shí)用的柑桔脫毒技術(shù)具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。[0003]1.柑桔病毒及類似病毒病的危害:柑橘種植面積和產(chǎn)量逐年增加，在栽培過程中，柑橘多采用無性繁殖，往往易感染一種或幾種病毒，病毒的危害已成為制約柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙。柑橘黃龍病(Huanglongbing, HLB)是我國重大的植物檢疫性病害,是當(dāng)前柑橘生產(chǎn)上來勢(shì)最兇、波及面最廣、防治最難的傳染性和毀滅性病害(Βον?，2006 ；Grafton-Cardwell et al., 2013)。柑桔木風(fēng)是柑桔黃龍病重要的傳播媒介。HLB由一種特殊的韌皮部桿菌引起，同行研究認(rèn)為:HLB病原菌Candidatus Liberibacter是一種革蘭氏陰性菌，屬于變形細(xì)菌門(Proteobacteria), α -變形細(xì)菌亞綱(Alpha-Proteobacteria)。它侵染主要的柑橘主栽品種和近緣屬植物，它可以通過菟絲子傳播給指示植物長春花及一些敏感的植物，如:煙草和番茄等非蕓香科植物。通過16SrDNA序列分析證明，韌皮部桿菌與木豆叢枝病植原體的相似性達(dá)到99% (Teixeira et al.，2008)，在世界范圍內(nèi)，柑橘黃龍病迅速蔓延，迄今為止，尚沒有一種能根除柑橘黃龍病的有效方法，在柑橘品種資源中也未發(fā)現(xiàn)完全抗病的品種。受全球性暖冬氣候影響，傳病蟲媒越冬逐年北移，帶病(蟲)柑桔種苗的引種增多而導(dǎo)致該病發(fā)生面積有逐年擴(kuò)大的趨勢(shì)。柑桔衰退病(Citrus tristezavirus, CTV)，是世界性的柑桔病毒病害，廣泛分布于世界各柑桔產(chǎn)地，對(duì)全世界柑桔產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。最早它是在南美洲的阿根廷和巴西發(fā)現(xiàn)的，先后有50多個(gè)國家和地區(qū)有此病的發(fā)生，20多個(gè)國家將其列為檢疫對(duì)象。在我國福建、浙江及廣東等柑桔主要產(chǎn)區(qū)分布相當(dāng)普遍。此外，柑橘黃龍病和柑橘衰退病復(fù)合感染現(xiàn)象日益嚴(yán)重。
[0004]2.HLB的防治和檢測(cè):注射農(nóng)用四環(huán)素曾經(jīng)被用于防治黃龍病，在田間緩解癥狀，恢復(fù)產(chǎn)量有一定的作用，但是，成本過高，在我國廣西省，及時(shí)清除病株減少病原，采用聯(lián)防的措施，HLB的控制產(chǎn)生了良好的效果。在巴西，通過清除病株和使用殺蟲劑控制木虱，黃龍病的防治已經(jīng)取得一定的成果(Βον?，2006)。另外，選用相對(duì)抗性強(qiáng)的品種、加強(qiáng)柑桔木虱防治、推廣無毒苗木、間種番石榴趨避木虱等園藝手段，也是可以減少黃龍病的為害(Morgan et al.，2009)。但是，在大規(guī)模的新建果園，采用無病毒苗木仍是至關(guān)重要的方法。目前，柑橘黃龍病PCR檢測(cè)主要根據(jù)16SrDNA和β-操縱子設(shè)計(jì)引物進(jìn)行(Bove andAyres2007)，實(shí)時(shí)定量PCR也被廣泛應(yīng)用于柑橘黃龍病的檢測(cè)(Li et al,2008 ；Deng etal，2008)，靈敏度高，準(zhǔn)確性高，對(duì)于田間感病狀況能快速地監(jiān)控。
[0005]3.柑桔無病毒良種繁育的重要性:各級(jí)政府十分重視優(yōu)良品種的引進(jìn)和推廣，先后投入許多資金從國外引進(jìn)各類柑橘優(yōu)良品種。但是無病毒工廠化育苗系統(tǒng)有限的使用，大大影響了新品種的推廣速度。傳統(tǒng)的柑橘品種育苗主要是在大田中進(jìn)行操作，由于苗木管理制度不完善，果農(nóng)自繁自育的現(xiàn)象普遍，這樣，不能保證品種的健康、純正和苗木質(zhì)量。建立無病毒苗木繁育體系，采用工廠化育苗方法是解決柑橘品種結(jié)構(gòu)調(diào)整中優(yōu)良種苗供不應(yīng)求問題的關(guān)鍵手段。歐美各國早在上世紀(jì)80年代，就開始研究果樹的脫毒技術(shù)，獲得了一大批無病毒苗木。90年代以來，又著重開展果樹良種繁育體系建設(shè)，推行果樹無病毒化栽培。
[0006]4.研究新型的高效的脫毒技術(shù)的必要性:除了昆蟲作為傳播媒介，柑橘病毒廣泛傳播的另一個(gè)主要原因是帶毒接穗的使用，這就需要對(duì)優(yōu)良品種進(jìn)行脫毒，從采穗圃再獲得無病毒接穗，擴(kuò)繁后建立健康無毒的柑橘園，因此，研究新型的、高效的、操作方便的脫毒技術(shù)十分必要，有效的脫毒方法對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。莖尖嫁接脫毒的原理是:根據(jù)一般病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，頂端生長點(diǎn)的分生組織不帶毒或疏導(dǎo)組織不健全，病毒不能上運(yùn)，莖尖中檢查不到病毒，從而通過莖尖嫁接脫毒得到無毒苗木。已有研究表明，黃龍病和哀退病的脫毒率分別為100%和78%。(宋端琳等，1990)。含有3個(gè)和4個(gè)葉原基的莖尖嫁接獲得的試管苗其HLB脫毒率分別為95.7%和73%，含2個(gè)葉原基條件下，采用“一株兩芽法”微芽嫁接可以獲得的STG成活率僅為47.7%(姜玲等，2007)。利用50°C濕熱空氣、相對(duì)濕度95%處理苗木60分鐘，促使其抽出新梢，再利用新梢莖尖進(jìn)行微芽嫁接，明顯提高嫁接成活率(譚祖國等，2011)。
[0007]盡管莖尖微芽嫁接技術(shù)是一種有效的脫毒技術(shù)，客觀地講，由于在不同的季節(jié)病原濃度存在著差異，加上同時(shí)有兩種病原感染的影響，單獨(dú)使用莖尖微芽嫁接時(shí)，就面臨著新的挑戰(zhàn):(1)莖尖來源受到季節(jié)的影響，在四季分明的一些省份，在自然狀況下，新梢集中在春季產(chǎn)生，夏季有部分芽的產(chǎn)生，而秋冬季節(jié)通常沒有柑桔莖尖材料來滿足柑桔脫毒的需要。這就需要我們?nèi)藶榈夭扇〈胧?，促進(jìn)莖尖新芽的產(chǎn)生；(2)當(dāng)病原濃度較高時(shí)，脫毒效率降低；(3)當(dāng)采用小于3個(gè)葉原基微芽嫁接時(shí)，試管苗成活率低，但芽越大，脫毒效果越差；(4)生產(chǎn)上經(jīng)常不能提供足夠的苗木作脫毒材料，需要提供接穗作為脫毒原始材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供柑桔接穗預(yù)處理促使復(fù)合感染病原脫除的技術(shù)，解決了不同季節(jié)提供柑桔接穗材料時(shí)，材料病原濃度較高時(shí)，脫毒效率降低的問題。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是按照以下步驟進(jìn)行:
[0010]步驟1:采集柑桔枝條，將柑桔枝條修剪去掉葉片和葉柄，用次氯酸鈉(NaClO)水溶液表面消毒；
[0011]步驟2:對(duì)表面消毒后的柑桔枝條接穗進(jìn)行分子檢測(cè)；
[0012]步驟3:當(dāng)檢測(cè)過的柑桔枝條僅受到HLB感染時(shí)，對(duì)接穗材料進(jìn)行如下藥劑脫毒處理:
[0013]方法一:接穗扦插于含有2-5 μ M TCL溶液和1/4MS培養(yǎng)基的高壓滅菌的蛭石中，用保鮮膜封住，放置在培養(yǎng)室中，催芽12天后獲得無病毒芽，完成柑桔接穗預(yù)處理脫毒的步驟，莖尖材料可以用于后續(xù)的莖尖嫁接或嫩芽嫁接繁殖；
[0014]或方法二:接穗在含有30-50 μ M的TCL溶液或接穗在含有0.75-1.5g/l阿莫西林或0.75g/l四環(huán)素溶液中浸泡lh，然后，扦插于經(jīng)過高壓滅菌的蛭石中，蛭石中含有1/4MS培養(yǎng)基，扦插時(shí)用保鮮膜封住，放置在培養(yǎng)室中，催芽12天后獲得無病毒芽，完成柑桔接穗預(yù)處理脫毒的步驟；
[0015]步驟4:當(dāng)檢測(cè)過的柑桔枝條同時(shí)受到HLB和CTV感染時(shí)，對(duì)接穗材料進(jìn)行如下藥劑脫毒處理:將枝條浸泡于含有30-50 μ M的TCL溶液處理Ih或者將枝條浸泡于含有0.75g/L四環(huán)素處理枝條lh。然后，扦插于經(jīng)過高壓滅菌的蛭石中，蛭石中含有1/4MS培養(yǎng)基，扦插時(shí)用保鮮膜封住，放置在培養(yǎng)室中，催芽12天后獲得無病毒芽，完成柑桔接穗預(yù)處理脫毒的步驟。
[0016]本發(fā)明的特點(diǎn)還在于步驟I中消毒采用2%的次氯酸鈉(NaClO)水溶液對(duì)枝條表面消毒5min。步驟3和步驟4中，培養(yǎng)室設(shè)定溫度28°C、光照20001x、光照時(shí)間14h/d。
[0017]本發(fā)明的有益效果是通過小分子殺細(xì)菌三氯生(TCL)及幾種抗生素處理，獲得脫除柑桔衰退病(CTV)和柑桔黃龍病(HLB)病原的無病毒莖尖材料。脫毒效率高，效果好。為進(jìn)一步莖尖微芽嫁接或嫩芽嫁接提供了無病毒的莖尖材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本 發(fā)明實(shí)施步驟流程圖；
[0019]圖2供試綠橙樣品處理之前的柑桔黃龍病Real-time PCR檢測(cè)；
[0020]圖3接穗預(yù)處理及催芽試驗(yàn)；
[0021]圖4供試綠橙樣品處理后的柑桔黃龍病Real-time PCR檢測(cè)；
[0022]圖5處理前和處理后的綠橙嫩芽CTV檢測(cè)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0024]如圖1所示為本發(fā)明方法步驟，本發(fā)明主要在兩個(gè)方面處理:
[0025](I)接穗預(yù)處理脫毒:接穗預(yù)處理是采用不同濃度的化學(xué)小分子殺細(xì)菌三氯生(TCL)及幾種抗生素進(jìn)行預(yù)處理，在柑桔莖尖萌發(fā)之前和之后，對(duì)材料分別進(jìn)行HLB和CTV的病原分子檢測(cè)，探討不同處理去除HLB和CTV病原，或降低病原濃度的效果。從中篩選出有效的小分子殺細(xì)菌或殺病毒劑或篩選出有效的抗生素，并獲得最佳的處理濃度和處理方法。經(jīng)過藥劑處理并檢測(cè)后，如果獲得的是無毒接穗，可以直接采用常規(guī)嫁接繁殖苗木。大大縮短了繁殖健康苗木需要的時(shí)間。
[0026](2)催芽處理及時(shí)獲得莖尖接穗:在適宜的溫度和濕度條件下，接穗預(yù)處理脫毒可能在催芽過程中進(jìn)行，即:邊用藥劑進(jìn)行脫毒處理，邊進(jìn)行催芽試驗(yàn)；也可能先進(jìn)行藥劑的預(yù)處理，再進(jìn)行催芽處理。其目的是打破季節(jié)的限制，在不同的季節(jié)，獲得莖尖接穗，有利于莖尖微芽嫁接脫毒操作。在接穗預(yù)處理和莖尖微芽嫁接的雙重脫毒作用下，獲得健康的柑桔苗木。
[0027]本發(fā)明步驟如下:
[0028]步驟1:接穗材料的采集:
[0029]采集柑桔枝條，將柑桔枝條修剪去掉葉片和葉柄，用2%的次氯酸鈉(NaClO)水溶液表面消毒5min，用水沖洗干凈；[0030]步驟2:對(duì)表面消毒后的柑桔枝條接穗進(jìn)行分子檢測(cè)；
[0031]步驟3:當(dāng)檢測(cè)過的柑桔枝條僅受到HLB感染時(shí)，對(duì)接穗材料進(jìn)行如下藥劑脫毒處理:
[0032]方法一:接穗扦插于含有2-5 μ MTCL溶液和1/4MS培養(yǎng)基的高壓滅菌的蛭石中，用保鮮膜封住，保溫保濕，放置在培養(yǎng)室中，溫度28°C，光照20001x，光照時(shí)間14h/d，催芽12天后，完成柑桔接穗預(yù)處理脫毒的步驟。莖尖材料可以用于后續(xù)的莖尖嫁接或嫩芽嫁接繁殖。
[0033]或方法二:接穗在含有30 — 50 μ M的TCL溶液或接穗在含有0.75 一 1.5g/l阿莫西林或0.75g/l四環(huán)素溶液中浸泡lh，然后，扦插于經(jīng)過高壓滅菌的蛭石中(蛭石中含有1/4MS培養(yǎng)基)扦插時(shí)用保鮮膜封住，保溫保濕，放置在培養(yǎng)室中，溫度28°C，光照20001x，光照時(shí)間14h/d，催芽12天后，獲得無病毒芽，完成柑桔接穗預(yù)處理脫毒的步驟。
[0034]步驟4:當(dāng)檢測(cè)過的柑桔枝條同時(shí)受到HLB和CTV感染時(shí)，對(duì)接穗材料進(jìn)行如下藥劑脫毒處理:將枝條浸泡于含有30 — 50 μ M的TCL溶液處理Ih或者將枝條浸泡于含有0.75g/L四環(huán)素處理枝條lh。然后，扦插于經(jīng)過高壓滅菌的蛭石(蛭石中含有1/4MS培養(yǎng)基)中，扦插時(shí)用保鮮膜封住，保溫保濕，放置在培養(yǎng)室中，溫度28°C，光照20001x，光照時(shí)間14h/d，催芽12天后，完成柑桔接穗預(yù)處理脫毒的步驟。
[0035]對(duì)本發(fā)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證:
[0036](1)接穗的采集:本試驗(yàn)采用的柑桔枝桿材料為海南瓊中縣采集的優(yōu)良柑桔品種材料‘綠橙’，原始品種名為紅江橙，它是甜橙(Citrus Sinensis (L.) Osbeck與桔(C.reticulate Blanco)的嫁接嵌合體優(yōu)良品種。
[0037](2)接穗材料常規(guī)消毒處理:對(duì)實(shí)時(shí)定量RT_PCR分子檢測(cè)后，將感病的接穗材料進(jìn)行藥劑處理和催芽試驗(yàn)。每次將200枝，柑桔綠橙枝條適當(dāng)修剪，修剪去掉葉片和葉柄，每個(gè)枝條上含芽數(shù)為8-15個(gè)然后用2%的次氯酸鈉(NaClO)水溶液表面消毒5min，用自來水沖洗干凈。平均每個(gè)處理用枝條15枝(即15個(gè)重復(fù))。做兩個(gè)批次重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果取平均值。試驗(yàn)中所用圖片通過Excell軟件產(chǎn)生，標(biāo)準(zhǔn)誤差值通過統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算獲得。
[0038](3)接穗材料的藥劑處理:根據(jù)表1中的設(shè)計(jì)，本試驗(yàn)包含了 LCl:清水對(duì)照，LC2:接穗基部扦插入含有2μ M TCL的蛭石中，LC3:接穗基部扦插入含有5μΜ三氯生(TCL)的蛭石中，LC4:終濃度為30 μ M TCL浸泡處理接穗lh，LC5:50yM TCL浸泡處理接穗lh，LC6:0.75g/l四環(huán)素浸泡處理接穗lh, LC7:1.5g/l四環(huán)素浸泡接穗lh, LC8:0.75g/l青霉素浸泡lh，LC8:1.5g/l青霉素浸泡接穗Ih和50°C濕熱蒸汽處理lh。具體操作程序是:將接穗進(jìn)行表面消毒，然后，接穗在試劑中浸泡lh，扦插于經(jīng)過高壓滅菌的蛭石中。蛭石的體積為塑料盒的1/3，且用1/4MS培養(yǎng)基(含有大量元素和微量元素，無蔗糖和有機(jī)成分)拌勻，扦插后用保鮮膜封住，保溫保濕，放置在培養(yǎng)室中，溫度28°C，光照20001x，光照時(shí)間14h/d。定時(shí)檢查濕度情況。其中2 μ M和5 μ M三氯生(TCL)處理是將試劑加入到蛭石中，在催芽過程中，長時(shí)間持續(xù)處理。萌芽后材料用于嫁接和分子檢測(cè)。下表1為柑橘黃龍病Real-time PCR檢測(cè)所用引物。
[0039]表1
[0040]
【權(quán)利要求】
1.柑桔接穗預(yù)處理促使復(fù)合感染病原脫除的技術(shù)，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行: 步驟1:采集柑桔枝條，將柑桔枝條修剪去掉葉片和葉柄，用次氯酸鈉(NaCio)水溶液表面消毒； 步驟2:對(duì)表面消毒后的柑桔枝條接穗進(jìn)行分子檢測(cè)； 步驟3:當(dāng)檢測(cè)過的柑桔枝條僅受到HLB感染時(shí)，對(duì)接穗材料進(jìn)行如下藥劑脫毒處理:方法一:接穗扦插于含有2-5 μ M TCL溶液和1/4MS培養(yǎng)基的高壓滅菌的蛭石中，用保鮮膜封住，放置在培養(yǎng)室中，催芽12天后獲得無病毒芽，完成柑桔接穗預(yù)處理脫毒的步驟，莖尖材料可以用于后續(xù)的莖尖嫁接或嫩芽嫁接繁殖； 或方法二:接穗在含有30-50 μ M的TCL溶液或接穗在含有0.75-1.5g/l阿莫西林或0.75g/l四環(huán)素溶液中浸泡lh，然后，扦插于經(jīng)過高壓滅菌的蛭石中，蛭石中含有1/4MS培養(yǎng)基，扦插時(shí)用保鮮膜封住，放置在培養(yǎng)室中，催芽12天后獲得無病毒芽，完成柑桔接穗預(yù)處理脫毒的步驟； 步驟4:當(dāng)檢測(cè)過的柑桔枝條同時(shí)受到HLB和CTV感染時(shí)，對(duì)接穗材料進(jìn)行如下藥劑脫毒處理:將枝條浸泡于含有30-50 μ M的TCL溶液處理Ih或者將枝條浸泡于含有0.75g/L四環(huán)素處理枝條Ih ;然后，扦插于經(jīng)過高壓滅菌的蛭石中，蛭石中含有1/4MS培養(yǎng)基，扦插時(shí)用保鮮膜封住，放置在培養(yǎng)室中，催芽12天后獲得無病毒芽，完成柑桔接穗預(yù)處理脫毒的步驟。
2.按照權(quán)利要求1所述柑桔接穗預(yù)處理促使復(fù)合感染病原脫除的技術(shù)，其特征在于:所述步驟I中消毒采用2 %的次氯酸鈉(NaClO)水溶液對(duì)枝條表面消毒5min。
3.按照權(quán)利要求1所述柑桔接穗預(yù)處理促使復(fù)合感染病原脫除的技術(shù)，其特征在于:所述步驟3和所述步驟4中，培養(yǎng)室設(shè)定溫度28°C、光照20001x、光照時(shí)間14h/d。
【文檔編號(hào)】A01G13/00GK103891558SQ201410132037
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】姜玲, 盧銘玉 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)