專利名稱：同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要病原的一步法多重pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)分子生物領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)目前已確定有5種嫁接傳播病害，包括黃龍病，衰退病，碎葉病，裂皮病和溫州蜜柑萎縮病。由于應(yīng)用無(wú)病毒苗木，溫州蜜柑萎縮病在田間發(fā)生分布很少。柑桔衰退病是柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的一種重要病害,廣泛分布于世界各柑桔產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重威脅著世界上以酸橙為砧木的柑桔產(chǎn)區(qū)和對(duì)CTV莖陷點(diǎn)株系敏感的葡萄柚、甜橙等品種的安全。柑桔裂皮病是由柑桔裂皮病類病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd)引起的一種世界范圍的重要柑桔病害，是限制我國(guó)柑桔產(chǎn)量的一種重要的嫁接傳播性類病毒，主要為害以積、積橙和菜檬作站木的柑桔品種，弓I起站木部樹(shù)皮開(kāi)裂、植株矮化等癥狀，并導(dǎo)致病樹(shù)落花落果嚴(yán)重，枯枝多，嚴(yán)重時(shí)全株死亡。柑桔碎葉病是由柑桔碎葉病毒(Citrus tatter-leaf virus, CTLV)引起的一種柑桔病害,主要危害以積及其雜種作砧木的柑桔，我國(guó)浙江、廣東、四川和重慶等省市均有此病的發(fā)生。柑桔黃龍病(HLB) 是一種在柑桔生產(chǎn)上危害極其嚴(yán)重的類細(xì)菌病害，該病的亞洲種病原物為Candidatus liberobacter asiaticus,是我國(guó)南部柑桔產(chǎn)區(qū)的毀滅性病害,是國(guó)內(nèi)植物檢疫對(duì)象。柑桔這4種重要嫁接傳播病原物在果園中經(jīng)常以兩種或兩種以上病原混合侵染為害，危害輕者可引起樹(shù)勢(shì)衰退，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣；重者可引起成片柑桔樹(shù)的死亡，對(duì)柑桔高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重障礙。傳統(tǒng)的柑桔病毒病和類病毒病檢測(cè)方法主要以指示植物鑒定，一般采用Etrog香櫞作為指示植物鑒定CEVd，目前鑒定CTV采用墨西哥來(lái)檬和酸橙等5種指示植物，CTLV通常采用臘斯克枳橙作為指示植物進(jìn)行鑒定，雖然指示植物進(jìn)行病毒病鑒定沿用至今，但煩瑣耗時(shí)。黃龍病病原物上世紀(jì)70年代電鏡觀察為診斷黃龍病的重要手段，但電鏡的檢出率較低。目前也有檢測(cè)CTV和CTLV潰瘍病病菌的ELISA檢測(cè)方法，雖然應(yīng)用免疫學(xué)方法檢出速度快，但特異性和靈敏度相對(duì)比較差。而PCR法具有快速、靈敏和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，作為一種強(qiáng)有力的檢測(cè)工具已廣泛應(yīng)用于各種病害的檢驗(yàn)與診斷。但常規(guī)PCR技術(shù)一次只能檢測(cè)一種病原物，如果反應(yīng)體系中含有兩種以上的病原物，則需進(jìn)行多次進(jìn)行PCR，不但操作復(fù)雜，而且費(fèi)用較高。多重PCR(Multiplex PCR)是近幾年興起的一項(xiàng)新技術(shù)，該技術(shù)在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)加入多對(duì)引物，擴(kuò)增完成后可同時(shí)檢測(cè)出多種目的核酸片段，滿足同時(shí)分析不同DNA序列的需要，它具有高效快捷、高度特異敏感、降低實(shí)驗(yàn)成本、加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)程等優(yōu)點(diǎn)。目前已建立了 CTV、CEVd、CTLV的單一 RT-PCR分子檢測(cè)技術(shù)，建立了黃龍病的PCR 技術(shù)，但尚未見(jiàn)4種重要嫁接傳播病害的一步法多重PCR體系的報(bào)道。建立穩(wěn)定靈敏的同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要嫁接傳播病原一步法多重PCR檢測(cè)技術(shù)體系，有利于摸清田間4種病害發(fā)生狀況，實(shí)施柑桔多種病毒病和類病毒病的高效快速檢測(cè)，同時(shí)利于加快莖尖嫁接脫毒苗的評(píng)價(jià)，推進(jìn)引進(jìn)品種和推廣苗木的無(wú)毒化進(jìn)程，確保柑桔安全生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、靈敏、準(zhǔn)確能同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR檢測(cè)方法，適合田間樣品的大規(guī)模測(cè)定和莖尖嫁接脫毒苗的快速評(píng)價(jià)。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明選用已經(jīng)報(bào)道柑桔嫁接傳播病原的引物對(duì)，如下柑桔衰退病毒引物為上游引物5’ -ATGTCAGGCAGCTTGGGAAATT-3 ’下游引物5’ -TTCGTGTCTAAGTCRCGCTAA CA-3 ’柑桔裂皮病類病毒引物為上游引物5’ -GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3，下游引物5’ -CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3 ’柑桔碎葉病毒引物為上游引物5’-TGAAAACCTTTGCTGCCACTTCT-3’下游引物5’-TACTCTCCGAACCTGCCTCGA AA-3’黃龍病病菌引物上游引物5’ -GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3，下游引物5，-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’(RT)-PCR擴(kuò)增所需試劑如下柑桔衰退病毒引物0. 13ym0l/L，柑桔裂皮病類病毒引物0. 5ymol/L，柑桔碎葉病毒引物0· 16 μ mol/L，黃龍病病菌引物0.4ymol/L，Mg2+ 為 2. 7mmol/L, dNTP 為 O. 5mmol/L,6mM DTT，RT/Taq 酶，2 X RT-PCR Buffer，滅菌去離子水。(RT)-PCR 擴(kuò)增條件為55°C,30min ；94°C,5min ；94°C,30s ；68°C,80s ;35 個(gè)循環(huán)； 68°C,7min0本發(fā)明具體按如下步驟進(jìn)行I、總核酸提取(I)取樣、研磨由于CTV、CTLV, CEVd和韌皮部桿菌Ca. L. asiaticus在柑桔植株內(nèi)有各自的分布特點(diǎn)，在進(jìn)行多重PCR檢測(cè)時(shí)確定在柑桔植株上的取樣部位對(duì)檢測(cè)出4種病原至關(guān)重要。在柑桔植株內(nèi)韌皮部桿菌Ca. L. asiaticus在老葉中脈的全年檢出率最高； 在通過(guò)蚜蟲(chóng)以半持久性方式傳播的初侵染柑桔植株內(nèi)CTV由葉片通過(guò)維管系統(tǒng)的韌皮部篩管作長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)，因而在感病植株內(nèi)病毒的分布是從從莖頂部到莖基部逐步遞減的，特別是在柚類中CTV分布不均勻，應(yīng)用DTBIA方法檢測(cè)，在嫩皮和嫩葉檢測(cè)率相對(duì)較高；CTLV 和CEVd在皮和葉均可作為取樣部位。因此檢測(cè)時(shí)應(yīng)取柑桔植株近基部老葉中脈，同時(shí)要取嫩葉的中脈或嫩皮，從同一植株的不同方位取樣，每個(gè)樣品重復(fù)抽提3次，這樣可以降低這 4種病原的漏檢率，提高檢測(cè)的可靠性。取10-15mg皮或葉脈于無(wú)菌eppendorf管,液氮研磨；(2)依次加入60 μ L TES緩沖液和60 μ L飽和酚氯仿異戊醇(25 : 24 : I)， 混勻，
(3) 7CTC水浴 5-10min, 12000rpm 離心 5min，(4)吸取40 μ L上清液由Sephadex G-50-80層析柱中，5000rpm離心4min,收集洗脫液，_20°C保存。上述層析柱制備為加少量TNE平衡的玻璃珠到O. 5mL的Eppendorf管底(先用燒紅的細(xì)針頭在最底部打孔)再將此管放入2mL離心管中，并向O. 5mL的Eppendorf管內(nèi)加滿用 TNE 飽和的 Sephdex G-50, 5000rpm,離心 3min,取出 O. 5mL 的 Eppendorf 管置入 I. 5mL 的Eppendorf管中即可制成。2、(RT)-PCR 擴(kuò)增將I μ L總核酸提取液在94°C變性，冰水浴2min后，加入RT-PCR擴(kuò)增所需試劑，利用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。(RT) -PCR 擴(kuò)增所需體系如下2 X RT-PCR Buffer 液 5 μ L，dNTP O. 3 μ L, DTT O. 6yL, MgSO4O. 3 μ L, RT/Taq酶O. 4 μ L，正向引物混合液0. 715 μ L，反向引物混合液 O. 715 μ L,用滅菌去離子水補(bǔ)足體積至10 μ L。體系中含各病原引物終濃度如下柑桔衰退病毒引物0. 13ymol/L，柑桔裂皮病類病毒引物0. 5μπι01/1，柑桔碎葉病毒引物0. 16μπι01/1，黃龍病病菌引物0.4μπιΟ1/ L,內(nèi)參泛素基因引物0. 24 μ mol/L。(RT)-PCR 擴(kuò)增條件為55°C,30min ；94°C,5min ；94°C,30s ；68°C,80s ;35 個(gè)循環(huán)； 68°C,7min ；3、PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)取5 μ LPCR產(chǎn)物與3 μ L染料相混合，在室溫下進(jìn)行I. 5%水平瓊脂糖恒壓凝膠電泳。電泳條件為初始電壓150V，5min ;后續(xù)電壓100V，30min。電泳完畢后EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)電泳結(jié)果。4、電泳結(jié)果分析柑桔裳退病毒引物、柑桔裂皮病類病毒、柑桔碎葉病毒和黃龍病病菌分別擴(kuò)增出 511bp、371bp、309bp和1160bp的片段，及內(nèi)參基因194bp，與分別用單一的引物擴(kuò)增的序列大小相符合，見(jiàn)附圖I。對(duì)PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒分別切膠回收，純化產(chǎn)物經(jīng)過(guò)測(cè)序預(yù)處理后,送基因公司測(cè)序，使用NCBI的BLAST登錄序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，均為特異基因片段。5、多重(RT)-PCR靈敏度的測(cè)試分別用超純水10倍梯度稀釋總核酸模板，各取I μ L作模板檢測(cè)(RT)-PCR的靈敏度，結(jié)果顯示可以從稀釋10倍的總核酸中擴(kuò)增出CEV，可以從稀釋IO2倍的總核酸中擴(kuò)增出CTV，多重PCR與單一 PCR具有相同的檢測(cè)靈敏度。測(cè)試模板為柑桔衰退病毒和柑桔裂皮病毒結(jié)果顯示模板稀釋10倍均可擴(kuò)增出特異性片段，見(jiàn)附圖2。有益效果本發(fā)明能同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要嫁接傳播病原，快速準(zhǔn)確，避免了常規(guī) PCR的重復(fù)檢測(cè)。檢測(cè)的穩(wěn)定性好，特異性強(qiáng)，一致性高，適用于大規(guī)模推廣，實(shí)現(xiàn)了柑桔多種病毒病和類病毒病的高效快速檢測(cè)，有利于摸清田間4種病害發(fā)生狀況，同時(shí)利于加快莖尖嫁接脫毒苗的評(píng)價(jià)，推進(jìn)引進(jìn)品種和推廣苗木的無(wú)毒化進(jìn)程，確保柑桔安全生產(chǎn)。


圖I為一步法多重PCR電泳圖譜。M100bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :4種病原核酸抽提混合液；2 :黃龍病病菌；3 :柑桔裳退病毒；4 :柑桔裂皮病類病毒；5 :柑桔碎葉病毒；6 :陰性對(duì)照。圖2為多重PCR靈敏度測(cè)試分析的電泳圖譜。M IOObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1_4 10
倍梯度稀釋。圖3為隨機(jī)采取的田間樣品進(jìn)行多重PCR電泳圖譜。M :IOObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； I :4種病原核酸抽提混合液；15 :陰性對(duì)照；16 :水對(duì)照，其余為隨機(jī)采取的田間樣品。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR檢測(cè)方法如下I、核酸提取(I)從江西、云南、湖南、浙江、重慶、廣東、廣西等地方采摘的柑桔樣品，隨機(jī)選取了 13種樣品，每樣取10-15mg皮和葉脈于無(wú)菌eppendorf管,液氮研磨；(2)依次加入60 μ L TES緩沖液和60 μ L飽和酚氯仿異戊醇(25 : 24 : I)， 混勻，(3) 7CTC 水浴 8min, 12000rpm 離心 5min，(4)吸取40 μ L上清液由Sephadex G-50-80層析柱中，5000rpm離心4min,收集洗脫液，_20°C保存。上述層析柱制備為加少量TNE平衡的玻璃珠到O. 5mL的Eppendorf管底(先用燒紅的細(xì)針頭在最底部打孔)再將此管放入2mL離心管中，并向O. 5mL的Eppendorf管內(nèi)加滿用 TNE 飽和的 Sephdex G-50, 5000rpm,離心 3min,取出 O. 5mL 的 Eppendorf 管置入 I. 5mL 的Eppendorf管中即可制成。2、(RT)-PCR 擴(kuò)增將I μ L總核酸提取液在94°C變性，冰水浴2min后，加入RT-PCR擴(kuò)增所需試劑，利用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。(RT)-PCR擴(kuò)增所需體系如下柑桔衰退病毒引物0. 13ymol/L，柑桔裂皮病類病毒引物0. 5ymol/L，柑桔碎葉病毒引物0. 16 μ mol/L，黃龍病病菌引物0. 4ymol/L，內(nèi)參基因引物0. 24 μ mol/L, Mg2+ 為 2. 7mmol/L,dNTP 為 0. 5mmol/L,DTT 6mM,2XPCR buffer 5. 0 μ L, RT/Taq為0. 4 μ L,用滅菌去離子水補(bǔ)足體積至10 μ L。(RT)-PCR 擴(kuò)增條件為55°C,30min ；94°C,5min ；94°C,30s ；68°C,80s ;35 個(gè)循環(huán)； 68°C,7min ；3、PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)取5μ L PCR產(chǎn)物與3 μ L染料相混合，在室溫下進(jìn)行I. 5%水平瓊脂糖恒壓凝膠電泳。電泳條件為初始電壓150V，5min ;后續(xù)電壓100V，30min。電泳完畢后EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)電泳結(jié)果，見(jiàn)附圖3。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要病原的一步法多重PCR檢測(cè)方法，4種重要嫁接傳播病原包括柑桔裳退病毒，柑桔裂皮病類病毒，柑桔碎葉病毒，柑桔黃龍病菌，其特征在于提取柑桔樣品總核酸，選用4種病原的特異引物，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行(RT)-PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)計(jì)了泛素基因引物序列，體系中設(shè)置了泛素基因作為內(nèi)參基因，最后電泳鑒定1)根據(jù)泛素基因保守序列區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物UBQ-F: GATCTTCGCCTTAACGTTGTCAAT， UBQ-R GTTGATTTTTGCTGGGAAGCA,作為內(nèi)參基因，2)所述(RT)-PCR擴(kuò)增所需試劑如下柑桔衰退病毒引物0.13μπι01/1，柑桔裂皮病類病毒引物0. 5ymol/L，柑桔碎葉病毒引物0. 16 μ mol/L，黃龍病病菌引物0. 4ymol/L， 內(nèi)參泛素基因引物0. 24 μ mol/L, Mg2+為 2. 7mmol/L, dNTP 為 O. 5mmol/L,6mM DTT，RT/Taq 酶，2 X RT-PCR Buffer，滅菌去離子水。(RT) -PCR 擴(kuò)增條件為55 °C，30min ；94 °C，5min ；94 °C，30s ；68 °C，80s ;35 個(gè)循環(huán)； 68°C,7min0
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR 檢測(cè)方法，其特征在與所述提取樣品總核酸，樣品不僅取柑桔植株近基部老葉中脈，同時(shí)還應(yīng)取嫩葉的中脈或嫩皮，并且同一植株的不同方位取樣。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR 檢測(cè)方法，其特征在于所述柑桔衰退病毒引物為上游引物5’ -ATGTCAGGCAGCTTGGGAAATT-3’下游引物5’ -TTCGTGTCTAAGTCRCGCTAA CA-3’所述柑桔裂皮病類病毒引物為上游引物5’ -GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3，下游引物5’ -CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3’所述柑桔碎葉病毒引物為上游引物5 ’ -TGAAAACCTTTGCTGCCACTTCT-3，下游引物5’ -TACTCTCCGAACCTGCCTCGA AA-3’所述黃龍病病菌引物上游引物5 ’ -GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3，下游引物5’ -GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的一種同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要嫁接傳播病原的一步法多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于電泳得到的特異性片段大小為柑桔衰退病毒為511bp，柑桔裂皮病類病毒為371bp，柑桔碎葉病毒為309bp，柑桔黃龍病菌為1160bp，內(nèi)參泛素基因?yàn)?194bp0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要病原的一步法多重PCR檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)4種重要嫁接傳播病原柑桔衰退病毒，柑桔裂皮病類病毒，柑桔碎葉病毒，柑桔黃龍病菌的引物優(yōu)選，以及對(duì)引物濃度，PCR擴(kuò)增條件等的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)柑桔4種重要嫁接傳播病原。本發(fā)明檢測(cè)方法快速準(zhǔn)確，避免了常規(guī)PCR的重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)的穩(wěn)定性好，特異性強(qiáng)，一致性高，適用于大規(guī)模推廣，可以用于指導(dǎo)引進(jìn)品種和推廣苗木的無(wú)毒化，確保柑桔安全生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102586481SQ20121004601
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者劉金香, 周常勇, 唐科志, 李中安, 王雪峰 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所